使用液色谱结合串联质谱法对糖皮质酶细胞脂质的定量分析

该协议提供了一种准确且可重复的方法，用于使用单个提取方法和单个LC-MS方法量化10种不同的糖精类。这种方法允许检测和定量具有不同化学和物理特性的异构血脂物种。对于糖精培养，首先在含有无菌YNB培养的两个Erlenmeyer烧瓶中加入5毫升无菌20%葡萄糖库存溶液，最终浓度为2%葡萄糖。

然后，使用无菌移液器将含有五倍十至第七酵母细胞的隔夜酵母培养的体积转移到每个烧瓶中，并在30摄氏度下将烧瓶培养至少24小时，每分钟旋转200圈。对于脂质提取，确定每毫升培养酵母细胞的总数，将五倍十到第七细胞转移到15ml离心管中。加入冰冷的纳米纯水，使总体积达到15毫升，通过离心收集细胞。

将酵母颗粒重新悬浮在15ml冰冷异酸铵碳酸氢盐缓冲液中，进行第二次离心，并在1.5ml新鲜冰冷碳酸氢铵溶液中重新悬浮该颗粒。在离心结束时，将颗粒储存在 80 摄氏度，直到提取。要开始脂质提取，先将冰上的细胞颗粒解冻，然后再将200微升冰纳米纯水中的细胞重新悬浮。

在烟气罩中，将电池悬浮液转移到15ml高强度玻璃、螺杆顶部离心管中，带聚四氟乙烯衬里盖，并加入25微升的内脂标准混合物，以2:1氯仿甲醇制成。100微升425至600微摩尔酸洗玻璃珠和600微升17:1氯仿甲醇到管。在室温下高速旋转管5分钟，以破坏细胞。

随后在室温下低速旋转一小时，以方便抽脂。在提取结束时，在冰上孵育样品15分钟，促进蛋白质沉淀和水与有机相的分离。在孵化结束时，将样品离心，将上水相与下部有机相进一步分离，并在烟气罩中，使用硅酸盐玻璃移液器将下部有机相转移到新的 15 ml 高强度玻璃螺杆顶部离心管中，带聚四氟乙烯衬里盖。

将下部有机相放在氮气的流动下，并在烟气罩中，将 300 微升的 2:1 氯仿甲醇混合物加入到剩余的上水相中。为了方便磷脂酰胺、磷脂酰胺素、磷脂酰药物和心脂萃取，在室温下大力抽吸管五分钟，然后离心样品。使用硅酸盐玻璃移液器将较低的有机相转移到氮气下的下有机相中，并在烟气罩中的组合有机相中蒸发溶剂。

然后，在氮气流下关闭脂膜管，将样品储存在80摄氏度。对于液相色谱，在500微升的63:35:5乙酰硝酸盐-2-丙烷醇纳米纯水混合物中分离至脂质膜管和涡流三次，每个涡流在室温下10秒。将管内内容物接受超声波声波15分钟，然后对管进行三次涡流，每个涡流10秒，正如刚才所证明的。

将样品的 100 微升转移到玻璃瓶中，并采用用于 24 井板的刀片，并消除刀片内的任何气泡。将刀片放入 24 井板的一个井中，并将反向相位 C18 柱 CSH 加载到液相色谱系统中的预列中。将柱温度设置为 55 摄氏度，将流量设置为每分钟 300 微升。

设置所有参数后，在加载第一个样本之前加载 10 微升的提取空白。然后，使用液相色谱梯度分离不同的脂质物种，如所示。将生成从细胞中提取的脂质的 LC-MS 数据中具有代表性的总离子色谱。

对于提取的脂质的质谱分析，将样品加载到装有加热电喷电离源的质谱仪上，并设置表中概述的分析参数。使用 Fourier 变换分析仪以 60，000 的分辨率和 150-2000 道尔顿的质量范围检测 MS-1 父离子。然后，使用表中所示的设置检测 MS-2 二次离子。

要识别和量化来自广泛串联LC-MS文件的不同脂质，请搜索包含完整扫描MS-1数据和数据依赖性MS-2数据的LC-MS原始文件，以获得免费的、未受附的脂肪酸， 心脂、植物素、植物素、磷脂酰胆碱、磷脂酰胺、磷脂酰胺、磷脂酰利酮醇、磷脂酰胺、磷脂酰胺和三叶草脂类，使用质量除以前体离子的电荷耐受性百万分之五和产品离子的十分之一。然后，按照软件用户手册中提供的说明，识别具有异常脂肪酸成分的内部脂质标准和脂质物种。这种敏感的串联LC-MS方法能够识别和定量浓度低至0.165皮摩尔/微升的脂质分子物种。

这种定量限值不同于不同浓度范围内的不同脂质类别。该方法可用于利用电喷电离质谱法的替代移动相添加剂提高脂质电离效率。这些替代移动相添加剂可用于正常相位和反向相位 LC 柱。

碰撞诱导分离法与质谱电喷电离负模结合使用醋酸铵移动相添加剂，有利于提高MS-1脂离子分离效率，形成MS-2产品。相比之下，高能量、碰撞分离法与用于质谱的电喷电离正模式的铵 formate 移动相添加剂相结合，有利于在这些条件下提高MS-1脂离子碎片对MS-2产品的效率。收集有机相时不要混合相。

在氮气流下关闭管。消除刀片内的任何气泡，并将柱以正确的方向连接。如果任何峰值的标识不能由LC-MS确定，MS-NMR可用于推断该分子的结构。