Name: Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprende a cuantificar coenzima A en células y tejidos mediante cromatografía líquida de alta presión. Este método permite medir CoA total y sus derivados en cualquier organismo para estudios de metabolismo y neurodegeneración.

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Los autores reconocen la financiación para la investigación patrocinada proporcionada por CoA Therapeutics, Inc., una subsidiaria de BridgeBio LLC, la subvención de los Institutos Nacionales de Salud GM34496, y las Organizaciones Benéficas Asociadas Sirias Libanesas Estadounidenses.

El procedimiento animal mencionado en este protocolo se realizó de acuerdo con los protocolos 323 y 556 y fue aprobado específicamente por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Investigación Infantil de St. Jude.
1. Preparación de soluciones
NOTA: Utilice agua ultrapura para todas las soluciones y cuando se indique en los procedimientos.
<ol><li>Preparar 1 mM de hidróxido de potasio (KOH) en agua.</li>
	<li>Preparar 0,25 M KOH en agua.</li>
	<li>Preparar 1 M Trizma-HCl en agua y ajustar a pH 8.0.</li>
	<li>Preparar 100 mM monobromobimane (mBBr) en acetonitrilo (Grado Optima). Las soluciones de stock de mBBr son estables a -20 oC durante muchos meses, siempre que se mantengan en la oscuridad, ya que la exposición a la luz puede fotolizar el monobromobimane a26.</li>
	<li>Preparar Wash Buffer para la extracción de fase sólida (SPE) columna: 50% metanol (Grado Optima) + 2% ácido acético.</li>
	<li>Preparar el tampón de elución para la columna SPE: 95% etanol (grado HPLC) que contiene 50 mM de formato de amonio.</li>
</ol>2. Preparación del estándar CoA-bimane
<ol><li>Comprar un estándar de CoA de alta calidad de una fuente de buena reputación (por ejemplo, Avanti Polar Lipids, Inc.).</li>
	<li>Preparar una solución de stock de alta concentración de CoA en Tris de 20 mM, pH 8. La cantidad de CoA en el stock de alta concentración se determina o confirma mediante la absorbancia espectrofotométrica a 260 nm (a 16.800 M-1cm-1). Añadir 4 veces el exceso molar de mBBr; vórtice en alto durante 10 s. Por ejemplo, para 10 mM CoA en el buffer, agregue 40 mM mBBr. El mBBr se agrega en exceso para asegurarse de que todo el CoA se deriva.</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 4 h en la oscuridad sin agitar para derivatizar el CoA con mBBr. mBBr reacciona con el grupo tiol del CoA, y depende del pH y la temperatura27. La adición del mBBr convierte el CoA en un CoA-bimane fluorescente soluble en agua (o absorbente ultravioleta) (CoA-bimane; Figura 2).</li>
	<li>Añadir ácido acético de 100 l y vórtice a alto durante 10 s para detener la reacción.</li>
	<li>Centrifugar a 2.000 x g durante 15 minutos para eliminar cualquier precipitante.</li>
	<li>Limpie el sobrenadante utilizando una columna SPE para eliminar el mBBr no reaccionado (descrito a continuación). La filtración y centrifugación del eluido no es necesaria después de la limpieza de la columna SPE (Sección 5.8).</li>
	<li>Recoger el eluido de la columna SPE que contiene el CoA-bimane en un tubo prepesado, seco bajo gas nitrógeno, pesar y construir una curva de calibración estándar con cantidades conocidas de CoA-bimane.<ol>
<li>Compruebe el estándar CoA-b para la pureza de HPLC (ver más abajo) con detección de absorbancia tanto en 260 o 260 (mitad de adenina) y 393 (moietidad de bimane) y coincidencia de ambos picos en el cromatograma.</li>
		<li>Confirme la cantidad del estándar De A.C. en el stock de alta concentración utilizando 260 nm (16.800 M-1cm-1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registre el tiempo de retención de HPLC para la identificación de CoA-bimane en muestras experimentales utilizando el estándar CoA-bimane.</li>
	<li>Almacene alícuotas del stock de alta concentración del estándar CoA-bimane protegido de la luz y almacenado a -20 oC durante un máximo de 2 años. Evite la descongelación y la recongelación repetidas.</li>
</ol>3. Extracción y derivación de CoA en células cultivadas
<ol><li>Cosecha células adherentes en cultivo cuando se acercan a densidades de subconfluentes tardíos. Por ejemplo, las células humanas de HepG2/C3A se cultivan a una densidad de 6-8 x 106,o las células HEK 293T se cultivan a una densidad de 1,3 x 107 por plato de 100 mm.<ol>
<li>Utilice cultivos duplicados o triplicados de forma rutinaria para las determinaciones de CoA. Incubar platos de cultivo separados en paralelo con los cultivos celulares de muestra para determinar el número de células viable. Calcular la cantidad de CoA por 106-107 células después de la purificación de HPLC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirar medio de cultivo fuera del plato. Lave rápidamente las células en el plato con solución salina tamponada con fosfato frío (PBS) para eliminar cualquier medio residual y aspirar el PBS fuera del plato. Lave rápidamente las celdas con agua helada para eliminar PBS residual y aspirar el agua del plato rápidamente. Evite molestar a las células adherentes al agregar el PBS o agua.</li>
	<li>Agregue 1 ml de agua helada al plato de cultivo. Raspar las células en el agua fría en el plato y transferir la suspensión celular a un tubo de ensayo de vidrio que contenga 400 ml de 0,25 M KOH y 1,5 ml de agua.<ol>
<li>Mezclar la suspensión vigorosamente por vórtice en alto durante 10 s. A continuación, cubra firmemente con película de parafina e incubar a 55 oC durante 1 h sin agitar en un baño de agua. El pH de la muestra debe ser de 12. El pH alto es importante para hidrolizar los tioesters de CoA y se puede ajustar con alícuotas adicionales de KOH si es necesario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Células cultivadas en la cosecha que crecen en suspensión por centrifugación a baja velocidad: 136 x g durante 6 min a 4oC. Lavar una vez con PBS helado, luego lavar brevemente de nuevo con agua fría, y finalmente resuspender en 2,5 ml de agua fría más 400 sL 0,25 M KOH. Mezclar vigorosamente e incubar a 55oC como se ha descrito anteriormente.</li>
	<li>Añadir 160 sl de Trizma-HCl de 1 M y 10 ml de 100 mM mBBr y mezclar por vórtice a alto durante 10 s. Esto lleva el pH a aproximadamente 8 para apoyar la reacción mBBr con CoA libre. Cubrir e incubar muestras a temperatura ambiente durante 2 h en la oscuridad para que el mBBr reaccione con el tiol de CoA.</li>
	<li>Añadir 100 s de ácido acético y mezclar por vórtice a alto durante 10 s para detener la reacción</li>
	<li>Centrífuga a 2.000 x g durante 15 min para eliminar los residuos celulares precipitados.</li>
	<li>Retire y guarde el sobrenadante en un tubo de ensayo de vidrio para la limpieza de la columna SPE que se describe a continuación.</li>
</ol>4. Extracción y derivación de CoA en tejidos
<ol><li>Diseccionar las piezas de tejido animal, de aproximadamente 0,5 cm de diámetro o más pequeñas, y borre brevemente (1-2 s) sobre papel absorbente y luego congele el flash en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 oC hasta su procesamiento. El CdA en los tejidos se hidroliza o se convierte en un tioester si no se congela con flash. Este paso es importante para obtener el máximo rendimiento de CoA en los tejidos.</li>
	<li>Pesar las piezas de tejido congelado (5 – 60 mg) rápidamente antes de comenzar el análisis, y registrar el peso de cada muestra. Esta determinación del peso húmedo se utiliza para el cálculo del contenido de CoA después de la purificación HPLC. Evite el deshielo completo de las piezas de tejido.</li>
	<li>Añadir 2 ml de KOH de 1 mM a un tubo de ensayo de vidrio (por ejemplo, 13 mm x 100 mm desechable) destinado a la inserción de una sonda y la interrupción del tejido con un homogeneizador de rotor-estator. Mantenga el tubo en hielo hasta su uso. Esto se hace para asegurar que las muestras se homogeneizan a temperatura fría y coA no se destruye debido al calor generado durante la homogeneización.</li>
	<li>Transferir y homogeneizar el tejido (30 – 40 mg) en el tubo de ensayo de vidrio (que contiene frío 1 mM KOH) durante 30 s. Evite la descongelación completa del tejido.</li>
	<li>Añadir 500 sL de 0,25 M KOH; vórtice en alto durante 10 s y mantener en hielo hasta que todas las muestras se homogeneizan. Esto traerá el pH de la muestra por encima de 12 para hidrolizar los tioesters coA para producir CoA total (coA libre + tioestes de CoA hidrolizados).</li>
	<li>Incubar muestras a 55oC durante 2 h en un baño de agua sin agitar para apoyar la hidrólisis.</li>
	<li>Añadir 150 sl de Trizma-HCl de 1 M y 10 ml de 100 mBBr; vórtice en alto durante 10 segundos. Esto lleva el pH a aproximadamente 8 para apoyar la reacción mBBr con CoA libre.</li>
	<li>Incubar muestras a temperatura ambiente durante 2 h en la oscuridad para asegurarse de que todo el CoA se deriva con mBBr.</li>
	<li>Añadir 100 l de ácido acético y vórtice a alto durante 10 s para detener la reacción.</li>
	<li>Centrífuga a 2.000 x g durante 15 minutos a pellet sólaje de residuos celulares precipitados.</li>
	<li>Retire y guarde el sobrenadante en un tubo de ensayo de vidrio para la limpieza de la columna SPE (que se describe a continuación).</li>
</ol>5. Limpieza de muestras con columna de extracción de fase sólida (SPE)
<ol><li>A temperatura ambiente, equilibre cada columna desechable de gel de sílice 2-(2-piritilo)-etil (tamaño 1 ml) con 1 ml de búfer de lavado para asegurarse de que el grupo funcional de piridil es protentón y funcionará como un intercambiador de aniones. 2-(2-piridyl)-etil silica gel es un intercambiador de aniones débil que es ideal para CoA-bimane a un pH básico. 2-(2-piridyl)-gel de sílice etílica tiene un pKa de 6 y la elución se realiza pH 7.</li>
	<li>Agregue el supernadante de muestra (paso 4.11) para columnar y recoger eluido.</li>
	<li>Lave la columna dos veces con 1 ml de wash buffer para eliminar cualquier especie no retenida.</li>
	<li>Lavar la columna una vez con 1 ml de agua.</li>
	<li>Lave la columna dos veces con 1 ml de tampón de elución en un tubo de ensayo de vidrio separado (12 mm x 75 mm) para recoger el CoA-bimane.</li>
	<li>Muestra seca de CoA-bimane en tubo bajo gas nitrógeno hasta sequedad. La muestra seca es estable a temperatura ambiente hasta su uso posterior. Selle y cubra completamente el tubo y la tienda.</li>
	<li>Cuando esté listo para el análisis de HPLC, resuspenda la muestra en 300 ml de agua y mezcle vigorosamente por vórtice a altas durante 10 s.</li>
	<li>Transfiera la muestra resuspendida a un filtro de tubo de centrífuga (acetato de celulosa de 0,22 m, tamaño de 2 ml) y centrífuga a 5.000 x g durante 10 minutos para eliminar cualquier precipitante.</li>
	<li>Transfiera la muestra filtrada a un vial de vidrio adecuado para la inyección de HPLC.</li>
</ol>6. Purificación y medición hPLC de CoA-bimane
<ol><li>Prepare los buffers. Buffer A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Buffer B: Acetonitrilo (Grado Optima).</li>
	<li>Encienda el sistema HPLC. NOTA: El sistema HPLC de nuestro laboratorio es un módulo de separaciones Waters e2695 equipado con un detector de absorbancia 2489 Ultraviolet-Visible (UV-Vis) y un detector de fluorescencia 2475 controlado con el software Empower 3. El sistema también tiene un inyector de muestra automatizado.</li>
	<li>Inyectar cada muestra (p. ej., 20 l) para la separación en una columna DeGén C18, 3 m 100, 4,6 mm x 150 mm utilizando el programa de la Tabla 1 con un caudal de 0,5 ml/min. La temperatura de la columna es de 25 oC. Mida la absorbancia del detector UV/Visible a 393 nm, y la detección de fluorescentes en la palabra "ex" a 393 nm, a 470 nm. El tiempo de retención se determina ejecutando una curva estándar CoA-bimane antes de cada conjunto de muestras.</li>
	<li>Registre el área bajo el pico CoA-bimane para cada muestra y compare con la curva estándar para calcular el pmol de CoA-bimane inyectado en la columna HPLC. La curva estándar de absorción de CoA-bimane se utiliza para muestras de tejido, y la curva estándar de fluorescencia CoA-bimane se utiliza para muestras de cultivo de tejido.</li>
	<li>Como los valores de CoA-bimane representan el CoA total para cada muestra, normalizar el número de células viables para muestras de cultivo, o mg de peso húmedo para muestras de tejido(Figura 6). Alternativamente, calcule los valores totales de CoA después de la normalización al contenido de ADN o proteína para cada muestra. El contenido de ADN o proteínas se puede determinar por separado utilizando alícuotas de muestra que se eliminan durante la preparación de la muestra antes de la adición de KOH.</li>
</ol>

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</ol>

MWF, CS y SJ escribieron el documento, MWF y CS proporcionaron los datos y las cifras, COR diseñó los experimentos y revisó críticamente el manuscrito. SJ y COR son inventores de una solicitud de patente pendiente (PCT/US17/39037) "Pequeños moduladores de moléculas de quinasas pantotenatos" en poder del Hospital de Investigación Infantil DeS.

Aquí demostramos un procedimiento fiable, paso a paso para cuantificar el CoA total en células y tejidos animales con una amplia gama de detección lineal que es accesible en muchos laboratorios que tienen un HPLC con un detector de salida de absorbancia o fluorescencia. Alternativamente, la espectrometría de masas es una técnica común para evaluar los tioesters de CoA y CoA, pero no está ampliamente disponible debido al costo de la instrumentación y los conocimientos especializados necesarios para el desarrollo de la met...

La coenzima A (CoA) es un cofactor esencial en todos los organismos vivos y se sintetiza a partir del ácido pantoténico, también llamado pantotenato (la sal de ácido pantoténico) o vitamina B5. El CoA es el principal portador intracelular de ácidos orgánicos, incluyendo ácidos de cadena corta como acetato y succinato, ácidos de cadena ramificada como propionato y metilmalnato, ácidos grasos de cadena larga como palmitato y oleato, ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos poliinsaturados, y xenobióticos como el ácido valproico. El ácido orgánico forma un enlace tioésico enzimáticamente con CoA para permitir su uso como sustrato en más de 100 reacciones en el metabolismo intermediario1. Los tióreros de CoA también son reguladores alostéricos y activadores transcripcionales. Ahora se aprecia2 que el suministro de CoA total celular está regulado3,4; por lo tanto, la disponibilidad de CoA puede ser limitante, y que las deficiencias de CoA pueden ser catastróficas, como lo ejemplifican los trastornos genéticos hereditarios que afectan la biosíntesis de CoA5. La pantotenato quinasa cataliza el primer paso de la biosíntesis de CoA (Figura 1) y la Neurodegeneración Asociada a Pantotenato Kinasa, llamada PKAN, es causada por mutaciones en el gen PANK2 6. La coA sintasa, codificada por el gen COASYN, cataliza los dos últimos pasos de la biosíntesis de CoA (Figura 1) y la Neurodegeneración Asociada a Proteína COASY, llamada CoPAN, es causada por una mutación en el gen COASYN 7. Tanto PKAN como CoPAN son enfermedades neurodegenerativas hereditarias asociadas con la acumulación de hierro en el cerebro y las deficiencias de CoA subyacentes a las patologías de la enfermedad.
Los niveles celulares de CoA total varían entre los tejidos8 y el CoA total puede aumentar o disminuir bajo una variedad de estados fisiológicos, patológicos y farmacológicos. El coA hepático aumenta durante el cambio de combustible de la alimentada al estado de ayuno9, y los niveles de CoA hepático son anormalmente altos en ratones obesos con deficiencia de leptina10. El coA hepático disminuye en respuesta a la ingestión crónica de etanol11. Los niveles de CoA cerebral en el modelo de ratón Nocaut Pank2 están deprimidos durante el período perinatal, pero más tarde en la etapa adulta el contenido de CoA del cerebro es equivalente a los niveles de tipo salvaje, lo que indica una respuesta de CoA adaptable durante el desarrollo12. La manipulación del contenido de coA tisular por transgénesis o métodos de administración de genes afecta a las funciones metabólicas y neuronales13,14,15. El desarrollo preclínico de posibles terapias para PKAN o CoPAN incluye mediciones de CoA celular o tisular como indicadores de eficacia16,17,18,19,20 . La evaluación de todas estas condiciones y sus consecuencias metabólicas o funcionales requiere un método cuantitativo para la medición del CoA total.
Un ensayo preciso y fiable para medir el CoA en muestras biológicas es un desafío técnico en muchos laboratorios. Desafortunadamente, no hay sondas disponibles para evaluar o cuantificar tioesters de CoA o CoA en células intactas, aunque los análogos de los tioesters coA naturales se han utilizado ampliamente como sondas mecanicistas en estudios de éster CoA utilizando enzimas21. La conversión de CoA, con una mitad libre de sulfhidilo (-SH), a un tioester de CoA (o viceversa) es rápida en las células o tejidos animales durante la transferencia a un ambiente diferente y durante la lisis celular. Numerosas acomodatinosas y tilatirasas ayl-CoA en células median las interconversiones dentro de la piscina de CoA, y enzimas adicionales que utilizan tióreros de CoA como sustratos permanecen activos en muestras biológicas hasta que son apagones por sustanciaquímica o física Significa. La descarga de grupos de acil de CoA a carnitina por acil-transferasas es un ejemplo dentro de la red de reacciones que pueden alterar la distribución del tioester CoA/CoA. Los trazadores radiactivos se pueden utilizar para medir las tasas de síntesis de CoA en las células. Los métodos actuales para medir los derivados de CoA y CoA en muestras biológicas se han revisado22 e incluyen ensayos espectrofotométricos enzimáticos acoplados, cromatografía líquida de alta presión y procedimientos basados en espectrometría de masas. Sin embargo, estos métodos a menudo se centran en especies moleculares de CoA particulares y son ciegos a la variación de la piscina total de CoA. Los ensayos enzimáticos acoplados generalmente requieren mayores cantidades de material de entrada debido a las sensibilidades de detección bajas y tienen un rango limitado de linealidad.
Nuestro laboratorio ha desarrollado un procedimiento fiable para la cuantificación del CoA total en células cultivadas y tejidos animales. La estrategia incluye hidrólisis de todos los tioesters de CoA para producir sólo CoA libre durante la preparación de la muestra, en lugar de hacer esfuerzos para mantener y analizar todo el espectro de especies de CoA. El procedimiento es una compilación de métodos individuales publicados para la preparación de muestras, derivación de CoA, purificación e identificación después de cromatografía líquida de alta presión (HPLC), y cuantificación del CoA derivatizado por absorbancia o detección de fluorescencia23,24,25. Las determinaciones de CoA obtenidas mediante este procedimiento han permitido nuestra comprensión de la regulación del CdA y el desarrollo de un enfoque terapéutico para el tratamiento de las deficiencias de CoA.

<table><tbody><tr><td>2-(2-piridil)-etil gel de sílice columna SPE</td><td>Millipore-Sigma</td><td>54127-U</td><td></td></tr><tr><td>coenzima</td><td>A Avanti Polar Lipids</td><td>870700</td><td></td></tr><tr><td>Gemini C18 3 &mu; m 100 y Aring; columna de HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4439-E0</td><td></td></tr><tr><td>monobromobimano</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M-1378</td><td></td></tr><tr><td>Sonda Omni-Tip disruptor tisular</td><td>Omni International</td><td>32750H</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>PowerGen 125 rotor motorizado homogeneizador ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>NC0530997</td><td></td></tr><tr><td>Spin-X filtro de tubo centrífugo</td><td>CoStar</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Fisher</td><td>T395-1</td><td></td></tr><tr><td>Waters 2475 detector de fluorescencia</td><td>Waters</td><td>2475</td><td></td></tr><tr><td>Waters 2489 detector UV-Vis</td><td>Waters</td><td>2489</td><td></td></tr><tr><td>Waters E2695 módulo de separaciones</td><td>Waters</td><td>e2695</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de la coenzima a en células y tejidos

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Investigaciones emergentes han revelado que el suministro de coenzima celular A (CoA) puede llegar a ser limitante con un impacto perjudicial en el crecimiento, metabolismo y supervivencia. La medición del CoA celular es un desafío debido a su relativamente baja abundancia y la conversión dinámica de coa libre a tioestés de CoA que, a su vez, participan en numerosas reacciones metabólicas. Se describe un método que navega a través de posibles escollos durante la preparación de la muestra para producir un ensayo con una amplia gama lineal de detección que es adecuado para su uso en muchos laboratorios biomédicos.

Se ha desarrollado un método relativamente rápido y fiable para la detección de CoA total en células y tejidos cultivados mediante la derivación del tiol de CoA a un agente fluorescente utilizando mBBr, y luego purificando el CoA-bimane derivatizado utilizando HPLC de fase inversa. Primero se genera una curva estándar, donde se inyectan individualmente cantidades conocidas y crecientes del estándar CoA-bimane y las áreas bajo los picos de los cromatogramas CoA-bimane se trazan en función de la entrada CoA-bimane<strong c...

Este método describe la preparación de muestras a partir de células cultivadas y tejidos animales, extracción y derivación de la coenzima A en las muestras, seguida de cromatografía líquida de alta presión para la purificación y cuantificación de la coenzima A derivada por detección de absorbancia o fluorescencia.

Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

La coenzima A, llamada CoA para abreviar, es un cofactor importante en el metabolismo celular. Las mediciones cuantitativas revelan cambios que ocurren con estados nutricionales y hormonales en modelos animales. Este método cuantifica la cantidad total de CoA celular, incluyendo derivados de CoA y CoA libre, en un método simple y confiable.Varios tipos de neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral se asocian con mutaciones en los genes de la vía biosintética de CoA. Este método se puede aplicar a cualquier sistema biológico ya que todos los organismos requieren CoA para la supervivencia, el crecimiento y la función. Un investigador por primera vez puede tener problemas con los primeros pasos en la preparación de la muestra, donde es importante mantener las muestras absolutamente frías y luego transferirlas rápidamente al hidróxido de potasio.Limite el número de muestras en un lote antes de la transferencia al hidróxido de potasio, y practique con la transferencia antes de trabajar con las muestras experimentales. Muchos investigadores no están familiarizados con la extracción en fase sólida en la preparación de muestras biológicas para análisis bioquímicos posteriores. Para empezar, incubar platos de cultivo triplicado en paralelo, dos para análisis bioquímicos y uno para la determinación del número celular viable.Cuando el cultivo se acerca a las densidades subconfluentes tardías, por ejemplo, las células humanas HepG2/C3A cultivadas a una densidad de seis a ocho veces 10 a las seis o hek 293T células cultivadas a una densidad de aproximadamente 1,3 veces 10 a las siete por plato de 100 milímetros, cosechar las células adherentes en el cultivo. Luego, agregue un mililitro de agua helada al mismo plato de cultivo. Raspa las células en el agua fría del plato y transfiere la suspensión celular a un tubo de ensayo de vidrio que contiene 400 microlitros de hidróxido de potasio 0,25 molares y 1,5 mililitros de agua para llevar el pH por encima de 12.Mezclar la suspensión vigorosamente por vórtices en alto durante 10 segundos. A continuación, cubra firmemente con película de parafina, e incubar a 55 grados centígrados durante una hora sin agitar en un baño de agua. A continuación, añada 160 microlitros de solución de clorhidrato de Trizma de un molar y 10 microlitros de 100 mililitrolares mBBr.Mezclar por vórtices en alto durante 10 segundos. Esto lleva el pH a aproximadamente ocho para apoyar la reacción mBBr con CoA libre. Cubra el tubo con película de parafina e incubar las muestras a temperatura ambiente durante dos horas en la oscuridad para que el mBBr reaccione con el thiol de CoA.Después de dos horas, añadir 100 microlitros de ácido acético, y mezclar por vórtices durante 10 segundos para detener la reacción. Se forma una precipitación en el tubo. A continuación, centrifugar a 2.000 g durante 15 minutos.Para eliminar los residuos celulares precipitados, transfiera y guarde el sobrenadante en un tubo de ensayo de vidrio para la limpieza de la columna de extracción de fase sólida. Antes de comenzar el análisis, agregue dos mililitros de hidróxido de potasio de un mililitrolar a un tubo de ensayo de vidrio diseñado para la inserción de una sonda y la interrupción del tejido con un homogeneizador de rotor-estator. Mantenga el tubo sobre hielo hasta su uso.Pesar las piezas de tejido congelado rápidamente, y registrar el peso húmedo para cada muestra. Transfiera el tejido al tubo de vidrio y homogeneice el tejido durante 30 segundos. Evite el descongelación completa del tejido.Añadir 500 microlitros de hidróxido de potasio 0,25 molares. Vórtice en alto durante 10 segundos, y manténgase en hielo. Esto lleva el pH de la muestra por encima de 12 para hidrolizar los tioesters de CoA para producir CoA total.Cubra el tubo con película de parafina. La preparación de células cultivadas y la preparación de tejidos son los pasos más críticos en este procedimiento. Es importante añadir un alto hidróxido de potasio rápidamente para evitar la degradación de CoA.Incubar las muestras a 55 grados centígrados durante dos horas en un baño de agua sin agitar para apoyar la hidrólisis. A continuación, agregue 150 microlitros de un molar Trizma-hidrocloruro y 10 microlitros de 100 mililitros de mBBr para llevar el pH a unos ocho para apoyar la reacción mBBr con CoA libre. Vórtice a fuego alto durante 10 segundos.Cubra el tubo con película de parafina e incubar las muestras a temperatura ambiente durante dos horas en la oscuridad para asegurarse de que todo el CoA se deriva con mBBr. Después de eso, añadir 100 microlitros de ácido acético, y vórtice en alto durante 10 segundos para detener la reacción. Centrifugar a 2.000 veces g durante 15 minutos para peletizar los desechos celulares precipitados, y transferir el sobrenadante a un tubo de ensayo de vidrio para la limpieza de la columna de extracción de fase sólida.A temperatura ambiente, equilibre cada columna de gel de sílice 2-2-pyridyl-ethyl desechable de un mililitro con un mililitro de tampón de lavado para asegurar que el grupo funcional piríi esté protonado y funcione como un intercambiador de aniones. A continuación, pipetee el sobrenadante de la muestra en la columna y recoja el eluido. Lave la columna dos veces con un mililitro de tampón de lavado y una vez con un mililitro de agua para eliminar cualquier especie no contenida.A continuación, en un tubo de ensayo de vidrio separado, lave la columna dos veces con un mililitro de tampón de elución para recoger el CoA-bimane. Seque la muestra de CoA-bimane en el tubo bajo gas nitrógeno. Selle, cubra completamente el tubo y guárdelo a menos 20 grados centígrados.Cuando esté listo para el análisis de HPLC, resuspender la muestra en 300 microlitros de agua, y mezclar vigorosamente por vórtices en alto durante 10 segundos. Transfiera la muestra resuspendida a un filtro de tubo centrífuga y centrifugar a 5.000 veces g durante 10 minutos para eliminar cualquier precipitante. A continuación, transfiera la muestra filtrada a un vial de vidrio adecuado para la inyección de HPLC.En este estudio, un perfil HPLC representativo muestra el tiempo de retención del estándar CoA-bimane en la columna HPLC C18. Las cantidades crecientes del estándar CoA-bimane se inyectaron individualmente, y las áreas bajo los picos en los cromatogramas de CoA-bimane se trazaron en función del CoA-bimane de entrada. La curva estándar reflejaba la magnitud de la absorbancia de CoA-bimane a una longitud de onda de 393 nanómetros.La fluorescencia de CoA-bimane también se refletió en la longitud de onda de excitación de 393 nanómetros y la longitud de onda de emisión de 470 nanómetros. La separación posterior de HPLC y los perfiles de detección típicos para el hígado de ratón o las células C3A cultivadas en humanos se indican aquí por picos rojos, con un tiempo de retención entre 11 y 12 minutos utilizando el programa de elución. Si la reacción con mBBr no produce resultados detectables, es posible que sea necesario ajustar la cantidad de Trizma-HCl para reducir el pH a aproximadamente ocho.Es posible detectar moléculas celulares adicionales que contienen mitades de sulfhidril o tioestes como derivados del bimano. Por ejemplo, el glutatión-bimano se puede detectar con el método HPLC. Esta técnica permitirá a otros investigadores investigar el papel potencial de la disfunción del CoA asociada con el desequilibrio metabólico, como los modelos animales de diabetes tipo 2.Los investigadores deben utilizar equipos de protección personal cuando se trabaja con disolventes orgánicos utilizados para la extracción en fase sólida.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video muestra una técnica de cuantificación para el CO2 liberado durante la oxidación del sustrato utilizando 14sustratos radiomarcados con C. El 14CO2 liberado queda atrapado en una solución alcalina y se cuantifica mediante un contador de centelleo. La oxidación de diferentes sustratos varía entre tejidos y refleja la condición fisiopatológica del tejido.

Ensayo de oxidación de sustrato en células cultivadas: un ensayo in vitro para cuantificar la oxidación del sustrato en células mediante la medición de señales radiactivas de CO2 atrapado

Este video muestra una técnica in vitro para evaluar la biodisponibilidad de hierro en fuentes de alimentos complejas. La técnica combina la simulación de la digestión humana junto con la absorción de hierro por parte de células Caco-2 diferenciadas. La formación de ferritina intracelular actúa como un marcador para la absorción de hierro celular.

Bioensayo celular Caco-2: un método in vitro para medir la biodisponibilidad del hierro en fuentes alimentarias complejas

Los niveles alterados de hemo intracelular se asocian con enfermedades comunes como el cáncer. Por lo tanto, existe la necesidad de medir los niveles de biosíntesis de hemo en diversas células. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método rápido y sensible para medir y comparar los niveles de síntesis de hemo en diferentes células.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Aquí mostramos plaquetas humanas aisladas se pueden utilizar como un accesible ex vivo modelo para estudiar adaptaciones metabólicas en respuesta al complejo I inhibidor de la rotenona. Este enfoque emplea trazado isotópico y la cuantificación relativa mediante espectrometría de cromatografía de masa líquida y se puede aplicar a una variedad de diseños de estudio.

LC-MS El análisis de las plaquetas humanas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial

La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica esencial responsable de generar energía en muchos tipos de células diferentes, incluidos los hepatocitos. Aquí, describimos un método para medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios recién aislados utilizando ácido palmítico marcado con 14C.

Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

Este protocolo describe un ensayo comparativo, utilizando actividades complejas mitocondriales CI+CIII y CII+CIII en presencia o ausencia de Na+, para estudiar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados.

La sensibilidad de la membrana mitocondrial interna al Na+ revela grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados

El bioensayo de células Caco-2 para la biodisponibilidad de hierro (Fe) representa un enfoque rentable y versátil para evaluar la biodisponibilidad de Fe de alimentos, productos alimenticios, suplementos, comidas e incluso regímenes dietéticos. Completamente validado para estudios en humanos, representa el estado del arte para estudios de biodisponibilidad de Fe.

El bioensayo de células Caco-2 para la medición de la biodisponibilidad de hierro en los alimentos

Se prepararon esferoides tumorales 3D multicelulares con células de adenocarcinoma de pulmón, fibroblastos y monocitos, seguidos del aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) de estos esferoides. Los CAF aislados se compararon con fibroblastos normales para evaluar la salud mitocondrial mediante el estudio del potencial transmembrana mitocondrial, las especies reactivas de oxígeno y las actividades enzimáticas.

Evaluación de la salud mitocondrial en fibroblastos asociados al cáncer aislados de esferoides tumorales de pulmón multicelulares 3D

El estado metabólico de las células epiteliales pigmentarias de la retina humana (H-RPE) refleja su salud y función. Aquí se presenta un protocolo optimizado para examinar el flujo metabólico en tiempo real de H-RPE utilizando respirometría de alta resolución.

Análisis en tiempo real de la bioenergética en células epiteliales pigmentarias de la retina humana primaria mediante respirometría de alta resolución

Este protocolo detalla un ensayo in vitro para medir la captación de lípidos celulares en células endoteliales tras la estimulación con BODIPY-C12 y BODIPY-C16 , análogos fluorescentes de ácidos grasos saturados de cadena larga y cadena muy larga. Este método es eficiente y adaptable a otros tipos de células, ofreciendo un enfoque útil para estudiar el metabolismo de los lípidos.

Cuantificación de la absorción de ácidos grasos endoteliales utilizando análogos de ácidos grasos fluorescentes

Aprende a cuantificar coenzima A en células y tejidos mediante cromatografía líquida de alta presión. Este método permite medir CoA total y sus derivados en cualquier organismo para estudios de metabolismo y neurodegeneración.

Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos

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