Name: Monitoreo de las interacciones de GPCR--arrestin1/2 en sistemas de vida en tiempo real para acelerar el descubrimiento de fármacos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprende a monitorear interacciones GPCR-arrestina en células vivas mediante ensayo de complementación estructural. Este método versátil acelera el descubrimiento de fármacos de primera clase con efectos secundarios mínimos.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación (NRF- 2015M3A9E7029172) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura.

1. Estrategia de diseño de primer
<ol><li>Imprimaciones de diseño para introducir genes de interés en pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] y pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectores.</li>
	<li>Seleccione al menos uno de estos tres sitios como una de las dos enzimas de restricción únicas necesarias para la clonación direccional debido a la presencia de un codón de parada en trama que divide el sitio de multicloning como se muestra en la Figura 111.</li>
	<li>Incorporar la secuencia de nucleótidos en las imprimaciones como se muestra en la Tabla 1 para codificar los residuos del vinculador mostrados en rojo en la Tabla 211.</li>
	<li>Para los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y pBiT2.1-C [TK/SmBiT], asegúrese de que la imprimación de 5o contiene un codón ATG y una potente secuencia de consenso Kozak (GCCGCCACC).</li>
	<li>Para los vectores pBiT1.1-N [TK/LgBiT] y pBiT2.1-N [TK/SmBiT], asegúrese de que la imprimación de 3o contenga un codón de detención. NOTA: Cada vector contiene el promotor HSV-TK para minimizar la asociación inespecífica y reducir los artefactos experimentales, también cada vector tiene un casete de expresión para la resistencia a la ampicilina en bacterias.</li>
</ol>2. PCR
<ol><li>Configure y ejecute reacciones de PCR para amplificar el ADN de inserción del gen de interés utilizando las imprimaciones diseñadas a partir del paso 1. Es importante utilizar una polimerasa de ADN de alta fidelidad para minimizar las mutaciones.</li>
	<li>Utilice exactamente el siguiente orden para preparar 50 sL de reacción PCR. Añadir 35,5 l de agua destilada, 5 l de tampón de polimerasa de 10x, 5 l de mezcla dNTP (2,5 ml cada uno), 1 l de plantilla de plásmido (200 ng/L), 1,25 l de imprimaciones delanteras y inversas (10 m) y 1 l de alta fidelidad de polímero (5 U/L).</li>
	<li>Usando un termociclador configurar el siguiente programa de amplificación de ADN.<ol>
<li>Desnaturalidad a 95oC durante 5 min.</li>
		<li>Repetir 25 veces el siguiente ciclo térmico: 95 oC para 30 s, 60 oC durante 1 min, 72 oC durante 2 min por 1 kbp para ser amplificado.</li>
		<li>Ejecuta una extensión final a 72oC durante 10 min.</li>
		<li>Sujete las muestras a 4oC dentro del termociclador. NOTA: Se recomienda utilizar una polimerasa de alta fidelidad para minimizar las mutaciones puntuales, especialmente las que se producen durante la amplificación de secuencias largas. A medida que el amplificador se hace más largo, el grado de precisión en la replicación del ADN disminuye. Para la reacción PCR, elija la temperatura de recocido basada en la temperatura de fusión de la región donde los oligos se hibridan directamente con la plantilla de ADN y no con toda la secuencia de la imprimación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificación de productos PCR<ol>
<li>Aísle el producto PCR del resto de la reacción pcR utilizando un kit de un fabricante de preferencia12. El producto PCR ya está listo para la digestión de restricciones.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Digestión del ADN
<ol><li>Para la digestión del producto PCR, prepare 50 ml de reacción de digestión de la siguiente manera.<ol>
<li>Con un tubo de 1,5 ml, añadir 12 ml de agua destilada.</li>
		<li>Añadir 5 l de tampón de 10x con la mejor compatibilidad con ambas enzimas de restricción.</li>
		<li>A partir del paso 2.4 añadir 30 l de producto PCR</li>
		<li>Por último, agregue 1,5 l de cada enzima de restricción.</li>
		<li>Mezclar brevemente por vórtice e incubar a 37,5 oC durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para el plásmido receptor, prepare 50 ml de reacción de digestión de la siguiente manera:<ol>
<li>Con un tubo de 1,5 ml, añadir 23 ml de agua destilada.</li>
		<li>Añadir 5 l de tampón de 10x con la mejor compatibilidad con ambas enzimas de restricción.</li>
		<li>Añadir 15 ml de plásmido receptor (200 ng/L).</li>
		<li>Añadir 1,5 ml de cada enzima de restricción.</li>
		<li>Mezclar brevemente por vórtice e incubar a 37,5 oC durante la noche. NOTA: Es importante utilizar 3 g de plásmido receptor para obtener material suficiente después de la purificación del gel de agarosa de ADN. También es relevante dejar las digestiones del ADN durante la noche utilizando ambas enzimas para obtener una alta eficiencia de clonación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Purificación y clonación de gel de agarosa de ADN
<ol><li>Preparar un gel de agarosa del 1% para ejecutar el plásmido de ADN digerido e inserciones y proceder a cortar las bandas correspondientes. Una vez purificado el vector correspondiente y las bandas de inserción12, determine la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro.</li>
	<li>Realice la ligadura de ADN para fusionar el inserto con el plásmido receptor.</li>
	<li>Preparar reacciones de ligadura de alrededor de 100 ng de ADN total incluyendo 50 ng de vector plásmido.</li>
	<li>Configurar la relación plásmido-inserción del recipiente de aproximadamente 1:3; se puede calcular utilizando una calculadora de inserción vectorial13.</li>
	<li>Configure controles negativos en paralelo. Por ejemplo, una ligadura del ADN plásmido receptor sin ningún inserto proporcionará información sobre cuánto fondo de plásmido receptor no digerido o autoligante está presente.</li>
</ol>5. Transformación de clones
<ol><li>Colocar un tubo de células competentes de DH5 desde el congelador a -80 oC y transferirlo inmediatamente sobre hielo durante 20 minutos.</li>
	<li>Después de ese tiempo, tomar 55 sl de células competentes de DH5 y añadir 4 l de reacción de ligadura y mezclar moviendo el tubo y almacenar en hielo durante 45 min.</li>
	<li>Colocar el tubo en un baño de agua previamente calentado a 42 oC durante exactamente 48 s e inmediatamente volver a poner los tubos en hielo durante otros 3 minutos.</li>
	<li>Añadir 600 l de caldo de luria (LB) medio previamente calentado a 37,5 oC e incubar con agitación durante 1 hora a 200 rpm.</li>
	<li>Transfiera 200 ml a una placa de agar que contenga ampicilina 100 g/ml y se extienda suavemente sobre la superficie con el líquido se absorbe principalmente.</li>
	<li>Incubar las placas durante la noche para ver las colonias a la mañana siguiente. El plásmido receptor en la placa de inserción debe tener significativamente más colonias que la placa sola del plásmido receptor.</li>
</ol>6. Aislamiento del plásmido terminado
<ol><li>Recoger 3-10 colonias bacterianas individuales y transferirlas a 1 ml de medio LB que contenga ampicilina (100 g/ml) e incubar durante 6 h.</li>
	<li>Tomar 200 ml de suspensión bacteriana y transferirlo a 5 ml de medio LB que contenga la misma concentración de ampicilina que en el paso 6.1 e incubar durante la noche a 37,5 oC con agitación a 200 rpm.</li>
	<li>Usando una purificación de kit de ADN miniprep, realice purificaciones de ADN miniprep utilizando 5 ml de LB cultivado durante la noche siguiendo las instrucciones del fabricante14.</li>
	<li>Para identificar las ligaduras exitosas, configure las reacciones de PCR de la misma manera que en la sección 2 utilizando el ADN obtenido del paso 6.3 como plantilla con las mismas imprimaciones que en la sección 2 durante la primera PCR. Los clones positivos producirán productos DE PCR con el tamaño correspondiente.</li>
	<li>Después de una gran purificación de ADN de preparación de los clones positivos, llevar a cabo una digestión de restricción diagnóstica de 500 ng de ADN purificado con las enzimas utilizadas durante el paso de clonación y ejecutar los productos digeridos en un gel de agarosa del 1%. Debe haber dos bandas: una del tamaño del vector y otra del tamaño de la nueva plaquita.</li>
	<li>Verifique la secuencia de construcción mediante la secuenciación utilizando los siguientes imprimadores: Forward 5'- aaggtgacgcgtgtagcccctcgaac-3' y reverse 5'-gcatttttttcactgcattctagtt-3'. NOTA: Cuando el ADN se replica mediante PCR, siempre existe la posibilidad de errores durante la amplificación, incluso cuando se utiliza una polimerasa de alta fidelidad, por lo tanto es muy importante secuenciar las construcciones finales.</li>
</ol>7. Transfección y expresión proteica
<ol><li>En una placa de pozo blanca 96 previamente recubierta de poli-L-lisina, realice la sembración celular un día antes de la transfección a 2,5 x 104 células por pocto utilizando el medio modificado de Eagle de Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U/ml penicilina G, y 100 g/ mL estreptomicina.</li>
	<li>Utilice sólo los 60 pozos interiores para minimizar el potencial de gradientes térmicos a través de la placa y los efectos de borde de evaporación. Añadir 200 l de agua destilada estéril a los 36 pozos exteriores y 150 l en los espacios entre pozose incubar durante la noche a 37,5oC y el 5% de CO2.</li>
	<li>A la mañana siguiente realizar la transfección utilizando 100 ng de ADN total (50 ng cada construcción).</li>
	<li>Configure cuatro combinaciones de plásmidos diferentes (receptor:-arrestin) de acuerdo con la Figura 2b.</li>
	<li>Para cada combinación de plásmidos, utilice 20 ml de medios esenciales mínimos de Eagle modificados almacenados en búfer con HEPES utilizando 0,3 ml de reactivo de transfección lipídica por poca.</li>
	<li>Añadir 20 ml de mezcla lipidic de reactivo-ADN de transfección a cada pocto y mezclar la placa en círculos durante 10 s.</li>
	<li>Cambiar el medio fresco después de 6 horas de incubación a 37,5oC y 5% de CO2.</li>
	<li>Incubar la placa durante 24 h a 37,5oC y 5%co2.</li>
</ol>8. Monitoreo de las interacciones entre el receptor y la arrestina 1/2 en las células HEK293
<ol><li>Aspirar el medio y añadir 100 l de medios esenciales mínimos de Eagle modificado sin búfer con HEPES a cada poca y dejar que la placa se estabilice en RT durante 10 min.</li>
	<li>Preparar el sustrato de furimazine combinando 1 volumen de 100x de sustrato con 19 volúmenes de LCS Dilution Buffer (una dilución de 20 veces)11,creando un stock de 5x para mezclar con el medio de cultivo celular.</li>
	<li>Añadir 25 s de furimazine 5x a cada pocto y mezclar suavemente en círculos durante 10 s.</li>
	<li>Mida la luminiscencia durante 10 min para la estabilización de la señal en RT. NOTA: Al utilizar esta señal de línea base para normalizar la respuesta de cada pozo, ayudará a reducir la variabilidad causada por las diferencias en el número de células chapadas por pozo, también las diferencias en la eficiencia de la transfección, etc. Una vez calculada, promediar la respuesta normalizada de los pozos de réplica para un tratamiento farmacológico dado.</li>
	<li>Prepare la solución de ligando 13.5x en los medios esenciales mínimos de Eagle modificados almacenados en búfer con HEPES.</li>
	<li>Para experimentos a temperatura ambiente con 10 sl de adición de ligandos de 13,5x, agregue los compuestos utilizando inyectores o una pipeta multicanal y mezcle la placa a mano o utilizando un agitador orbital (20 s a 200 rpm).</li>
	<li>Para experimentos a 37,5 oC con 10 oC de adición de ligandos de 13,5x, utilice inyectores para dispensar compuestos y mezcle utilizando el agitador orbital del instrumento. En caso de no utilizar inyectores, retire la placa del luminómetro, añada los ligandos y mezcle la placa a mano o utilizando un agitador orbital (20 s a 200 rpm). NOTA: Utilice inyectores y una coctelera dentro del instrumento de detección para minimizar las fluctuaciones de temperatura asociadas con la extracción de la placa del luminómetro. Para este ensayo se pueden utilizar luminómetros de sobremesa estándar. Utilice un tiempo de integración de 0,25–2 s.</li>
</ol>

<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCRs+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+GPCR+drug+discovery%3A+new+agents%2C+targets+and+indications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li>
<li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pharmacology+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li>
<li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li>
<li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li>
<li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+%CE%B2-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li>
<li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li>
<li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+signalling%3A+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li>
<li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+signatures+in+%CE%B2-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nanobit+Protein+Protein+Interaction+System+Protocol%22">Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22HiYield+Gel%2FPCR+Fragments+Extraction+Kit%22">HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit</a>. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).</li>
<li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Ligation+Calculator%22">Ligation Calculator</a>. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cosmo+Genetech%22">Cosmo Genetech</a>. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS=
 (2019).</li>
<li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+incretins%3A+GLP-1+and+GIP%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li>
<li>ProMega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NanoGLO+Endurazine+and+Vivazine+Live+Cell+Substrates+Technical+Manual%22">NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses en competencia.

Usando el método que se presenta aquí, las interacciones entre cualquier GPCR y el valor 1/2 se pueden monitorear en sistemas vivos en tiempo real utilizando este ensayo de complementación estructural de GPCR--arrestin. En este sentido, pudimos observar el reclutamiento diferencial de arrestina entre las dos isoformas de arrestina por el GLP-1r (Un prototípico clase B GPCR), también observamos una disociación del complejo del receptor---arrestin a los pocos minutos después de alcanzar el máximo señal luminiscente.
<p...

Los GPCR representan el objetivo de casi el 35% de los fármacos actuales en el mercado1,2 y una comprensión clara de su farmacología es crucial en el desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos3. Uno de los aspectos clave en el descubrimiento de fármacos GPCR, particularmente durante el desarrollo de agonistas sesgados es la caracterización de nuevos ligandos hacia las interacciones entre receptores y arrestinas4 y las interacciones de arrestina con otras proteínas citosólicas, tales como como clathrin5.
Se ha documentado que la señalización dependiente de la arrestina desempeña un papel clave en los trastornos neurológicos como el trastorno bipolar, la depresión mayor y la esquizofrenia6 y también los efectos secundarios graves en algunos medicamentos como la morfina7.
Los métodos actuales utilizados para monitorear estas interacciones generalmente no representan los niveles endógenos reales de las proteínas en estudio, en algunos casos muestran señal débil, fotoblanqueo y dependiendo del GPCR podría ser técnicamente difícil configurar8. Este novedoso ensayo de complementación estructural utiliza vectores promotores de baja expresiónpara imitar los niveles fisiológicos endógenos y proporciona una alta sensibilidad en comparación con los métodos actuales 9. Usando este enfoque, fue posible caracterizar fácilmente las interacciones de Galanin receptor---arrestin1/2 y también de la arlatina10. Esta metodología puede ser ampliamente utilizada para cualquier GPCR de particular interés donde las arrestinas juegan una función fisiológica clave o su señalización es relevante en algunas enfermedades.

<table><tbody><tr><td>Antibióticos penicilina estreptomicina</td><td>Welgene</td><td>LS202-02</td><td>Penicilina/estreptomicina</td></tr><tr><td>Incubadora bacteriana</td><td>JEIO Tech</td><td>IB-05G</td><td>Incubadora (Air-Jacket), básica</td></tr><tr><td>Medio de cultivo celular</td><td>Welgene</td><td>LM 001-05</td><td>DMEM Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Medio de transfección de cultivo celular</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Optimem 1X medio</td></tr> <tr>de cultivo celular<td>Incubadora de CO2</td><td>NUAIRE</td><td>NU5720</td><td>Incubadora de CO2 de calor</td></tr><tr><td>directo Baño de agua digital</td><td>Lab Tech</td><td>LWB-122D</td><td>Baño de agua digital técnica de laboratorio</td></tr><tr><td>Lectura de pruebas de ADN polimerasa</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1011</td><td>PfU Polimerasa</td></tr> de <tr><td>ADN kit de purificación de ADN</td><td>Cosmogenetech</td><td>CMP0112</td><td>miniprepLaboPass Purificartion Kit de purificación Mini</td></tr><tr><td>ADN Mini ADN Taq Polimerasa</td><td>Enzinomía</td><td>P750</td><td>nTaq ADN polimerasa</td></tr><tr><td>Restricción enzimática BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>BglII</td></tr><tr><td>Tampón de restricción enzimática</td><td>New England Biolabs</td><td>B72045</td><td>CutSmart 10X Tampón</td></tr><tr><td>Restricción enzimática EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>EcoRI-HF</td></tr><tr><td>Restricción enzimática NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R01315</td><td>NheI</td></tr><tr><td>Restricción enzimática XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>XhoI</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco Canadá</td><td>12483020</td><td>Suero fetal bovino</td></tr><tr><td>Gel/PCR DNA MiniKit</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>KH23108</td><td>HiYield Gel/PCR DNA</td></tr><tr><td>MiniKit Ligasa</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1025</td><td>T4 DNA Ligase</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>óptico Olympus</td><td></td><td>Microscopio CKX53SF CKX53 Reactivo</td></tr> de <tr><td>transfección lipídica</td><td>Olympus Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Luminómetro Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td></td><td>Biotek/Fisher Scientific</td><td>12504386</td><td>Synergy 2 Lectores de microplacas multimodo</td></tr><tr><td>Sistema NanoBiT</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td></tr><tr><td>Sustrato de nanoluciferasa</td><td>Promega</td><td>N2012</td><td>Nano-Glo Sistema de ensayo de células vivas</td></tr><tr><td>PCR Termociclador</td><td>Eppendorf</td><td>6336000015</td><td>Maestro ciclador Nexus SX1</td></tr><tr><td>Poly-L-lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Solución de poli-L-lisina</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Trysin EDTA 10X</td></tr><tr><td>Cultivo de glóbulos blancos Placas de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3917</td><td>Placa de ensayo Placa de 96 pocillos</td></tr></tbody></table>

monitoreo de las interacciones de gpcr--arrestin1/2 en sistemas de vida en tiempo real para acelerar el descubrimiento de fármacos

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Las interacciones entre los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) y las arrestinas son procesos vitales con implicaciones fisiológicas de gran importancia. En la actualidad, la caracterización de nuevos fármacos hacia sus interacciones con las arrestinas y otras proteínas citosólicas es extremadamente valiosa en el campo del descubrimiento de fármacos GPCR, especialmente durante el estudio del agonismo sesgado GPCR. Aquí, mostramos la aplicación de un nuevo ensayo de complementación estructural para monitorear con precisión las interacciones de receptores--arrestin en sistemas vivos en tiempo real. Este método es simple, preciso y se puede extender fácilmente a cualquier GPCR de interés y también tiene la ventaja de que supera interacciones inespecíficas debido a la presencia de un promotor de baja expresión presente en cada sistema vectorial. Este ensayo de complemento estructural proporciona características clave que permiten un seguimiento preciso y preciso de las interacciones entre receptores y arrestina, por lo que es adecuado en el estudio del agonismo sesgado de cualquier sistema GPCR, así como de la "fosforilación" de GPCR c-terminus, por lo que es adecuado en el estudio del agonismo sesgado de cualquier sistema GPCR, así como de la c-terminusción GPCR códigos' escritos por diferentes GPCR-kinases (GRKs) y modificaciones post-traduccionales de arrestinas que estabilizan o desestabilizan el complejo de receptores-arrestina.

Mediante el procedimiento que se presenta aquí, se supervisaron las interacciones entre un GPCR prototípico y dos isoformas de arrestina. Las construcciones de glucagón como el receptor de péptidos (GLP-1r) se hicieron utilizando imprimaciones que contenían sitios de restricción de enzimas NheI y EcoRI y se clonaron en los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mientras que en el caso de los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mientras que en el caso de los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y p...

Las interacciones de gpCR-arrestin son un campo emergente en el descubrimiento de fármacos GPCR. Se utilizan métodos precisos, precisos y fáciles de configurar para supervisar dichas interacciones en los sistemas vivos. Mostramos un ensayo de complemento estructural para monitorear las interacciones de la captura de GPCR en células vivas en tiempo real, y se puede extender a cualquier GPCR.

Monitoreo de las interacciones de GPCR--arrestin1/2 en sistemas de vida en tiempo real para acelerar el descubrimiento de fármacos

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Este protocolo tiene un alto impacto en el campo del descubrimiento y desarrollo de fármacos, especialmente en el desarrollo de nuevos fármacos de primera clase con efectos secundarios mínimos. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar a cualquier sistema GPCR, y se utiliza para obtener información precisa sobre la farmacología de los receptores en sistemas de vida en tiempo real. Las implicaciones de esta técnica están estrechamente relacionadas con nuevas terapias, especialmente cuando las beta-arrestinas son relevantes.Estos incluyen receptores opioados en el dolor y receptores de dopamina en la esquizofrenia. Este método puede ser útil en muchas áreas de investigación científica médica desde la neurología hasta la enfermedad cardiopulmonar. La demostración PCR de nuestro método es importante, ya que permite una presentación detallada de los pasos críticos en el protocolo, que no serían posibles con la publicación convencional.Comience diseñando imprimaciones para introducir genes de interés para los vectores pBiT. Debido al codón de parada en estructura que divide el sitio de clonación múltiple, seleccione al menos uno de los tres sitios como una de las dos enzimas de restricción únicas necesarias para la clonación direccional. Consulte el manuscrito para ver las secuencias de nucleótidos para codificar los residuos del vinculador e incorporarlos a las imprimaciones.Para el pBiT1.1-C y pBiT2.1-C asegúrese de que la imprimación delantera contiene un codón ATG y una potente secuencia de consenso Kozak. Para el pBiT1.1-N y pBiT2.1-N asegúrese de que la imprimación inversa contiene un codón de parada. Utilice las imprimaciones diseñadas para amplificar el ADN de inserción del gen de interés.Combine los reactivos PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, asegurándose de utilizar una polimerasa de ADN de alta fidelidad para minimizar las mutaciones. Programe el termociclador e inicie la reacción. Después de completar la PCR, digiere el producto en una reacción de digestión de 50 microlitros.En un tubo de 1,5 mililitros, combine 12 microlitros de agua destilada, cinco microlitros del tampón de digestión de restricción 10X apropiado y 30 microlitros del producto PCR. A continuación, agregue 1,5 microlitros de cada enzima de restricción. Vórtice la mezcla de reacción.Y incubar durante la noche a 37,5 grados centígrados. Preparar una segunda reacción para digerir el plásmido receptor. En un tubo de 1,5 mililitros, combine 23 microlitros de agua, cinco microlitros del tampón de digestión de restricción 10X apropiado, 15 microlitros del plásmido receptor y 1,5 microlitros de cada enzima de restricción.Mezcle brevemente el tubo. Y incubar durante la noche a 37,5 grados centígrados. Al día siguiente de la clonación y transformación, elija de tres a 10 colonias bacterianas individuales y transfieralas a un mililitro de medio LB con ampicilina.Incubar las células durante seis horas. Y luego transferir 200 microlitros de suspensión bacteriana a cinco mililitros de nuevo LB medio con ampicilina. Incubar el cultivo a 37,5 grados centígrados con temblores a 200 rpm durante la noche.Al día siguiente, aísle el plásmido con un kit de purificación de ADN de mini-prep. A prueba el plásmido purificado para una ligadura exitosa con PCR. Un día antes de la transfección, sembrar las células en una placa de 96 pocillos recubierta de poli-L-lisina usando el medio modificado de eagle de Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal, 100 unidades por mililitro de penicilina G y 100 microlitros por mililitro de estreptomicina.Sólo agregue células a los 60 pozos interiores para minimizar el potencial de gradientes térmicos a través de la placa y los efectos de borde de la evaporación. Añadir 200 microlitros de agua destilada estéril a los 36 pozos exteriores, y 150 microlitros en los espacios entre los pozos. Luego incubar la placa durante la noche a 37,5 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono.Al día siguiente, realice la transfección utilizando un total de 100 nanogramos de ADN. Configure cuatro combinaciones diferentes de plásmido según las instrucciones del manuscrito. Usando 20 microlitros de medios esenciales mínimos modificados de Eagle amortiguados con HEPES, y 0,3 microlitros de reactivo de transfección lipídica por pozo.Añadir 20 microlitros de reactivo de transfección lipídica y mezcla de ADN a cada pocólite, y mezclar la placa en círculos durante 10 segundos. Incubar la placa a 37,5 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Actualice el medio.Y incubar otras 24 horas. Después de la incubación, aspirar el medio y añadir 100 microlitros de medios esenciales mínimos modificados de Eagle amortiguados con HEPES a cada pocóteo. Deje que la placa se estabilice a temperatura ambiente durante 10 minutos.Mientras tanto, preparar el sustrato de furimazina combinando un volumen del sustrato 100X con 19 volúmenes de tampón de dilución LCS, creando un stock 5X para mezclar con el medio de cultivo celular. Cuando las células estén listas, agregue 25 microlitros del caldo a cada pozo y mezcle suavemente la placa durante 10 segundos. A continuación, mida la luminiscencia durante 10 minutos a temperatura ambiente para la estabilización de la señal.Para experimentos con la adición de ligandos, prepare la solución de ligando 13.5X en medios esenciales mínimos de Eagle modificados almacenados en búfer con HEPES, y agregue 10 microlitros por pozo usando una pipeta multicanal. A continuación, mezcle la placa a mano o con un agitador orbital. Este protocolo se ha utilizado con éxito para estudiar las interacciones entre un GPCR prototípico y dos isoformas beta-arrestin.Se proyectaron cuatro combinaciones diferentes de plásmido, y la que tenía la señal luminiscente más alta fue seleccionada para otros experimentos. Los valores EC50 para cada isoforma beta-arrestin se determinaron utilizando curvas de dosis-respuesta, que se obtuvieron de la respuesta máxima de cada concentración de estudios cinéticos. Es fundamental prestar especial atención al diseñar las imprimaciones PCR.El desarrollo de las construcciones adecuadas es esencial para el éxito de estos ensayos. Siguiendo esta metodología, usted será capaz de monitorear las interacciones receptor-beta-arrestin, así como las interacciones de los receptores con otras proteínas citosólicas. Esta metodología ayudará a responder preguntas fundamentales en el campo de la farmacología GPCR mediante el estudio de cómo las interacciones GPCR-beta-arrestin pueden ser moduladas por modificaciones en la estructura del ligando.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

El ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia que aquí se describe es un sistema de cribado de la farmacología inversa medio de rendimiento para la identificación de ligando funcionalmente la activación (s) de G receptores acoplados a proteínas huérfanas (GPCRs).

Caracterización de G receptores acoplados a proteína por un ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia

El tráfico del receptor modula la señalización celular y la capacidad de respuesta a ligandos y es, en sí, que responda a las condiciones celulares, incluyendo la señalización inducida por ligando. A continuación, describimos una técnica poderosa y flexible para evaluar cuantitativamente el tráfico del receptor inducida por fármacos usando immunolabeling y análisis colocalizational.

Seguimiento de cambios inducidos por fármacos en los receptores post-internalización Trata de Análisis Colocalizational

Los métodos sencillos para detectar la activación selectiva de proteínas G por receptores acoplados a proteínas G siguen siendo un desafío pendiente en la señalización celular. Aquí, los biosensores de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster se han desarrollado mediante la unión por pares de un GPCR a péptidos de proteínas G para sondear los cambios conformacionales a concentraciones controladas en células vivas.

Conformaciones GPCR Proteína G-selectivos mide usando sensores FRET en un fluorómetro Ensayo de suspensión de células vivas

Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes de células que expresan receptores de proteína verde fluorescente con etiquetas de tipo 1a angiotensina durante la endocitosis iniciados por el tratamiento de la angiotensina II. Esta técnica incluye los lisosomas de etiquetado con un segundo marcador fluorescente, y luego utilizando software para analizar la co-localización de receptor y lisosoma en tres dimensiones con el tiempo.

Imágenes de células vivas y análisis 3D del receptor de angiotensina Tipo 1a Tráfico transfectadas en células de riñón embrionarias humanas Utilizando microscopía confocal

El ensayo celular se describe está diseñado para la identificación del receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4)-agentes interactuantes que inhiben o estimulan, ya sea competitivo o allosterically, la intracelular Ca2 + liberación iniciada por activación de CXCR4.

Un ensayo de cinética basada en fluorescencia Ca2 + movilización para identificar G proteína-juntó el Receptor agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Dado que los GPCR son objetivos atractivos para drogarse, el cribado de ligando GPCR es por lo tanto indispensable para la identificación de compuestos de plomo y para estudios de desorfanización. Hacia estos esfuerzos, describimos PRESTO-Tango, una plataforma de recursos de código abierto utilizada para la elaboración simultánea de perfiles de reclutamiento transitorio de é-arrestin2 en aproximadamente 300 GPCRs utilizando un ensayo de reportero basado en TEV.

Interrogatorio paralelo del reclutamiento de la serie 2 para la detección de ligandos a escala de GPCR a escala mediante el ensayo PRESTO-Tango

S1P ejerce sus diversos efectos fisiológicos a través de la subfamilia de receptores S1P (S1PRs). Aquí, se describe una tubería para exponer las estructuras y la función de los S1PR.

Una tubería para investigar las estructuras y vías de señalización de los receptores de esfingosina 1-fosfato

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

El protocolo presentado en este estudio ilustra la efectividad del Detector de Diferencia de AMPc In Situ  en la medición de AMPc a través de dos métodos. Un método utiliza un espectrofotómetro de lectura de placa de 96 pocillos con celdas HEK-293. El otro método muestra células HASM individuales bajo un microscopio fluorescente.

Dinámica de cAMP en tiempo real en células vivas utilizando el detector de diferencia de cAMP fluorescente in situ

Este protocolo describe el uso de biosensores basados en BRET para la medición en tiempo real de la activación de la proteína G en células HEK293 vivas tras la estimulación del ligando del receptor acoplado a proteína G. Aquí, el receptor β2-adrenérgico y el receptor cannabinoide tipo 1 sirven como ejemplos para demostrar la eficiencia de los sensores para varios subtipos de proteína G y en varios GPCR.

Biosensores de proteína G basados en BRET para medir la actividad del receptor acoplado a proteína G en células vivas

Aprende a monitorear interacciones GPCR-arrestina en células vivas mediante ensayo de complementación estructural. Este método versátil acelera el descubrimiento de fármacos de primera clase con efectos secundarios mínimos.

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