Caracterización de exón omitiendo la eficiencia en muestras de pacientes dmd en ensayos clínicos de oligonucleótidos antisales
7 de mayo de 2020
Aquí, presentamos la caracterización molecular de la expresión de la distrofina 38 usando la secuenciación de Sanger, RT-PCR, y la hinchazón occidental en el ensayo clínico.
Este protocolo proporciona una metodología estandarizada para la preparación y manipulación de tejido muscular en entornos preclínicos y ensayos clínicos, que es importante para obtener resultados confiables dentro del campo dmD. Las técnicas son relevantes para omitir las pruebas de exón para DMD. Y la principal ventaja es que, están bien establecidos y reproducibles si se llevan a cabo colectivamente.
Estas técnicas se centran principalmente en la omisión de exones en DMD, pero con un cambio de imprimaciones, se pueden aplicar las mismas técnicas a otras enfermedades tratadas con terapias de empalme. Estos métodos se pueden utilizar para lograr la eficiencia de salto de exón tanto como el ARN y la proteína. Para preparar una muestra para el análisis, primero mezcle volúmenes iguales de goma de tragacanto y agua hasta que la encía se vuelva suave y pegajosa.
Cargue esta mezcla en jeringas de 25 mililitros y dispense de 0,5 a un centímetro de goma en discos de corcho individuales. Etiquete los discos en el lado opuesto y coloque un recipiente de isopentano en nitrógeno líquido hasta que parte del líquido se congele. Coloque cada espécimen en la encía del tragacanto en los discos con un eje longitudinal de cada músculo perpendicular al corcho.
Coloque la goma alrededor de la parte inferior de cada músculo para ayudar a mantener el músculo en su lugar, y utilice pinzas para congelar las muestras en el isopentano frío. Mueva los especímenes continuamente durante un minuto o hasta que estén completamente congelados antes de colocarlos temporalmente sobre hielo seco. A continuación, coloque los especímenes en viales de vidrio para un almacenamiento de 80 grados centígrados.
Para secuestre el tejido muscular congelado para su análisis, establezca un criostato a una temperatura de trabajo de 25 grados Celsius, y para montar el bloque muscular en el soporte. Recorte el bloque de tejido hasta que se logren secciones planas. Para el análisis de la transcriptasa inversa PCR y Western blot, obtenga rodajas gruesas de 10 micrómetros.
Para el análisis inmunohistoquímico, obtener rodajas de seis a ocho micrómetros de espesor, y para la tinción de hematoxilina y eosina, obtener rodajas de 10 a 12 micrómetros de espesor. Después de su adquisición, coloque las secciones cortadas en dos tubos mililitros. Almacene las muestras para PCR e hinchazón occidental a 80 grados centígrados.
Aquí, se muestran el sistema de electroforesis de microchip, un gel de imágenes de reacciones de PCR de transcriptasa inversa y los resultados de secuenciación de la banda omitida de dos pacientes antes y después del tratamiento con un oligonucleótido antisorés en una fase de aumento de dosis de un ensayo. Ambos pacientes albergan deleciones. Como era de esperar, antes del tratamiento, ambos pacientes no mostraron saltos y sólo se podía visualizar una banda no omitida.
Después de 12 semanas de tratamiento, se visualizó una banda inferior clara omitida para el segundo paciente, sin embargo, todavía era difícil detectar cualquier producto omitido para el primer paciente. Los resultados de la secuenciación mostraron una concatenación de exones 47 y 54 para el segundo paciente, y exones, 44 y 54 para el primer paciente. Para calcular el porcentaje omitido, la concentración molar para la banda omitida se dividió por las bandas omitidas y no desfaladas.
Como era de esperar, ninguna banda de distrofina fue detectada por Western blot antes del tratamiento. Después del tratamiento, se detectó una banda del segundo paciente con un menor peso molecular en comparación con la observada en el control saludable. El primer paciente, sin embargo, no mostró niveles detectables de distrofina después del tratamiento.
Es fundamental manejar el tejido muscular correctamente, y colocar cada espécimen en la encía del tragacanto de manera consistente. Las secciones de tejido se pueden analizar de varias maneras diferentes, incluyendo artificial a PCR, PCR digital, mancha occidental, inmunohistoquímica, y con diferentes tipos de omics. Estas técnicas se pueden acelerar, el desarrollo, exón adicional omitiendo medicamentos dirigidos a diferentes exones, y se pueden aplicar al desarrollo de la base viral y de nuevo en la edición de DMD.
Descripción general
Este estudio presenta una metodología estandarizada para la preparación y manipulación de tejido muscular en ensayos clínicos relacionados con la distrofia muscular de Duchenne (DMD). El enfoque se centra en las técnicas de salto de exón, que son cruciales para el desarrollo de terapias efectivas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Ensayos clínicos
Antecedentes
- La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad grave de desgaste muscular.
- La omisión de exones es un enfoque terapéutico prometedor para la DMD.
- Un manejo confiable de los tejidos es esencial para obtener resultados experimentales precisos.
- Los métodos estandarizados pueden mejorar la reproducibilidad en la investigación.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo confiable para la preparación de tejido muscular.
- Facilitar ensayos de salto de exones para la DMD.
- Proporcionar un marco aplicable a otras enfermedades tratadas con terapias de empalme.
Métodos Utilizados
- Preparación del tejido muscular utilizando goma de tragacanto e isopentano.
- Congelación y corte de muestras musculares para análisis.
- Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa e inmunotransferencia para detectar la expresión de distrofina.
- Secuenciación para analizar la eficiencia del salto de exones.
Resultados principales
- Visualización exitosa de bandas omitidas en pacientes tratados.
- Detección de distrofina en un paciente después del tratamiento.
- Variabilidad en la respuesta al tratamiento entre pacientes.
- Se enfatiza la importancia de un manejo consistente de los tejidos para obtener resultados precisos.
Conclusiones
- Los métodos estandarizados son fundamentales para avanzar en las terapias contra la DMD.
- La omisión de exones muestra potencial, pero requiere una mayor optimización.
- Estudios futuros pueden basarse en estos métodos para aplicaciones más amplias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo establece un flujo de trabajo estandarizado para evaluar la eficiencia del salto de exones en muestras de pacientes con DMD, apoyando directamente la validación de objetivos en el desarrollo de oligonucleótidos antisentido. Al permitir la medición cuantitativa de la restauración molecular, proporciona una reducción mecanicista de riesgos para terapias de salto del exón 53, como el viltolarsen. El enfoque mejora la confianza predictiva en la traducción preclínica a clínica al vincular lecturas bioquímicas con el mecanismo terapéutico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la hipótesis terapéutica del salto de exón mediado por oligonucleótidos antisentido en muestras derivadas de pacientes.
- Valor operativo: Proporciona métodos reproducibles de secuenciación Sanger, RT-PCR e inmunotransferencia Western para confirmar la actividad molecular específica.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera relaciones cuantitativas de bandas saltadas respecto al total para la evaluación de respuesta a dosis en la eficiencia del salto de exones.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de preparación y corte de tejidos para garantizar la reproducibilidad del ensayo en conjuntos de muestras preclínicas y clínicas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya el análisis de sistemas relevantes para la enfermedad mediante la caracterización de la restauración de la distrofina en biopsias musculares reales de pacientes.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica utilizando lecturas moleculares consistentes en diferentes sistemas modelo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores, proporcionando una confirmación molecular del mecanismo antes de las pruebas de eficacia funcional.
- Biología del Descubrimiento: Confirma la corrección del empalme de exones específicos en muestras de pacientes, apoyando la validación de hipótesis para oligonucleótidos antisentido.
- Tamizaje: Proporciona porcentajes cuantitativos de salto de exones mediante imágenes de geles y secuenciación, permitiendo la comparación de compuestos.
- Analítica: Ofrece cuantificación de bandas saltadas basada en concentración molar para análisis comparativo entre dosis y pacientes.
- Investigación Traducional: Relaciona el salto de exones a nivel molecular con la detección de la proteína distrofina, conectando el mecanismo a nivel de ARN con el resultado a nivel proteico.
- Reutilización Empresarial: Establece un marco reutilizable de manejo y análisis de tejidos aplicable a múltiples objetivos de exones y terapias de empalme.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reducción de riesgos mecanicistas mediante la visualización directa del salto de exones y la restauración de la distrofina en tejido humano.
- Valor operativo: La inclusión y criosección estandarizadas con goma de tragacanto garantizan la consistencia de las muestras y reducen la variabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al proporcionar evidencia molecular del acoplamiento al blanco antes de los puntos finales funcionales.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de oligonucleótidos antisentido basada en la eficiencia del salto de exones en genotipos de pacientes relevantes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de biología molecular, incluyendo RT-PCR, inmunotransferencia (Western blotting) y secuenciación de Sanger.
- Depende de equipo criostático para el corte de tejidos y de nitrógeno líquido o isopentano para congelación rápida.
- Necesita protocolos estandarizados de manejo de tejidos para mantener la integridad de las muestras entre sitios o puntos temporales.
- Debe considerar la variabilidad de mutaciones específicas del paciente al diseñar cebadores para la detección de salto de exones.
- Limitado por la naturaleza semicuantitativa de los métodos basados en geles sin validación mediante PCR digital o electroforesis capilar.
