Name: Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprende optocardiografía y electrofisiología en corazones porcinos aislados mediante perfusión Langendorff. Este método combina mapeo óptico dual con estudios electrofisiológicos para investigar la dinámica cardíaca en modelos translacionales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores reconocen con gratitud al Dr. Matthew Kay por su útil orientación experimental, y a Manelle Ramadan y Muhaymin Chowdhury por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01HL139472 a NGP, R01 HL139712 a NI), El Instituto de Investigación Infantil, el Instituto Nacional del Corazón infantil y el Instituto Sheikh Zayed para la Innovación Quirúrgica Pediátrica.

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque los modelos de investigación cardiovascular van desde preparaciones celulares hasta preparaciones in vivo, hay un equilibrio inherente entre la relevancia clínica y la utilidad experimental. En este espectro, el corazón aislado de Langendorff perfundido sigue siendo un compromiso útil para el estudio de la fisiología cardíaca48. Todo el modelo cardíaco representa un mayor nivel de integración funcional y estructural que las monocapas de una sola célula o tejido, pero también evita las complejidades de confunción asociadas con los modelos in vivo. Una ventaja importante durante los experimentos de mapeo óptico dual es que se puede observar la superficie epicardial del corazón aislado, y se pueden utilizar imágenes de fluorescencia del potencial transmembrana y manejo de calcio para monitorear la fisiología cardíaca34.
Los modelos de roedores se utilizan más comúnmente para preparaciones cardíacas aisladas en comparación con animales más grandes, debido en parte al costo asociado de up-dimensionar todos los elementos involucrados (por ejemplo, volumen de la solución, circuito de perfusión, cantidad de disyes y desacopladores mecánicos) junto con una mayor inestabilidad y propensión a las arritmias en animales más grandes10,36,49. Una ventaja de usar corazones de cerdo es que se asemejan mucho al corazón humano en estructura, tamaño y tasa de contracción, por lo tanto, modelando con mayor precisión parámetros hemodinámicos como el flujo sanguíneo coronario y la salida cardíaca. Del mismo modo, los seres humanos y los cerdos tienen un manejo similar del calcio, intervalos de electrocardiograma37y morfología potencial de acción, incluidos los canales subyacentes que representa12,50,51, 52. Este protocolo describe en detalle los pasos para crear un modelo animal grande reproducible para caracterizar exhaustivamente la función miocárdica. Las imágenes simultáneas de voltaje transmembrana (RH237) y calcio intracelular (Rhod2), utilizados junto con protocolos electrofisiológicos establecidos, brindan la oportunidad de identificar mecanismos que son responsables de la alteración cardíaca Función. La metodología descrita se puede utilizar para pruebas de seguridad preclínicas, pruebas toxicológicas y la investigación de patologías genéticas u otras enfermedades. Además, la metodología descrita puede ser modificada y adaptada para su uso con otros modelos cardíacos (por ejemplo, caninos, humanos) dependiendo del enfoque específico de investigación53,54,55.
Hay algunas modificaciones críticas a tener en cuenta al pasar de un modelo de roedor más pequeño a un modelo de cerdo más grande para preparaciones aisladas de corazón entero. Durante la preparación y configuración, recomendamos añadir albúmina al perfusado para mantener la presión oncótica y reducir el edema (más antiespuma, si es necesario)56,57,58,59. Por otra parte, perfusate que contiene albúmina también puede ayudar en estudios metabólicos que también requieren suplementos de ácidos grasos a los medios60,61. A diferencia de los corazones de roedores, el corazón de cerdo más grande no necesita ser sumergido en medios cálidos debido a su menor relación superficie-volumen y el aumento del volumen de medios calentados que fluyen a través de los vasos coronarios que mantiene mejor la temperatura. Como se señaló anteriormente, colocamos sondas de temperatura dentro del ventrículo derecho y en la superficie epicardial de los ventrículos derecho e izquierdo, observando sólo ligeras fluctuaciones de temperatura de 1 a 2 oC en los tres lugares a lo largo del estudio. Es importante destacar que estos caudales más rápidos también pueden aumentar la probabilidad de burbujas y una posible embolia. Para evitar este problema, recomendamos usar una trampa de burbujas con tubos de gran diámetro que conducen directamente a la cánula aórtica. Del mismo modo, nos resultó más útil tener dos individuos trabajando en tándem para canalizar la aorta en un corazón más grande (y más pesado); una persona para mantener la aorta abierta con hemostats robustos y otra para asegurar la aorta a la cátula usando cinta umbilical. En la metodología descrita, encontramos que la perfusión con cardioplejia y desfibrilación eran vitales para la recuperación cardíaca, lo que es contrario a las preparaciones para el corazón de los roedores. En nuestra experiencia, sólo unos pocos corazones extirpado reanudaron la actividad normal impulsada por los senos parano sin cardioversión.
Para mejorar los puntos finales de las imágenes ópticas, una preparación del corazón colgante limitó el efecto del deslumbramiento que puede ocurrir con un corazón sumergido. Además, el corazón colgante también evita cualquier compresión o compromiso de los vasos coronarios en el aspecto posterior del corazón que puede ocurrir al colocar el corazón horizontalmente para obtener imágenes verticales. También encontramos que la carga de colorantes fluorescentes después de la trampa de burbujas (cerca de la cánula aórtica) mejoró en gran medida la tinción de tejido y señales ópticas. Por último, para mejorar los puntos finales de la electrofisiología cardíaca, el uso de un electrodo de estimulación coaxial más grande facilitó el ritmo auricular exitoso. Aunque describimos el uso de electrocardiogramas para identificar la captura y pérdida de captura para varios parámetros EP, también se pueden utilizar catéteres intracardiacos o electrodos de registro bipolar.
Nuestro estudio se centró en el desarrollo de una metodología para la cartografía óptica dual y la evaluación electrofisiológica cardíaca en un modelo de corazón porcino aislado e intacto. Debido a las similitudes con el corazón humano juvenil, el corazón porcino sigue siendo un modelo popular para estudios centrados en cardiología pediátrica o defectos cardíacos congénitos. Es importante destacar que el enfoque descrito se puede adaptar para su uso con corazones adultos de mayor tamaño y/o diferentes especies de interés. De hecho, otros laboratorios pueden encontrar que el uso de corazones caninos o humanos (ya sea donante o enfermo) son más aplicables para su enfoque específico de investigación53,54,55. Otra limitación potencial a este estudio es el uso de un desacoplador mecánico para reducir el artefacto de movimiento durante la toma de imágenes. Blebbistatin se ha convertido en el desacoplador preferido en aplicaciones de imágenes cardíacas debido a sus efectos mínimos sobre los parámetros de ECG, periodos de activación y refractarios41,62,63. BDM es una opción menos costosa, que puede ser particularmente importante en grandes estudios en animales que requieren mayores volúmenes de perfumar y desacoplador mecánico, pero se sabe que tiene un mayor impacto en las corrientes de potasio y calcio que pueden alterar el potencial de acción morfología64,65,66,67. Si se utiliza BDM, tenga en cuenta que el acortamiento de APD aumenta la vulnerabilidad de los corazones a las arrythmias inducidas por impactos68. Por el contrario, la principal limitación al uso de blebbistatin es su fotosensibilidad y fototoxicidad, aunque formulaciones alternativas que han reducido estos efectos69,70,71. Por último, la metodología descrita utiliza un sistema de una sola cámara para la experimentación de mapeo óptico dual, pero es importante tener en cuenta que los estudios de investigación se centraron en la fibrilación ventricular y/o el seguimiento de ondas eléctricas a través de la superficie epicardial tendría que modificar este enfoque para incluir imágenes panorámicas tridimensionales, como se describe en otros15,19,72,73,74,75 .

Las enfermedades cardiovasculares son una de las principales causas de enfermedad y muerte en todo el mundo. Como tal, un enfoque de investigación principal es optimizar metodologías que se pueden utilizar para estudiar la fisiología cardíaca normal y los mecanismos subyacentes que pueden contribuir a la morbilidad y mortalidad en los seres humanos. La investigación cardiovascular básica ha dependido tradicionalmente de pequeños modelos animales, incluidos roedores y conejos1,2,3, debido a la disponibilidad de especies modificadas genéticamente4,5, menor costo, menor huella experimental y mayor rendimiento. Sin embargo, el uso de un modelo de cerdo tiene el potencial de proporcionar datos más relevantes clínicamente6. De hecho, estudios previos han documentado similitudes en electrofisiología cardíaca (EP) entre humanos y cerdos, incluyendo corrientes iónicas similares7,forma potencial de acción8y respuestas a las pruebas farmacológicas9. Por otra parte, el corazón porcino tiene cinética contráctea y relajación que son más comparables a los seres humanos que los roedores o conejos10. En comparación con un modelo canino, la anatomía coronaria porcina se asemeja más a un corazón humano11,12 y es el modelo de elección para estudios centrados en el desarrollo del corazón, cardiología pediátrica y / o defectos cardíacos congénitos 13. Aunque hay diferencias entre el cerdo y el corazón humano8,estas similitudes hacen del corazón porcino un modelo valioso para la investigación cardiovascular14.
La perfusión retrógrada del corazón se ha convertido en un protocolo estándar para estudiar la dinámica cardiaca ex vivo15 desde su primera creación establecida por Oskar Langendorff16. En consecuencia, Langendorff-perfusión se puede utilizar para apoyar un corazón aislado, intacto en ausencia de influencias autonómicas. Este modelo es una herramienta útil para comparar directamente la electrofisiología cardíaca y la contractilidad entre corazones sanos y no sanos. Dado que la dinámica cardíaca es temporal y espacialmente compleja, una ligera alteración en una región puede afectar dramáticamente la capacidad de todo el corazón para trabajar como un sincitio17. Por lo tanto, la alta imagen espaciotemporal de los dedos sensibles a parámetros es una herramienta útil para monitorear la función cardíaca a través de la superficie del corazón18,19. De hecho, la imagen dual simultánea de sondas fluorescentes sensibles al voltaje y al calcio permite evaluar la actividad eléctrica, la manipulación de calcio y el acoplamiento excitación-contracción a nivel de tejido20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Las técnicas de perfusión y/o cartografía óptica de Langendorff se han utilizado previamente para documentar la disminución del rendimiento cardíaco debido al envejecimiento o a mutaciones genéticas, y para evaluar la seguridad de los agentes farmacológicos o las exposiciones ambientales29 ,30,31,32,33.
En el entorno clínico, a menudo se utiliza un estudio de electrofisiología cardíaca invasiva para investigar alteraciones del ritmo cardíaco, identificar patologías y identificar posibles opciones de tratamiento. Del mismo modo, describimos un protocolo EP que se puede utilizar para evaluar la función del nódulo sinusal, medir la conducción auriculoventricular e identificar la refractoridad del tejido miocárdico. El estudio EP descrito se puede realizar junto con la cartografía óptica, u optocardiografía34,para caracterizar completamente la fisiología cardíaca en corazones aislados. En el protocolo descrito, se realizaron imágenes de fluorescencia de alta resolución espaciotemporal con una combinación de tintes de voltaje (RH237) y calcio (Rhod-2AM) en una configuración de doble emisión. Además, los parámetros de electrofisiología cardíaca fueron monitoreados bajo el ritmo sinusal y en respuesta a la estimulación eléctrica programada.

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560-5MG</td><td>Desacoplador mecánico</td></tr><tr><td>2,3-butanediona monóxido (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753-100G</td><td>Desacoplador mecánico</td></tr><tr><td>Albúmina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Interfaz de señal analógica</td><td>emka Technologies</td><td>itf16USB</td><td></td></tr><tr><td>Antiespumante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5758-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Emulsión Antiespumante Y-30</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>Cánula aórtica, 5/16"</td><td>Cole-Parmer</td><td>45509-60</td><td></td></tr><tr><td>Trampa</td> de <td>burbujas Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641U-100EA</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>C77-500</td><td></td></tr><tr><td>Cámara, sCMOS</td><td>Andor Technology</td><td>Zyla 4.2 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de estimulación coaxial (aurículas)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0219</td><td></td></tr><tr><td>Desfibrilador</td><td>Espejo</td> dicroico <td>Zoll M Series</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Chroma Technology</td><td>T660lpxrxt-UF2</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador diferencial</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-304A</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión, calcio</td><td>Chroma Technology</td><td>ET585/40m</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión, voltaje</td><td>Chroma Technology</td><td>ET710lp</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador EP (Bloom)</td><td>Fisher Medical</td><td>DTU-215B</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de excitación</td><td>Chroma Technology</td><td>CT510/60bp</td><td></td></tr><tr><td>Luces de excitación</td><td>Thorlabs</td><td>SOLIS-525C</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>McMaster-Carr</td><td>8147K52</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho de filtro, polipropileno</td><td>Pentair</td><td>PD-5-934</td><td></td></tr><tr><td>Carcasa de filtro</td><td>McMaster-Carr</td><td>9979T21</td><td></td></tr><tr><td>Transductor</td><td>de flujo Transonic</td><td>ME6PXN</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>Serpentín de calentamiento</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Hemofiltro</td><td>Hemocor</td><td>HPH 400</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas hemostáticas</td><td>World Precision Instruments</td><td>501326</td><td></td></tr><tr><td>divisor de imagen</td><td>Cairn Research</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>423-316</td><td></td></tr><tr><td>Tubería de gran diámetro, diámetro interno de 3/8"</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-169-7H</td><td></td></tr><tr><td>Lente 50 mm, 0.95 f-stop</td><td>Navitar</td><td>DO-5095</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Alineación de imagen</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>Detergente Mucasol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z637181-2L</td><td></td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>S-233</td><td></td></tr><tr><td>Electrodos de aguja 29 G, 2 mm</td><td>AD Instruments Inc.</td><td></td><td></td>MLA1204</tr><tr><td>Eliminador de ruido</td><td>Quest</td><td>Scientific Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusión</td><td>PolyStan</td><td>A/S 1481</td><td></td></tr><tr><td>Transductor de presión</td><td>World Precision Instruments</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>Depósito, 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34541-07</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21480</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2-AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de estimulación (ventrículo)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0160</td><td></td></tr><tr><td>Sutura quirúrgica</td><td>McKesson Amplificador de transductor médico-quirúrgico</td><td>890186</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>TBM4M</td><td></td></tr><tr><td>Consola de flujo de tubos</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Cinta umbilical</td><td>Jorvet</td><td>J0025UA</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua/circulador</td><td>VWR</td><td>89400-970</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vendaje tijeras Harvard</td><td>Apparatus</td><td>72-8448</td><td>Lister Tijeras de vendaje, Angulares, Romanas/Romanas, 42,0 mm de longitud de hoja, 17,0 cm</td></tr><tr><td>Electrocauterio</td><td>Dalwha Corp. Ltd.</td><td>BA2ALD001</td><td>Modelo: 200</td></tr><tr><td>Hemostático</td> Básico <td>Roboz</td><td>RS-7476</td><td>St Vincent Pinzas de oclusión de tubo</td></tr><tr><td>Pinzas hemostáticas</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8960</td><td>Pinzas Hemostáticas Hartmann, Curvas, Dentadas 2,2 mm de ancho de punta, 9,5 cm</td></tr><tr><td>Hemostáticos</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8985</td><td>Halstead-Mosquito Pinzas Hemostáticas Curvas, Dentadas, Punta de 2 mm</td></tr><tr><td>Tijeras Mayo de</td> 14 cm<td>WPI</td><td>501749</td><td>14,5 cm,</td></tr><tr><td>Tijeras Metzenbaum rectas</td><td>WPI</td><td>501747</td><td>11,5 cm, rectas</td></tr><tr><td>Pinzas antimosquitos</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8980</td><td>Pinzas hemostáticas Halstead-Mosquito rectas, lisas, 2 mm de ancho de punta 12 cm</td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8828</td><td>Webster Portaagujas, rectos, lisos, 13,0 cm de longitud total</td></tr><tr><td>Cruz pediátrica pinza</td><td>Roboz</td><td>RS-7660</td><td>Cooley-Derra Abrazadera 6.25" 5 mm Calibraciones</td></tr><tr><td>Pinzas de ángulo recto</td><td>WPI</td><td>501240</td><td>Pinza hemostática para bebés, 14 cm,</td></tr><tr><td>bisturí</td> de ángulo recto <td>Ted Pella</td><td>549-4</td><td>Mango de bisturí n.º 4, 13,7 cm de acero inoxidable y 10 hojas n.º 22</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8380</td><td>Tijeras de operación, rectas, romas/romas, hoja de 42 mm, 12 cm</td></tr><tr><td>Pinza</td> recta dentada <td>WPI</td><td>500363</td><td>Pinza de vendaje 15,5 cm</td></tr><tr><td>Pinza para toallas</td><td>WPI</td><td>501700</td><td>Backhaus Pinza para toallas, 13 cm, Curva, Mango de bloqueo, SS</td></tr><tr><td>Retractor Weitlaner</td><td>WPI</td><td>501314</td><td>Weitlaner Retractor, Autoretenedor, 10,2 cm, 2x 3 Puntas afiladas</td></tr><tr><td>Desechables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-0 prolene sutura</td><td>Varios proveedores</td><td>Varios proveedores</td><td></td></tr><tr><td>Asa de vaso</td><td>Aspen surgical</td><td>011001PBX</td><td>Sterion&reg; Asa de vaso, 0,8 mm x 406 mm</td></tr><tr><td>Cardioplejia (Plegisol)</td><td>Pfizer</td><td>00409-7969-05</td><td>Plegisol; Solución de cardioplejia cristaloide de St. Thomas 20 mL/kg</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Varios proveedores</td><td>Varios proveedores</td><td>300 U/kg</td></tr><tr><td>Jeringa y aguja</td><td>Varios proveedores</td><td>Varios proveedores</td><td>60 mL y 18 G respectivamente</td></tr><tr><td>Cinta umbilical</td><td>Ethicon</td><td>U12T</td><td></td></tr></tbody></table>

estudios de optocardiografía y electrofisiología de corazones perfundidos ex vivo langendorff

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Los modelos animales pequeños se utilizan más comúnmente en la investigación cardiovascular debido a la disponibilidad de especies modificadas genéticamente y menor costo en comparación con los animales más grandes. Sin embargo, los mamíferos más grandes son más adecuados para preguntas de investigación traslacional relacionadas con la fisiología cardíaca normal, la fisiopatología y las pruebas preclínicas de agentes terapéuticos. Para superar las barreras técnicas asociadas con el empleo de un modelo animal más grande en la investigación cardíaca, describimos un enfoque para medir los parámetros fisiológicos en un corazón de lechones aislado, perfundido con Langendorff. Este enfoque combina dos potentes herramientas experimentales para evaluar el estado del corazón: estudio de electrofisiología (EP) y mapeo óptico simultáneo de voltaje transmembrana y calcio intracelular utilizando colorantes sensibles a parámetros (RH237, Rhod2-AM). Las metodologías descritas son adecuadas para estudios traslacionales que investigan el sistema de conducción cardíaca, alteraciones en la morfología potencial de la acción, el manejo del calcio, el acoplamiento excitación-contracción y la incidencia de alternadores cardíacos o Arritmias.

La Figura 1A muestra un diagrama del sistema de perfusión cardíaca aislada, que incluye el circuito de tuberías, la bomba, el filtro, el oxigenador, los depósitos y los elementos de calefacción. La colocación del ECG (configuración del plomo II) y de los electrodos de ritmo se muestra en la Figura 1B,y la configuración de la imagen se representa en la Figura 1C. En la Figura 1Dse muestra un esquema de los componentes ópticos y las trayectorias de luz.
Se realizaron estudios experimentales sobre corazones enteros intactos aislados de cerdos juveniles de Yorkshire (14-42 días, no 18) que oscilaron entre 2,5 y 10,5 kg de peso corporal y 18 a 137 g de peso cardíaco(Figura 2A). Después de transferir el corazón aislado a un sistema Langendorff (37 oC), la frecuencia cardíaca se estabilizó a 70 o 4,5 bpm (media de SEM) dentro de los 10 minutos de desfibrilación y se mantuvo constante durante todo el estudio(Figura 2B). Se midió un caudal medio de 184 a 17 ml/min (media de SEM), que se desaceleró a 70 x 7,5 ml/min después de perfumar con medios calentados que contenían un desacoplador mecánico(figura 2C).
Los ECG de plomo II se registraron durante toda la duración del estudio durante el ritmo sinusal(Figura 3A)o en respuesta al ritmo externo(Figura 3B-E)para cuantificar los parámetros electrofisiológicos. Para la evaluación del PE, el ritmo dinámico (S1-S1) se aplicó a la aurícula derecha para identificar el WBCL y el SNRT (tiempo de recuperación después del inicio de S1-S1, Figura 3C),en el que WBCL fue denotado como el PCL más corto que inició la conducción auricular a ventricular. Se implementó un protocolo de ritmo S1-S2 utilizando un electrodo de estímulo bipolar en el ventrículo izquierdo para identificar el intervalo de acoplamiento más corto que inició la despolarización ventricular, identificando así VERP(Figura 3D). Alternativamente, un protocolo de ritmo auricular S1-S2 se aplica para señalar AVNERP (S1-S2), tal y como se muestra en del cuadro 3E. Ejemplos representativos de parámetros de electrofisiología del corazón de cerdo se alinean estrechamente con los publicados anteriormente37.
Se realizaron experimentos de mapeo óptico durante el ritmo sinusal, la fibrilación ventricular espontánea(Figura 4),o durante el ritmo dinámico (S1-S1) del ventrículo izquierdo (LV) para generar curvas de restitución eléctricas y de calcio representadas en Figura 5. Las imágenes representativas de un corazón de lechón con carga de tinte se muestran en la Figura 4 con los correspondientes potenciales de acción óptica (Vm) y transitorios de calcio (Ca) recogidos de dos regiones de interés en la superficie epicardial (ventrículo derecho [RV] - azul, LV a rojo) . Las señales no procesadas se muestran durante el ritmo sinusal y durante la fibrilación ventricular. Como se mencionó anteriormente, el ritmo epicardial dinámico (S1-S1) también se utilizó durante los experimentos de mapeo óptico para normalizar cualquier ligera diferencia en la frecuencia cardíaca intrínseca(Figura 5A-E). Se muestran las señales en bruto (RV - azul, LV - rojo), que se utilizaron para representar el potencial de acción — tiempo de acoplamiento transitorio de calcio (Figura 5C), tiempo de activación y duración (Figura 5D), restitución eléctrica y de calcio (Figura 5E). Para preparaciones miocárdicas gruesas, el filtrado espacial con tamaño de núcleo de 3 mm x 3 mm es adecuado para el potencial de acción epicardial o el análisis transitorio de calcio19,47. En consecuencia, las imágenes de alta resolución espacial (en la configuración descrita 1240 x 1024 en total, o 620 x 512 por canal, tamaño de píxel de 6,5 m) a menudo se agrupan espacialmente durante o después de la adquisición(Figura 5C). El procesamiento de imágenes se puede realizar para generar mapas de activación y repolarización utilizando algoritmos personalizados23,33,43,45 (Figura 3D), con el tiempo de activación de cada píxel en el corazón se definió como la derivada máxima del potencial de acción o el golpe ascendente transitorio de calcio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg"> Figura 1: Configuración experimental. (A) Diagrama del sistema aislado de perfusión cardíaca; las flechas denotan la dirección del flujo. (B) Se muestra un corazón canulado con colocación de electrodos. RA - Aurícula derecha, RV - ventrículo derecho, LV - ventrículo izquierdo, ECG - electrocardiograma de plomo II. (C) La plataforma de imágenes muy cerca del tejido cardíaco. (D) La emisión de cada sonda complementaria (voltaje, calcio) se separa por longitud de onda utilizando un dispositivo de división de imágenes con filtros de emisión adecuados y espejo dicroico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg"> Figura 2: Mediciones del peso cardíaco, la frecuencia y el flujo. (A) Relación peso del corazón a peso corporal para cada lechón utilizado en el estudio (n x 18). (B) Frecuencia cardíaca medida 10 min después de la desfibrilación y de nuevo al final del estudio (aproximadamente 1 h). (C) El flujo coronario cae precipitadamente después de la perfusión con un desacoplador mecánico (+BDM) debido a la reducción de la demanda de oxígeno. Las barras de escala representan la media de SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg"> Figura 3: Ejemplos representativos de grabaciones de electrocardiogramas de plomo II recogidas durante el ritmo sinusal o en respuesta al ritmo externo. (A) Ritmo sinusal normal. (B) Ejemplo de ritmo epicardial a una longitud de ciclo de 400 ms (S1-S1), que se utilizó para experimentos de imagen. (C) Superior: ritmo auricular para identificar WBCL; se observa una captura exitosa en S1 a 250 ms en la que se observa la conducción auricular a ventricular. Tenga en cuenta que el ritmo auricular se puede utilizar para determinar la SNRT (tiempo para la descarga del nódulo sinusal, después de iniciar el ritmo externo). Inferior: A medida que la longitud del ciclo S1 se reduce a 205 ms, la conducción al ventrículo falla. (D) Parte superior: ritmo epicardial (S1-S2) para identificar VERP; La captura exitosa se observa en S1 a 450 ms, S2 a 300 ms. Inferior: A medida que la longitud del ciclo S2 se reduce a 250 ms, el tejido ventricular no puede capturar. (E) Ritmo auricular (S1-S2) para identificar AVNERP. Arriba: La captura exitosa se observa en S1 a 450 ms, S2 a 200 ms. Inferior: A medida que la longitud del ciclo S2 se reduce a 199 ms, la conducción al ventrículo falla. Las flechas azules denotan picos de ritmo, las flechas rojas denotan captura ('C') o ninguna captura ('NC'). S1-S1 - ritmo dinámico, S1-S2 - ritmo de estímulo adicional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg"> Figura 4: Datos ópticos durante el ritmo sinusal y la fibrilación ventricular. Izquierda: Imágenes representativas de un corazón de cerdo cargado con tinte (Vm - voltaje, RH237; Ca á calcio, Rhod2), vista anterior. Tensión transmembrana filtrada espacialmente y señales fluorescentes de calcio intracelular de un corazón de cerdo durante el ritmo sinusal (Centro). Señales de tensión y calcio durante la fibrilación ventricular (derecha). Tamaños de región de señal (15 x 15 píxeles a 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 x 4,8 x 4,8 mm2 tamaño de núcleo) representados como cuadrados rojos y azules. Unidades: F/F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg"> Figura 5: Datos ópticos de los corazones de cerdo perfundidos por Langendorff. Tensión transmembrana sin procesar, filtrada espacialmente (A) y (B) señales de fluorescencia de calcio intracelular desde los ventrículos derecho e izquierdo durante el ritmo eléctrico en el ápice. Las señales sin filtrar y con promediado espacial representan potenciales de acción óptica y transitorios de calcio de regiones de interés (las unidades de señal son F/F). (C) Una superposición de transitorios normalizados ilustra el tiempo de acoplamiento transitorio potencial-calcio de acción (paso bajo filtrado a 75 Hz). (D) Procesamiento de señales a través de la superficie epicardial para generar mapas isocronas de parámetros temporales, incluyendo el tiempo de activación (tact)y el 80% de tiempo de repolarización. (E) Curvas de restitución transitorias eléctricas y cálcicas generadas a múltiples frecuencias (izquierda) con análisis estadísticos (derecha) para ilustrar un tiempo de repolarización más largo a longitudes de ciclo de ritmo más lentas. Barras de escala: media, SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Química</td>
			<td>Fórmula</td>
			<td>Peso molecular</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro de sodio</td>
			<td>Nacl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>5.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gluconato de sodio</td>
			<td>C6H11NaO7
</td>
			<td>218.14</td>
			<td>5.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acetato de sodio trihidrato</td>
			<td>C2H3NaO2•3H2O</td>
			<td>136.08</td>
			<td>3.68</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro de potasio</td>
			<td>Kcl</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro de magnesio (anhidro)</td>
			<td>MgCl2
</td>
			<td>95.21</td>
			<td>0.1405</td>
		</tr>
<tr>
<td>8.4% Bicarbonato de sodio</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Manitol</td>
			<td>C6H14O6
</td>
			<td>182.17</td>
			<td>16.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sulfato de magnesio</td>
			<td>MgSO4
</td>
			<td>120.37</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Osmolaridad (mOsmol/L)</td>
			<td>294</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Modificación de la receta de cardioplejia de Del Nido.

El objetivo de este estudio fue establecer un método para investigar la dinámica cardíaca utilizando un modelo animal traslacional. El enfoque experimental descrito incorpora optocardiografía de doble emisión junto con un estudio electrofisiológico para evaluar la actividad eléctrica en un modelo de corazón porcino aislado e intacto.

Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

El mal funcionamiento cardiovascular es la principal causa de muerte en todo el mundo. El modelo de corazón aislado que presentamos aquí puede servir como una ventana experimental en la dinámica cardíaca humana. Este enfoque combina un estudio clásico de electrofisiología con el mapeo óptico simultáneo de voltaje transmembrana y calcio intercelular para evaluar el estado del corazón.Esta metodología se puede aplicar a estudios de modelado de enfermedades, farmacología y toxicología. Por ejemplo, una de nuestras áreas de enfoque es caracterizar los efectos de los tamañores de vidrio en la electrofisiología cardíaca. Aunque esta metodología es técnicamente más difícil que un protocolo que utiliza un modelo animal más pequeño, en general, el protocolo es relativamente sencillo una vez que todas las piezas están en su lugar.Es difícil describir todos los componentes de un sistema de imágenes y perfusión por texto, por lo que la demostración visual de este proceso ayudará a reproducir una preparación exitosa. Después de aislar el corazón con la aorta ascendente intacta, sumerge el órgano extirpado en cardioplejia helada y usa un par de hemostats para agarrar la pared de la aorta. Deslice el recipiente sobre una cánula acanalada unida a un tubo conectado a un litro de medio de cardioplegia helada suspendida aproximadamente 95 centímetros por encima del corazón.Permita que el líquido llene la aorta hasta que el recipiente se desborde para evitar que las burbujas entren en la vasculatura y utilice cinta umbilical para asegurar la aorta a la cánula. Ate los hemostats para soportar el peso del corazón mientras cuelga de la cánula para asegurar aún más el tejido y permitir que el medio frío retrate el corazón a una presión constante de 70 milímetros de mercurio por gravedad. Transfiera el oído al sistema de 37 grados Celsius Langendorff sin introducir aire en la cánula.Y permitir que el ritmo sinusal normal enjuague la vasculatura de cualquier sangre restante y cardioplegia. En caso de arritmias impactantes, coloca paletas externas en el ápice y la base del corazón para desfibrilar el órgano, dando un solo choque a cinco julios y aumentando en incrementos de cinco julios hasta que se logre 50 julios, cardioversión o ritmo inquebrantable. Luego, enjuague el corazón con al menos un litro de medio Krebs-Henseleit modificado sin recirculación para eliminar la sangre residual y la cardioplegia.Cuando el medio corra claro a través del corazón, cierre el lazo circulante para recircular el perfuso. Para registrar un cable estándar al ECG durante el transcurso del estudio, conecte un electrodo de aguja del calibre 29 al epicardio ventricular cerca del ápice y conecte otro electrodo en la aurícula derecha. Conecte las entradas positivas y negativas de un bioamplificador diferencial al ápice y a la aurícula derecha, respectivamente, y conecte un electrodo de estímulo bipolar en la aurícula derecha y un segundo electrodo de estímulo bipolar al ventrículo izquierdo lateral para fines de ritmo.Acelera el corazón usando un estimulador de electrofisiología, con la corriente inicial ajustada al doble del umbral diastólico y un ancho de pulso de un milisegundo. Para identificar el umbral de ritmo, aplique una serie de impulsos de estímulo de uno a dos miliamperios con un ancho de pulso de un milisegundo a longitudes de ciclo de ritmo definidas para garantizar una respuesta de estímulo consistente. Realice un ritmo de estímulo adicional utilizando un tren de ritmo S1, S1 o S1, S2.Disminuya la longitud del ciclo de ritmo S2 paso a paso en 10 milisegundos hasta que el ritmo no pueda capturarse. A continuación, suba a la penúltima longitud del ciclo de ritmo y disminuya las longitudes del ciclo en intervalos de un milisegundo para determinar la longitud del ciclo de ritmo más preciso antes de la pérdida de captura. Para establecer el período refractario efectivo ventricular, utilice el electrodo de estímulo en el ventrículo izquierdo lateral para identificar el intervalo S1, S2 más corto en el que el latido prematuro S2 inicia la despolarización ventricular.Para definir la longitud del ciclo de Wenckebach, utilice el electrodo de estímulo en la aurícula derecha para encontrar el intervalo S1, S1 más corto en el que una conducción auriculoventricular uno a uno se propaga a través de la vía de conducción normal. Para definir el tiempo de recuperación del nodo sinusal, utilice el electrodo de estímulo en la aurícula derecha para aplicar un tren de ritmo S1, S1 y medir el retardo de tiempo entre el último impulso en el tren de ritmo y la recuperación de la actividad mediada por nodos sinoauriales espontáneos. Para establecer el período refractario efectivo del nodo auriculoventricular, utilice el electrodo de estímulo en la aurícula derecha.Encuentre el intervalo de acoplamiento S1, S2 más corto en el que la estimulación auricular prematura es seguida por un potencial Desagregación hisbundle que provoca un complejo QRS, lo que significa despolarización ventricular. Para el mapeo óptico de la tensión transmembrana y el calcio intracelular, primero agregue lentamente hasta cinco mililitros de tinte de voltaje proximal recién preparado a la cánula aórtica seguida de la adición lenta de tinte de calcio recién preparado. A continuación, coloque el hardware de imágenes para centrarse en un campo de visión adecuado y conecte la cámara a una estación de trabajo.Adquiera imágenes utilizando el software seleccionado con un tiempo de exposición de 5 a dos milisegundos. Y realice una alineación de imagen con la ayuda de software que puede dividir y superponer las regiones deseadas y mostrar una resta en escala de grises o adición de pseudocolor a cualquier desalineación de resaltado. Con la iluminación ambiental minimizada, pruebe las luces LED para garantizar una iluminación épica y épica de forma uniforme, según lo determinado por la profundidad del sensor.Luego, imagine el miocardio durante el ritmo sinusal, la fibrilación ventricular o el ritmo dinámico utilizando el electrodo de estimulación situado en el ventrículo izquierdo, comenzando con una longitud de ciclo de ritmo de 350 milisegundos y disminuyendo en 10 a 50 milisegundos para generar curvas de restitución. Para confirmar la adquisición de una señal óptica de calidad a lo largo del experimento, abra un archivo de vídeo, seleccione una región de interés y trace la fluorescencia media a lo largo del tiempo. Al final del experimento, retire el corazón del sistema y drene la perfusión.A continuación, enjuague el tubo del sistema y las cámaras con agua purificada. Para un mantenimiento rutinario, enjuague periódicamente el sistema con solución detergente según sea necesario. En estos estudios representativos, el procedimiento se realizó en modelos intactos, como se demostró, que oscilaban en tamaño de 2,5 a 10,5 kilogramos de peso corporal y de 18 a 137 gramos de peso cardíaco.Después de transferir el corazón aislado a un sistema Langendorff, la frecuencia cardíaca se estabiliza a unos 70 latidos por minuto dentro de aproximadamente 10 minutos de desfibrilación y permanece constante durante toda la duración del estudio. Normalmente se mide un caudal medio de aproximadamente 184 mililitros por minuto. Se ralentiza a 70 mililitros por minuto después de perfumar con el medio calentado que contiene un desacoplador mecánico.El plomo de dos ECG se puede registrar a lo largo de la duración del estudio durante el ritmo sinusal o en respuesta al ritmo externo para cuantificar los parámetros electrofisiológicos. Los experimentos de mapeo óptico también se pueden realizar durante el ritmo sinusal y la fibrilación ventricular espontánea. Se pueden obtener imágenes representativas de un corazón cargado de tinte con los potenciales de acción óptica correspondientes.Y los transitorios de calcio se pueden recoger de dos regiones de interés en la superficie epicardial. Además, el ritmo epicardial dinámico se puede utilizar durante los experimentos de mapeo óptico para normalizar cualquier ligera diferencia en las frecuencias cardíacas intrínsecas. Las señales crudas se pueden utilizar para representar el tiempo de acoplamiento transitorio de calcio potencial de acción, el tiempo de activación y duración, y la restitución eléctrica y de calcio.Es importante evitar permitir que las burbujas entren en la aorta, minimizar el tiempo de transferencia del animal al sistema, y para apoyar el corazón más grande. La electrofisiología y los datos de señales ópticas se pueden analizar después de la adquisición. Además, el corazón se puede conservar después del estudio para la histología, inmunosupresión o análisis de expresión génica.Estamos usando esta técnica para caracterizar el desarrollo cardíaco juvenil y examinar el impacto de las exposiciones ambientales en la fisiología cardíaca. Los desacopladores mecánicos utilizados para minimizar el movimiento y los productos químicos antiespumantes utilizados para abordar la espuma de albúmina son tóxicos, por lo que el uso del equipo de protección personal adecuado es absolutamente esencial.

optocardiography-electrophysiology-studies-ex-vivo-langendorff

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

En este artículo se describe una técnica de alta resolución temporal y espacial de la imagen ópticamente movimiento de acción potencial en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos con un tinte potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

Este informe proporciona una descripción detallada de la metodología y los resultados del mapeo simultáneo óptico endocárdico y epicárdico de excitación eléctrica de la aurícula izquierda intacta de un corazón de oveja Langendorff perfundidos durante el estiramiento inducido por fibrilación auricular.

Cartografía de alta resolución óptica endocárdicos y epicárdicos en un modelo de ovejas inducidas por el estiramiento de la fibrilación auricular

En este artículo se describen los procedimientos básicos para la realización de experimentos ópticos de asignación en el corazón de conejo Langendorff perfundidos con el sistema de imágenes panorámicas, y el doble (voltaje y calcio) modalidad de imagen.

Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos

En este video, realizamos la perfusión retrógrada de Langendorff de un corazón de ratón aislado. Durante el procedimiento, la actividad cardíaca del corazón se mantiene perfundiéndolo retrógradamente con una solución de perfusión a través de las arterias coronarias mediante una cánula insertada en la aorta ascendente. El modelo se utiliza para estudiar la fisiopatología cardíaca del corazón.

Perfusión cardíaca retrógrada de Langendorff: una técnica ex vivo para perfundir corazón de ratón aislado

La mayoría de los estudios que involucran el aparato de Langendorff utilizan modelos de animales pequeños debido a la mayor complejidad de los sistemas para mamíferos más grandes. Describimos un sistema de Langendorff para modelos de animales grandes que permite su uso en una amplia gama de especies, incluidos los humanos, y una adquisición de datos relativamente fácil.

Un sistema de trabajo del corazón aislada por grandes modelos animales

Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de atria murino utilizando un sistema de mapeo óptico con una alta resolución espacial y temporal, incluyendo grabaciones duales de la tensión de la membrana y Ca2 + transitoria bajo programado estimulación a través de un catéter electrodo especializados.

Evaluación electrofisiológica de Atria murino con mapeo óptico alta resolución

Aquí, presentamos un protocolo para la modulación del sistema de nervioso autónomo intracardiaca y la evaluación de su influencia en la electrofisiología básica, arritmogénesis y campo dinámica utilizando una configuración de Langendorff ex vivo .

Impacto de las neuronas intracardiacas sobre la electrofisiología cardíaca y arritmogénesis en un sistema de Langendorff Ex Vivo

El presente protocolo describe la canulación aórtica y la perfusión retrógrada del corazón murino neonatal ex vivo .  Una estrategia de dos personas, utilizando un microscopio de disección y una aguja de calibre pequeño embotada, permite una canulación confiable. La cuantificación de la tensión contráctil longitudinal se logra utilizando un transductor de fuerza conectado al ápice del ventrículo izquierdo.

Técnica modificada para el uso de corazones murinos neonatales en la preparación de Langendorff

El presente protocolo describe métodos para la expresión transgénica en corazones de rata y ratón mediante inyección intramiocárdica directa del virus bajo guía ecocardiográfica. Los métodos para la evaluación de la susceptibilidad de los corazones a las arritmias ventriculares mediante la estimulación eléctrica programada de corazones aislados, perfundidos con Langendorff, también se explican aquí.

Expresión de transgenes virales en corazones de roedores y la evaluación del riesgo de arritmia cardíaca

Aquí se presenta un protocolo para cuantificar de forma fiable la función ventricular derecha e izquierda de los corazones de donantes después de la conservación en frío utilizando un sistema de perfusión ex vivo .

Evaluación de la función biventricular murina ex vivo en un modelo de Langendorff

El cribado de la enfermedad de las arterias coronarias podría aumentar la obtención de corazones de donantes con criterios ampliados. En este trabajo se describe un protocolo para realizar una angiografía coronaria reproducible durante la perfusión cardíaca ex situ en un modelo porcino.

Angiografía coronaria durante la perfusión cardíaca ex situ en un modelo porcino

Aprende optocardiografía y electrofisiología en corazones porcinos aislados mediante perfusión Langendorff. Este método combina mapeo óptico dual con estudios electrofisiológicos para investigar la dinámica cardíaca en modelos translacionales.

Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff

Explorar más videos