Name: Evaluación electromecánica de la actividad de cardiomiocitos moduladas optogenéticamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Aprende a evaluar los efectos electromecánicos de la fotoactivación de GtACR1 en cardiomiocitos de conejo mediante técnicas de patch-clamp y fibra de carbono. Este protocolo permite analizar funciones eléctricas y mecánicas celulares.

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Agradecemos a Stefanie Perez-Feliz por su excelente asistencia técnica, Dr. Jonas Wietek (Universidad DeHumboldt, Berlín, Alemania) por proporcionar el plásmido pUC57-GtACR1, el Prof. Dr. Michael Schupp (Charité- Universidad de Berlín, Instituto de Farmacia, Berlín) para la producción de adenovirus y la Dra. Anastasia Khokhlova (Universidad Federal de los Urales) por compartir su experiencia para mejorar el protocolo de aislamiento celular y rediseñar la El proyecto fue financiado por la Fundación Alemana de Investigación (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Beca Emmy-Noether: SCHN1486/2-1) y el ERC Advanced Grant CardioNECT.

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<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
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<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+light-gated+anion+channels%3A+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li>
<li>Mohamed, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+inhibition+of+larval+zebrafish+behaviour+with+anion+channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Optical inhibition of larval zebrafish behaviour with anion channelrhodopsins.</a> BMC Biology. 15 (1), 103(2017).</li>
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<li>Govorunova, E. G., Cunha, S. R., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+channelrhodopsins+for+inhibitory+cardiac+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Anion channelrhodopsins for inhibitory cardiac optogenetics.</a> Scientific Reports. 6, 33530(2016).</li>
<li>Kopton, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Electrophysiological+Effects+of+Light-Activated+Chloride+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac Electrophysiological Effects of Light-Activated Chloride Channels.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1806(2018).</li>
<li>Peyronnet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Load-dependent+effects+of+apelin+on+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Load-dependent effects of apelin on murine cardiomyocytes.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 333-343 (2017).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mientras que las herramientas optogenéticas permiten la modulación de la electrofisiología celular excitable de una manera no invasiva, necesitan una caracterización exhaustiva en diferentes tipos de células (por ejemplo, CM) para permitir que uno elija la mejor herramienta disponible para un diseño experimental específico. La técnica de abrazadera de parche es un método estándar para evaluar la electrofisiología celular. En la configuración de células enteras, permite grabar corrientes fotoactivadas a través de la membrana plasmática o cambios temporales en el voltaje de la membrana después de la estimulación/inhibición de la luz. La manipulación optogenética de la excitación eléctrica también afecta a las contracciones de CM. Utilizamos el seguimiento de sarcomere y las mediciones de fuerza asistida por fibra de carbono para cuantificar los efectos del interrogatorio óptico en la actividad mecánica de los miocitos.
Describimos un protocolo para caracterizar los efectos básicos de un canal de cloruro ligero, GtACR1, en CM. Como sistema modelo, elegimos el conejo CM, ya que sus características electrofisiológicas (por ejemplo, forma AP y período refractario) se asemejan más a las observadas en CM humano más cercano que a los roedores CM. Además, el conejo CM se puede cultivar durante varios días, el tiempo suficiente para la administración adenoviral y la expresión de GtACR1-eGFP. En particular, el CM aislado cambia sus propiedades estructurales en el cultivo a lo largo del tiempo, incluyendo el redondeo de terminaciones celulares y la pérdida gradual de estrías cruzadas, sistema T-tubular y caveolas23,24. En línea con esto, se han reportado alteraciones funcionales en CM cultivado: despolarización del potencial de membrana en reposo, prolongación de la AP y cambios en el manejo celular De2+. Para una revisión de las adaptaciones celulares en la cultura, consulte Louch et al.25. La Figura Suplementaria 2 muestra las mediciones ejemplares DE AP y de contracción de CM recién aislado para la comparación con las observadas en CM cultivado(Figura 6, Figura 7)utilizando el protocolo aquí presentado.
Las grabaciones de abrazaderas de parche de células enteras permiten mediciones directas de las propiedades fotocorrientes (por ejemplo, amplitudes y cinética) y cambios inducidos por la luz en el potencial de membrana o las características de AP a alta resolución temporal. Sin embargo, tales grabaciones tienen varias limitaciones: En primer lugar, el citosol es reemplazado por la solución de pipeta en grabaciones de células enteras, lo que es ventajoso para controlar gradientes electroquímicos iónicos, pero tiene la desventaja intrínseca de lavar orgánulos celulares, proteínas y otros compuestos, lo que potencialmente afecta a las respuestas eléctricas celulares. En segundo lugar, los efectos secundarios como la activación de canales iónicos adicionales resultantes de la despolarización no fisiológicamente larga (por ejemplo, constantes de tiempo lento de los canales iónicos bloqueados por la luz) son difíciles de evaluar, ya que nuestro método sólo permite detectar cambios en el TPA, pero no realizar mediciones directas de las concentraciones iónicas en compartimentos celulares electrofisiológicamente relevantes. Esto podría hacerse con indicadores fluorescentes (por ejemplo, sensores Ca2+) o electrodos selectivos de iones. La caracterización adicional puede incluir valoraciones de intensidad de la luz, determinación de la dependencia del pH, cinética fotocorriente en diferentes potenciales de membrana y cinética de recuperación durante la estimulación de la luz repetitiva.
A diferencia de las grabaciones de abrazaderas de parche, las mediciones de fuerza de una sola célula permiten el análisis de las contracciones celulares de los miocitos intactos sin afectar su entorno intracelular. Los efectos secundarios sobre las concentraciones iónicas (por ejemplo, Ca2+) pueden evaluarse indirectamente determinando la amplitud y la dinámica de fuerza generadas (por ejemplo, la velocidad máxima de contracción y relajación; aquí no analizada). Las mediciones de fuerza con la técnica de fibra de carbono tienen una ventaja sobre las células que se contraen libremente, ya que proporcionan información directa sobre las fuerzas pasivas y activas en las células precargadas (es decir, en condiciones más similares a las configuraciones in situ o in vivo). La precarga mecánica es especialmente importante a la hora de analizar la contractilidad celular, ya que el estiramiento afecta a la producción de fuerza y la relajación26,27.
Los enfoques optogenéticos permiten una manipulación naturalmente precisa del potencial de la membrana celular, tanto en un solo CM como en el tejido cardíaco intacto. Clásicamente, ChR2, un canal no selectivo de cationes ligeros, se ha utilizado para la despolarización del potencial de membrana, mientras que las bombas de protones y/o cloruro impulsadas por la luz se utilizaron para la hiperpolarización de membranas. Ambos grupos de actuadores optogenéticos requieren altos niveles de expresión, ya que ChR2 se caracteriza por una conductividad de un solo canal intrínsecamente baja28 y bombas accionadas por luz transportan al máximo un ion por fotón absorbido. Además, la activación prolongada de ChR2 en CM puede dar lugar a sobrecarga Na+ y/o Ca2+, y las bombas accionadas por luz pueden cambiar trans-sarcolem H+ o Cl- gradientes29,30. En busca de herramientas alternativas para el control optogenético de la actividad de CM, recientemente probamos el anión natural channelrhodopsin GtACR1, caracterizado por una conductancia de un solo canal superior y una mayor sensibilidad a la luz en comparación con el Catión ChR como ChR2. Encontramos que la activación GtACR1 despolariza CM y se puede utilizar para el ritmo óptico y la inhibición, dependiendo de la sincronización del pulso de luz y la duración. Una ventaja adicional de usar ACR en lugar de cation ChR podría ser el potencial de inversión más negativo de Cl- en comparación con Na+, reduciendo las corrientes iónicas introducidas artificialmente. Como hemos demostrado anteriormente, el ritmo óptico con GtACR1 puede conducir a la prolongación de AP como resultado del componente lento del cierre del canal GtACR1, que podría ser superado mediante el uso de mutantes GtACR1 más rápidos19. Sin embargo, la prolongación de AP es mucho menos pronunciada cuando se utiliza unaconcentración de Cl intracelular más baja y fisiológica (ver Figura 6). Por otra parte, la inhibición mediada por GtACR1 por iluminación prolongada da como resultado una profunda despolarización de la membrana, que de nuevo podría activar la afluencia secundaria Na+ y Ca2+, alterando así la actividad de los canales cerrados por voltaje. En nuestras mediciones, encontramos que los parámetros AP y de contracción se recuperan a la línea de base dentro de 40 s después de una inhibición inducida por la luz durante 1 min (véase Kopton et al. 2018, Figura 6, Figura 7). Los canales K+ con cierre ligero ofrecen una potente alternativa para silenciar CM sin afectar al potencial de membrana de reposo DE CM31.
En el futuro nos gustaría comparar cuantitativamente diferentes herramientas optogenéticas por su potencial para inhibir la actividad cardíaca. Con este fin, probamos una variedad de canales de iones con luz, incluyendo ACR, ChR2 y variantes ChR de cambio rojo32,así como actuadores hiperpolarizantes como halorhodopsin o el bPAC adenil cyclase cerrado con luz en combinación con el canal de potasio SthK (PAC-K)31.
El protocolo aquí presentado se puede utilizar para la caracterización en profundidad de las propiedades electromecánicas de CM. Es principalmente aplicable también a CM de otras especies, y a CM aislado de miocardio enfermo. La estimulación óptica permite que uno tome el ritmo CM a diferentes frecuencias, y se pueden probar diferentes precargas durante los experimentos de contracción de fibra de carbono. Un experimento interesante sería utilizar la iluminación de baja intensidad para la despolarización de los subumbrales, para imitar el aumento gradual en el potencial de la membrana en reposo, como se puede observar durante el desarrollo de la remodelación del tejido cardíaco durante la progresión de la enfermedad. Por último, las mediciones funcionales podrían combinarse con imágenes Ca2+ para obtener más información sobre el acoplamiento excitación-contracción, o con intervenciones farmacológicas para evaluar los efectos de diferentes fármacos en la actividad de CM.

Las fotocorrientes mediadas por ChR se registraron por primera vez en la mancha ocular de las algas verdes unicelulares1,2. Poco después de la clonación genética y la expresión heteróloga de Chlamydomonas reinhardtii ChR1 y ChR2, se utilizaron ChR como herramientas para alterar el potencial de membrana en los ovocitos de Xenopus y las células de mamíferos por la luz3,4. Cación chR no selectivo despolarizar la membrana de las células con un potencial de membrana en reposo que es negativo al potencial de inversión de ChR. Por lo tanto, se pueden utilizar para obtener AP en células excitables, incluyendo neuronas y CM, permitiendo el ritmo óptico5,6.
Complementarios a la cación ChR, protones accionados por la luz, bombas de cloruro y sodio7,8,9 se han utilizado para inhibir la actividad neuronal10,11,12. Sin embargo, estos últimos tienen limitaciones, que requieren altas intensidades de luz e iluminación sostenida, ya que un ion se transporta por fotón absorbido. En 2014, dos estudios independientes de Wietek et al. y Berndt et al. describieron la conversión de ChR conductor catiónico en ACR a través de mutaciones en el poro del canal13,14. Un año más tarde, el ACR natural fue descubierto en el criptofito Guillardia theta (GtACR)15. Como el ACR de ingeniería mostró conductividad catiónica residual, fueron reemplazados por ACR natural, caracterizado por una gran conductancia de un solo canal y alta sensibilidad a la luz15. GtACR se utilizaron para silenciar la actividad neuronal polarizando el potencial de membrana hacia el potencial de reversión del cloruro16,17. Govorunova et al. aplicaron GtACR1 a la rata cultivada ventricular CM y mostraron fotoinhibición eficiente a niveles de intensidad de luz bajos que no eran suficientes para activar las herramientas de inhibición previamente disponibles, como la bomba de protones Arch18. Nuestro grupo informó recientemente que la fotoinhibición mediada por GtACR1 de CM se basa en la despolarización y que GtACR1 también se puede utilizar, por lo tanto, para el ritmo óptico de CM19.
Aquí, presentamos un protocolo para estudiar los efectos electrofisiológicos y mecánicos de la fotoactivación GtACR1 en el cm ventricular del conejo cultivado. Primero describimos el aislamiento celular, el cultivo y la transducción. Los efectos electrofisiológicos se miden utilizando grabaciones de abrazaderas de parche de células enteras. Las corrientes mediadas por luz a una tensión de membrana determinada se evalúan en modo de abrazadera en V. La dinámica del potencial de membrana se mide mientras se pisa eléctrica u ópticamente CM (modo I-clamp). La inhibición óptica de AP activado eléctricamente se prueba utilizando una aplicación de luz sostenida. Los efectos mecánicos se miden utilizando fibras de carbono en combinación con el seguimiento basado en imágenes de la longitud del sarcomere. Para ello, las células ópticamente pacebles se precargan mecánicamente mediante la fijación de dos fibras de carbono a la membrana plasmática cerca de los extremos de las células opuestas. Los cambios en la longitud de Sarcomere se registran durante el ritmo óptico o eléctrico. Finalmente, la fotoinhibición se mide durante la estimulación eléctrica del campo de las células, y se analizan las fuerzas generadas.
El protocolo incluye los siguientes pasos que se muestran en el diagrama de flujo en la Figura 1:anestesia profunda de conejo, inyección de sobredosis tiopental, escisión cardíaca, digestión de langendorff y tejido, disociación mecánica del tejido para liberar células, análisis microscópico del rendimiento de CM, cultivo de CM, transducción con adenovirus tipo 5, seguido de incubación y experimentos funcionales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig1a.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo del protocolo utilizado para obtener CM eléctrica y ópticamente paceble. Los corazones se extirpan de conejos de 9-10 semanas de edad, y el tejido cardíaco se digiere mientras se perfunde usando una configuración de Langendorff. Las células se liberan por agitación mecánica. El rendimiento CM se cuenta bajo un microscopio. CM son cultivados, transducidos con adenovirus tipo 5 y los experimentos funcionales se realizan 48-72 horas después de la transducción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig1alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Equipment - Aislamiento celular/Cultivo/Transducción</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adeno-X Adeno-Viral System 3 CMV</td><td>TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, EE. UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>cánula aórtica</td><td>Radnoti</td><td></td><td>4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L</td></tr><tr><td>mm Cubreobjetos y barra diagonal; 16 mm, espesor n.º 0</td><td>VWR International GmbH, Lovaina, Bélgica</td><td>631-0151</td><td>Vidrio de borosilicato</td></tr><tr><td>Griffin Silk, negro, 2 m de longitud, tamaño 3, 0,5 mm</td><td>Samuel Findings, Londres, Reino Unido</td><td>Incubadora TSGBL3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>New Brunswick, Eppendorf, Sch&ouml; nenbuch, Suiza</td><td>Galaxy 170S</td><td></td></tr><tr><td>Langendorff-perfusion set-up</td><td>Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbl&auml; serei, Friburgo, Alemania</td><td></td><td>Bomba Langendorff hecha a medida</td></tr><tr><td></td><td>Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Z&uuml; rico, Suiza</td><td>ISM444</td><td></td></tr><tr><td>Malla: Tela filtrante de nailon Monodur</td><td>Cadisch Precision Meshes Ltd</td><td></td><td>800 &micro; m agujeros, 1 m de ancho</td></tr><tr><td>Cámara Neubauer</td><td>VWR International GmbH, Lovaina, Bélgica</td><td>717806</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit, Nueva Zelanda White</td><td>Charles River</td><td>Código de cepa: 052</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Alemania</td><td>BC774R</td><td>Bauchdeckenschere ger. 18cm</td></tr><tr><td>Filtro estéril, 0,22 y micro; m</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Equipment - Patch-clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplfier</td><td>AxonInstruments, Union City, CA, Estados Unidos</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip &oslash; 50 mm, Espesor n.º 1</td><td>VWR International GmbH, Lovaina, Bélgica</td><td>631-0178</td><td>Digitalizador de vidrio de borosilicato</td></tr><tr><td>Axon Digidata</td><td>Molecular Devices, San José, CA, Estados Unidos</td> Filtro <td>1550A</td><td></td></tr><tr><td>(530/20)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania</td><td>11513878</td> Filtro <td>BZ:00</td></tr><tr><td>(630/20)</td><td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, Estados Unidos</td><td>227155</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>AxonInstruments, Union City, CA, Estados Unidos</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Interface</td><td>Scientifica, Uckfield, Reino Unido</td><td>1U Rack, 352036</td><td></td></tr><tr><td>LED 525 nm</td><td>Luminus Devices, Sunnyvale, CA, Estados Unidos</td><td>PT-120-G</td><td></td></tr><tr><td>Software de control LED</td> Investigación <td>y desarrollo de Essel, Toronto, Canadá</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de control LED</td><td>a medida</td> Extractor de <td></td><td></td></tr><tr><td>micropipetas</td><td>Narishige Co., Tokio, Japón</td><td>Microscopio PP-830</td><td></td></tr><tr><td>invertido</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador motorizado</td><td>Scientifica, Uckfield, Reino Unido</td> Medidor de potencia óptica <td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs, Newton, NJ, Estados Unidos</td> Grasa de silicona <td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RS Components, Corby, Reino Unido</td><td>494-124</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de plata</td><td>A-M Systems, Sequim, WA, Estados Unidos</td><td>787500</td><td>Plata, Desnudo 0.015'', Recubierto 0.0190'', Longitud 25 Pies Capilares</td></tr> de <tr><td>vidrio sódico-cálcico</td><td>Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Dinamarca</td><td>160213 BRIS, ISO12772</td><td>1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm</td></tr><tr><td>Software Axon pClamp</td><td>Molecular Devices, San José&eacute;, CA, Estados Unidos</td><td>Versión 10.5</td><td></td></tr><tr><td>Software MatLab2017</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micrómetro de etapa</td><td>Graticules Optics LTD, Tonbridge, Reino Unido</td><td>1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Equipment - Fibra de carbono</fibras ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>carbono</td><td>fuertes proporcionadas por el Prof. Jean-Yves Le Guennec</td><td></td><td>BZ:00</td></tr><tr><td>Digitizador Axon Digidata</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Estados Unidos</td><td>Filtro 1550B</td><td></td></tr><tr><td>(530/20)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania</td><td>11513878</td><td></td></tr><tr><td>Filtro (630/20)</td><td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, Estados Unidos</td><td>227155</td><td></td></tr><tr><td>Interfaz del sistema de fluorescencia</td><td>IonOptix, Milton, MA Estados Unidos</td><td>FSI-800</td><td>2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm</td></tr><tr><td>Sistema de transductor de fuerza</td><td>Aurora Scientific Inc., Ontario, Canadá</td><td>406A</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio para fuerza mediciones</td><td>Aparato de Harvard, Holliston, Massachusetts, Estados Unidos</td><td>Interfaz GC200F-10</td><td></td></tr><tr><td>National Instruments</td><td>National Instruments, Budapest, Hungría</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>LED 525 nm</td><td>Luminus Devices, Sunnyvale, CA, Estados Unidos</td><td>Caja de control LED PT-120-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Investigación y desarrollo de Essel, Toronto, Canadá</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control LED sistema</td><td>a</td><td></td><td></td>medida</tr><tr><td>Microcontrolador</td><td>Parallax Inc., Rocklin, California, Estados Unidos</td><td>Tirador de micropipetas de hélice</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige Co., Tokio, Japón</td> Microscopio <td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>invertido</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>Cámara MyoCam-S</td><td>IonOptix, Dublín, Irlanda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara MyoCam-S Power</td><td>IonOptix, Milton, MA, Estados Unidos</td><td>MCS-100</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador de campo MyoPacer</td><td>IonOptix Cooperation, Milton, MA, Estados Unidos</td><td>MYP100</td><td></td></tr><tr><td>Piezo Motor</td><td>Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>E-501.00</td><td></td></tr><tr><td>Grasa de silicona</td><td>RS Components, Corby, Reino Unido</td><td>494-124</td><td></td></tr><tr><td>Software Axon pClamp</td><td>Molecular Devices, San José&eacute;, CA, Estados Unidos</td><td>Versión 10.5</td><td></td></tr><tr><td>Software IonWizard</td><td>IonOptix, Dublín, Irlanda</td><td>Versión 6.6.10.125</td><td></td></tr><tr><td>Software MatLab2017</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micrómetro de etapa</td><td>Retículas Optics LTD, Tonbridge, Reino Unido</td><td>1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>A9251-100G</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Honeywell Fluka, Muskegon, MI, EE. UU.</td><td>21114-1L</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de L-Carnitina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>C9500-25G</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo 2, 315 U/mg</td><td>Worthington, Lakewood, NJ, EE. UU.</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Creatina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>C0780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Citosina-&beta;- D-arabinofuranósido</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de esketamina, Ketanest S 25 mg/mL</td><td>Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlín, Alemania</td><td>PZN-07829486</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina 50 mg/mL</td><td>Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Heparina-Sodio, 5,000 UI/mL</td><td>Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemania</td><td>PZN-03029843</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Insulina (bovina páncreas)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>I6634-50MG</td><td></td></tr><tr><td>K-aspartato</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>A6558-25G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR International GmbH, Lovaina, Bélgica</td><td>26764.260</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Honeywell Fluka, Muskegon, MI, EE. UU.</td><td>35113-1L</td><td></td></tr><tr><td>Laminina de Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma murino membrana basal</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>M199-Medio</td><td>Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>A9187-1G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>63069-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific, Loughborough, Leics., Reino Unido</td><td>10428420</td><td></td></tr><tr><td>NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-L&ouml; sung 0.9%</td><td>Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemania</td><td>3200950</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>AppliChem GmbH, Darmstadt, Alemania</td><td>A6579</td><td>sin Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Na-pyruvat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>P2256-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Poli(2-hidroxietil metacrilato)</td><td>Sigma, Poole, Reino Unido</td><td>192066</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa XIV de Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>P5147-1G</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>T0625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental Inresa 0.5 g</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH, Friburgo, Alemania</td><td>PZN-11852249</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de xilacina, Rompun 2%</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemania</td><td>PZN-01320422</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación electromecánica de la actividad de cardiomiocitos moduladas optogenéticamente

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

En las últimas dos décadas, las herramientas optogenéticas se han establecido como medios potentes para modular la actividad específica del tipo celular en los tejidos excitables, incluido el corazón. Mientras que Channelrhodopsin-2 (ChR2) es una herramienta común para despolarizar el potencial de membrana en cardiomiocitos (CM), potencialmente provocando potenciales de acción (AP), una herramienta eficaz para el silenciamiento confiable de la actividad de CM ha faltado. Se ha sugerido utilizar aniones canalrhodopsins (ACR) para la inhibición optogenética. Aquí, describimos un protocolo para evaluar los efectos de la activación del ACR GtACR1 natural de Guillardia theta en conejo cultivado CM. Las lecturas primarias son grabaciones electrofisiológicas de abrazaderas de parche y seguimiento óptico de las contracciones de CM, ambas realizadas mientras se aplican diferentes patrones de estimulación de la luz. El protocolo incluye aislamiento CM del corazón del conejo, sembración y cultivo de las células durante un máximo de 4 días, transducción a través de la codificación de adenovirus para el canal de cloruro cerrado a la luz, preparación de configuraciones de abrazaderas de parche y fibra de carbono, recopilación y análisis de datos. El uso de la técnica de abrazadera de parche en la configuración de células enteras permite grabar corrientes activadas por la luz (en modo de abrazadera de voltaje, abrazadera en V) y AP (modo de abrazadera de corriente, I-clamp) en tiempo real. Además de los experimentos con abrazaderas de parches, realizamos mediciones de contractilidad para la evaluación funcional de la actividad de CM sin alterar el entorno intracelular. Para ello, las células se precargan mecánicamente utilizando fibras de carbono y las contracciones se registran mediante el seguimiento de los cambios en la longitud del sarcomere y la distancia de la fibra de carbono. El análisis de datos incluye la evaluación de la duración de AP a partir de grabaciones de abrazaderas I, corrientes máximas de grabaciones de abrazadera en V y cálculo de fuerza a partir de mediciones de fibra de carbono. El protocolo descrito se puede aplicar a las pruebas de efectos biofísicos de diferentes actuadores optogenéticos en la actividad de CM, un requisito previo para el desarrollo de una comprensión mecanicista de experimentos optogenéticos en tejido sorcardíaco y corazones enteros.

GtACR1-eGFP se expresó en conejo cultivado CM(figura 6 inserto) y las fotocorrientes se midieron con la técnica de abrazadera de parche. La fotoactivación de GtACR1 muestra grandes corrientes dirigidas hacia adentro a -74 mV. En la Figura 6Una corriente pico(IP) a 4 mW/mm2 es 245 pA. AP se activó eléctricamente(Figura 6B)o ópticamente(Figura 6C) con inyecciones de corriente 1,5 veces el umbral, o pulsos de luz despolarizantes cortos de 10 ms, respectivamente. Analizando los valores de APD, el CM de ritmo eléctrico muestra un APD 20 de 0,24 a 0,08 s y un APD 90 de 0,75 a 0,17 s, mientras que los CM de ritmo óptico muestran un APD 20 de 0,31 a 0,08 s y un APD 90 de 0,81 a 0,19 s (SE, n a 5, N a 2, en el ejemplo aquí presentado APD 20eléctrico a 0,17 s; APD 20óptico s 0,27 s y APD 90eléctrico a 0,61 s; APD 90óptico a 0,68 s; Figura 6D). El CM de ritmo óptico muestra un inicio AP más lento(figura 6D). La activación de CM se inhibió al iluminarse sostenidamente (para 64 s, 4 mW/mm2) mediante la polarización del potencial de membrana hacia el potencial de inversión del cloruro, aquí -58 mV(Figura 6E). Las inyecciones de corriente más altas que 1,5 veces el umbral no profunden la generación AP(Figura 6F). Las fuerzas máximas generadas se determinaron a partir de la flexión de la fibra de carbono(Figura 7B,C,E). El CM generó 232 n/mm2 al ritmo eléctrico(Figura 7B)y 261 n/mm2 después del ritmo óptico(Figura 7C). Los pulsos prolongados de luz verde inhiben las contracciones(Figura 7E). Después de la inhibición óptica durante 64 s, las contracciones recurrentes generan una menor fuerza contráctil, y los valores de fuerza se recuperan hacia la línea de base después de 10 contracciones de 10 euros (ritmo a 0,25 Hz, Figura 7D)en consonancia con la pérdida de calcio diastólica de la CM de conejo.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig6a.jpg"> Figura 6: Grabaciones representativas de abrazaderas de parche de CM eléctricos y ópticamente ritmo/inhibido. (A) Fotocorriente representativa a -74 mV utilizando un pulso de luz de 300 ms, 4 mW/mm2. IP indica la corriente máxima. La plaquita muestra una celda positiva GtACR1-eGFP. (B) Registro REPRESENTATIVO AP a 0 pA utilizando una rampa de corriente de 10 ms, 0,6 nA para acelerar eléctricamente el CM. (C) Registro REPRESENTATIVO AP a 0 pA utilizando pulsos de luz de 10 ms, 0,4 mW/mm2. (D) El gráfico superior muestra la superposición del10o AP de CM activado eléctricamente (azul) y óptico (verde) se alinearon por el cambio máximo en el potencial de membrana (dV/dt max). El gráfico inferior muestra la diferencia del potencial de membrana entre AP activado óptica y eléctricamente(Eóptica-Eeléctrica). (E) Los AP activados eléctricamente se inhibiron bajo una luz sostenida de 64 s, 4 mW/mm2. (F) AP se inhiben por inyecciones de corriente más altas que 1,5 veces el umbral (de 0,7 nA en pasos de 0,1 nA a 2,2 nA) bajo luz sostenida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig6alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig7a.jpg"> Figura 7: Datos representativos de las grabaciones de fibra de carbono de CM óptica y eléctricamente acelerado/inhibido. (A) Visualizar en el software de adquisición de datos. La imagen (I) muestra el CM medido con la ventana para calcular la longitud del sarcomere. El ancho de celda está etiquetado en naranja. (1) Rango de frecuencias relevantes. (2) El espectro de potencia FFT muestra la frecuencia del espaciado del sarcomere en la célula. La longitud media del sarcomere se calcula a partir de la frecuencia máxima. (3) Ventana de seguimiento de la longitud de Sarcomere. (4) Traza de intensidad. (5) El rastro de intensidad multiplicado por una ventana Hamming es el rastro de intensidad de ventana. Esquema (II) muestra la sección elíptica de la célula. Ancho en naranja y espesor en azul discontinuo. La imagen (III) muestra la posición de las fibras de carbono con las respectivas cajas de detección, dejadas en rojo y derecha en verde. (6) Traza de intensidad. (7) Primera derivada de la traza de intensidad (véase el manual del software de adquisición de datos). (B) Rastro representativo de contracciones provocada eléctricamente. El Panel (I) muestra el acortamiento de la longitud del sarcomere, panel (II) la distancia entre las dos fibras de carbono. (C) Rastro representativo de contracciones provocadas ópticamente (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2). El Panel (I) muestra el acortamiento de la longitud del sarcomere, panel (II) la distancia entre las dos fibras de carbono. (D) Fuerza pico generada de la contracción 1 a 11 después de una pausa causada por la inhibición de la generación AP. (E) Rastro representativo de la inhibición óptica de las contracciones bajo iluminación sostenida (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2). El Panel (I) muestra el acortamiento de la longitud del sarcomere, panel (II) la longitud entre las dos fibras de carbono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig7alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Un</td>
			<td>Área</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acr</td>
			<td>anión channelrhodopsin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ap</td>
			<td>potencial de acción</td>
		</tr>
<tr>
<td>Apd</td>
			<td>duración potencial de la acción</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ufc</td>
			<td>unidad formadoras de colonias</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chr</td>
			<td>channelrhodopsin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cm</td>
			<td>cardiomiocito</td>
		</tr>
<tr>
<td>eGFP</td>
			<td>proteína fluorescente verde mejorada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Esd</td>
			<td>fin de la deformación de la célula sistólica</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ue</td>
			<td>unidades de endotoxina</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>Fuerza</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fft</td>
			<td>rápida transformación de Fourier</td>
		</tr>
<tr>
<td>GtACR</td>
			<td>Guillardia theta anion channelrhodopsin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gui</td>
			<td>interfaz gráfica de usuario</td>
		</tr>
<tr>
<td>I-clamp</td>
			<td>actual-clamp</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iu</td>
			<td>unidades internacionales</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moi</td>
			<td>multiplicidad de infección</td>
		</tr>
<tr>
<td>poli-HEMA</td>
			<td>poli(2-hidroxietilo metacrilato)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Abrazadera en V</td>
			<td>tensión-pinza</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 5: Lista de abreviaturas.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1a.jpg"> Figura suplementaria 1: Mediciones de intensidad de la luz con medidor de potencia óptica. (A) Medición de pulsos de luz de 10 ms a 4 mW/mm2. (B) Medición de la iluminación sostenida de 64 s a 4 mW/mm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2a.jpg"> Figura suplementaria 2: Propiedades del CM recién aislado y su adaptación estructural en el cultivo. (A) Registro AP de un CM recién aislado (APD 20 de 1,11 a 0,34 s, APD 90 de 1,96 a 0,32 s, n a 7, N a 2). Potencial medio de la membrana en reposo de -79,3 a 0,8 mV (n a 7, n a 2). (B) Registro de fibra de carbono de un CM recién aislado de ritmo eléctrico. (C) Imágenes confocales de un CM (I) recién aislado; no transducido (II) y transducido (III) CM después de 48 horas en cultivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Material Suplementario: Secuencia de comandos MatLab para determinar el TPA y el potencial de membrana en reposo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/SupplementalMaterial.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Presentamos un protocolo para evaluar los efectos electromecánicos de la activación de GtACR1 en cardiomiocitos de conejo. Proporcionamos información detallada sobre el aislamiento celular, el cultivo y la transducción adenoviral, y sobre experimentos funcionales con las técnicas de abrazadera de parche y fibra de carbono.

Evaluación electromecánica de la actividad de cardiomiocitos moduladas optogenéticamente

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

El uso del protocolo como un efecto biofísico de diferentes actuadores optogenéticos en la actividad cardiomiocitos se puede probar para ayudar en el desarrollo de experimentos optogenéticos en el tejido cardíaco y corazones enteros. Mediante la combinación de la técnica de abrazadera de parche con el seguimiento de sarcomere y mediciones de fuerza asistida de fibra de carbono, podemos estudiar los efectos de la fotoactivación GtACR1 en la electricidad y la mecánica de los cardiomiocitos ventriculares. La inhibición optogenética se puede utilizar potencialmente para la desfibrilación óptica.GtACR1 es una herramienta optogenética que permite silenciar la actividad cardiaca. Esta técnica es totalmente aplicable a otros campos de investigación como los estudios de células musculares lisas y unicelulares. Aunque este protocolo no se puede utilizar para el cribado de alto rendimiento, proporciona un medio para el análisis integral de la función eléctrica y mecánica de cardiomiocitos.Así que como dice el dicho, una imagen dice más de mil palabras. ¿Cuánta información más podemos transmitir en vídeo? Algunas de nuestras herramientas y técnicas involucradas en el estiramiento de miocitos individuales y en la preparación de la sonda son altamente intrincadas y es mucho más fácil transmitirlas en un video en comparación con una descripción.Después de que la sangre se haya lavado del corazón con perfuma salino de un conejo blanco neozelandés de nueve a 10 semanas de edad, cambie el perfundato a una solución baja en calcio y alto contenido de potasio y perfuma el corazón durante dos minutos más después de que el corazón deje de latir. Perfunda la solución enzimática, comienza a recircular la solución enzimática de nuevo en el depósito después de dos minutos de digestión, y disminuye la velocidad a 16 mililitros por minuto después de cinco minutos de digestión. Una vez que el tejido aparece suave después de 40-50 minutos de digestión, cortar el corazón de la cánula e inmediatamente colocar el corazón en solución de bloqueo.Agregue la solución de bloqueo hasta que el tejido esté completamente cubierto. Corte el ventrículo derecho y el tabique y separe el ventrículo izquierdo. Retire los músculos papilares y use fórceps finos y una pipeta para separar suavemente el tejido para liberar las células por disociación mecánica.Filtrar la suspensión celular a través de una malla con poros cuadrados de un milímetro y sedimentar las células por centrifugación. A continuación, resuspender el pellet de cardiomiocitos en solución de bloqueo fresco. Para un experimento de abrazadera de parche, cubra los cubreobjetos autoclaves en una placa de Petri con 100 microgramos por mililitro de laminina inmediatamente antes del cultivo celular.Para el experimento de fibra de carbono, cubra los platos de Petri con 0,12 gramos por mililitro de Poly-HEMA en una solución de 95 a cinco de etanol a agua. De diez a 15 minutos después de resuspender los cardiomiocitos, quitar el sobrenadante y resuspender las células en el medio de cultivo. Después de contar, siembra las células en un cubreobjetos en un plato de Petri a una densidad objetivo de 1.75 veces 10 a las cuatro células por mililitro.Incubar los cultivos durante tres a cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Al final de la incubación, sustituya el medio de los cultivos de cubreobjetos por un medio fresco que contenga adenovirus tipo cinco que codifica para GtACR1-eGFP a una multiplicidad de infección de 75. Devuelva los cultivos a la incubadora durante 48 horas.Para realizar un experimento de abrazadera de parche, utilice un tirador de micropipetas para extraer pipetas de parche de 1,7 a 2,5 megamios de capilares de vidrio de cal sodada e inicialice el software de adquisición de datos. Coloque un cubreobjetos con células en la cámara de medición que contiene la solución externa y seleccione el cardiomiocitos en función de su fluorescencia eGFP. A continuación, llene una pipeta de parche con solución interna y conecte la pipeta al soporte de pipeta que inserta el cable de grabación de plata recubierto de cloruro de plata en la solución interna.Establezca la prueba de membrana para aplicar 10 pulsos de milivoltios durante 15 milisegundos con una línea de base de cero milivoltios. Después de alcanzar la configuración conectada a la celda, cambie al modo de celda completa con un potencial de retención de menos 60 milivoltios en el software de adquisición de datos. A continuación, aplique suavemente la presión negativa para acceder a toda la configuración celular rompiendo la membrana.Una ruptura exitosa será evidenciada por un aumento inmediato en la capacitancia medida. Registre protocolos de fotoactivación en modo de abrazadera de voltaje a menos 74 milivoltios con pulsos de luz de 300 milisegundos o potenciales de acción en modo de abrazadera actual a cero picoampere. Para producir las fibras de carbono, primero monte la pipeta en los soportes de pipeta del tirador.Tire de los capilares de vidrio en dos pipetas con una longitud total cónica de aproximadamente 11 milímetros y un diámetro interior final de unos 30 micrómetros. A continuación, utilice un microscopio estéreo para alinear un capilar en el círculo de orientación y doblarlo hasta 45 grados empujando hacia abajo en la punta del capilar con un doblador. Caliente el filamento hasta que el capilar mantenga el ángulo de 45 grados incluso después de retirar el doblador.Después de doblar el capilar, utilice fórceps finos equipados con tubos suaves para tomar una fibra de carbono del tubo y colocarla en la punta fina del capilar. Empuje la fibra en el capilar hasta la curva. Cortar las fibras de carbono para que proyecten dos mililitros desde la punta del capilar y utilicen pegamento de cianoacrilato para fijar las fibras a la sección frontal de cada capilar.Para calibrar las fibras, conecte un capilar a un soporte controlado por un micromaniprógrafo y un motor piezoeléctrico. Mueva el capilar hacia el sensor y alinee con respecto al sensor. Coloque la punta de la fibra en contacto con el sensor de fuerza sin producir ninguna fuerza.El movimiento total del motor piezoeléctrico es de 60 micrómetros. Mueva el motor piezoeléctrico en seis pasos de 10 micrómetros hacia el sensor de fuerza. El sensor tiene una sensibilidad de 0,05 milinewtons por voltio y un rango de fuerza de cero a 0,5 mililitros.Lea el voltaje medido para cada paso y retire la fibra de carbono del sensor. Para registrar la fuerza de contraer cardiomiocitos, cubra la superficie de un cubrecubos con Poly-HEMA y colóquelo en la cámara de medición. Llene la cámara con solución de baño externa.Fije ambos capilares cargados de fibra de carbono al micromanipulador de etapa y alinee en un ángulo para que las fibras de carbono estén cerca de horizontal a la superficie de la cámara de medición. Para comprobar si las fibras están correctamente alineadas, concéntrese en la superficie de la cámara de medición, baje la primera fibra y mueva la fibra horizontalmente. La punta de la fibra debe estar deslizándose sobre la superficie de la cámara de medición.Siga el mismo procedimiento para la segunda fibra. Con las luces apagadas, agregue unas gotas de suspensión celular cultivada a la cámara y aplique pulsos cortos de luz verde para seleccionar las células que se contraen en respuesta a la estimulación de la luz verde. Para conectar la primera fibra, comprima suavemente la célula bajando la fibra y luego suelte la presión.Fijar la segunda fibra paralela a la primera en el otro extremo del cardiomiocitos para tener un número máximo de sarcomeres entre las dos fibras. Después de conectar ambas fibras, levante las fibras para que la célula ya no esté en contacto con la superficie de la cámara. Ponga los sarcomeres en el foco, establezca la ventana de seguimiento de la longitud de los sarcomos entre las fibras y utilice el módulo de detección de bordes para rastrear la flexión de la fibra.Establezca las áreas de detección con las ventanas rojas y verdes y defina un umbral en la primera derivada de la traza de intensidad de luz. El ritmo óptico de la célula mientras se rastrea la longitud de los sarcomos y la flexión de fibra. En este caso, caminamos a 0,25 hercios.Después de registrar al menos 15 contracciones ópticamente provocadas, el campo estimula la célula eléctricamente. Encuentre el umbral para obtener las contracciones y aplique 1,5 veces el voltaje umbral para el ritmo eléctrico. Para un protocolo de inhibición, aplique estímulos eléctricos para provocar contracciones y luego exponga la célula a un pulso de luz sostenido a varias intensidades de luz.Registre al menos 15 contracciones después de la inhibición inducida por la luz. GtACR1 se expresa en cardiomiocitos de conejo cultivados. La fotoactivación GtACR1 a una intensidad de luz de cuatro milivatios por milímetro cuadrado durante 300 milisegundos da como resultado grandes corrientes dirigidas hacia adentro a menos 74 milivoltios con una corriente pico medida de 245 picoampere.En este experimento representativo, los potenciales de acción se activaron eléctricamente con inyecciones de corriente 1,5 veces el umbral o ópticamente con pulsos de luz de 10 milisegundos. Los cardiomiocitos de ritmo óptico demostraron un inicio potencial de acción más lento. Los potenciales de acción activados eléctricamente fueron inhibidos bajo luz sostenida.Las inyecciones de corriente más altas y 1,5 veces el umbral durante la aplicación de luz sostenida tampoco provocan potenciales de acción. El cardiomiocitos generó una fuerza de contracción de 232 micronewtones por milímetro cuadrado sobre el ritmo eléctrico y 261 micronewtones por milímetro cuadrado después del ritmo óptico. Los pulsos prolongados de luz verde inhibió las contracciones con las contracciones posteriores a la inhibición que generan una menor fuerza contráctil en consonancia con la pérdida de calcio diastólica de los cardiomiocitos de conejo.Recomendamos practicar las técnicas antes de realizar un experimento, particularmente porque posicionar las microbios en la oscuridad puede ser un desafío. es muy importante cuando se analiza la contractilidad de cardiomiocitos, ya que puede afectar la producción de fuerza y la relajación. También se pueden aplicar varias cargas posteriores para el análisis de contracción isotónico y auxotónico.Estas técnicas permiten caracterizar los efectos biofísicos de la activación de actuadores optogenéticos recientemente desarrollados en cardiomiocitos, lo que es crucial para seleccionar la herramienta optogenética más adecuada para cada experimento. Tenga en cuenta que la transducción de adenovirus y todos los pasos siguientes a la transducción deben realizarse en condiciones de nivel II de bioseguridad.

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