Name: Cortar y cultuar corazones de cerdo bajo condiciones fisiológicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprenda a cortar y cultivar secciones de tejido cardíaco de cerdo durante seis días en condiciones fisiológicas. Este método permite evaluar la eficacia de terapias para la insuficiencia cardíaca y probar la toxicidad cardíaca aguda de fármacos.

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TMAM es apoyado por la concesión DE NIH P30GM127607 y la concesión 16SDG29950012 de la American Heart Association. RB es compatible con P01HL78825 y UM1HL113530.

Todos los procedimientos de los animales estaban de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Louisville y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal.
1. Preparación para el corte (un día antes del corte)
<ol><li>Preparación del microtome vibratorio
	<ol>
<li>Coloque la hoja de cerámica en su soporte siguiendo estos pasos: después de desenvolver cuidadosamente la hoja, coloque el borde afilado primero en la ranura de la herramienta de la hoja. A continuación, coloque la hoja en el soporte aflojando los dos tornillos de los brazos del soporte y deslice la hoja debajo de cada arandela y empújela firmemente contra los topes traseros. Apriete los tornillos para fijar la cuchilla. NOTA: Los tornillos no deben apretarse demasiado.</li>
		<li>Calibre la cuchilla utilizando el protocolo de calibración y las herramientas de acuerdo con el protocolo del fabricante. NOTA: En resumen, con el fin de facilitar la alineación de la hoja con el eje de recorrido y minimizar las desviaciones del eje Z, el microtome vibratorio utiliza un dispositivo de calibración desmontable. Cuando el dispositivo de calibración está conectado al instrumento, su presencia se detectará automáticamente, y el microtomo vibratorio tomará el control de ajustar los ajustes de amplitud y frecuencia de la hoja a una magnitud que permita mejor el ajuste del error de alineación de la hoja.<ol>
<li>Pulse el botón Cortar para iniciar el proceso de alineación que moverá automáticamente la hoja de modo que el filo de corte esté en una posición óptima en relación con el dispositivo de calibración para una mejor evaluación de la alineación. Siga las instrucciones en pantalla para realizar ajustes en la cuchilla utilizando el destornillador proporcionado para asegurarse de que la alineación En Z está dentro de 1 m.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Autoclave el baño interior y todas las partes metálicas del microtome vibratorio.</li>
	</ol></li>
	<li>Autoclave de las grandes bandejas de metal (para recoger las rodajas y remojar las cubiertas de la placa de estimulación eléctrica), cualquier recipiente de vidrio, cuchillas rectangulares regulares, fórceps, tijeras, correa de distribución de impresora (cortarlas en trozos de 6 mm de ancho), arandelas metálicas y 5 L de agua destilada doble (ddH2O).</li>
	<li>Esterilice un frasco de 1 L, un frasco de 500 ml y una bandeja de plástico para el corazón in situ y perfusión in vitro con la solución cardiopléjica.</li>
	<li>Prepare 2 L de la solución de Tyrode de corte en un vaso de precipitados de 2 L.
	<ol>
<li>Para 1 L de la solución de Tyrode de corte, mezclar 3 g/L 2,3-butanediona monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucosa (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml de solución de 1 M), 1,8 mM de CaCl2 (1,8 ml de solución de 1 M), hasta 1 L de ddH2O. Ajuste el pH a 7.40 usando NaOH. A continuación, filtre la solución utilizando un sistema de filtro/almacenamiento de vacío de 1.000 ml, 0,22 m, y guárdela a 4 oC durante la noche.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar 4 L de la solución cardiopléjica.
	<ol>
<li>Para 1 L de la solución cardiopléjica, mezclar 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM de CaCl2 (1,2 ml de solución de 1 M), 16 mM de KCl (1,19 g), 16 mM mgcl2 (3,25 g), 10 mM de NaHCO3 (0,84 g), 1 U/ml de heparina, hasta 1 L de ddH2O. Ajuste el pH a 7.40 utilizando NaOH. A continuación, filtre la solución utilizando un sistema de filtro/almacenamiento de vacío de 1.000 ml, 0,22 m, y guárdela a 4 oC durante la noche. NOTA: Añadir 1.000 U/L de heparina en solución de cardioplejia el día del corte (ver paso 2.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Recién preparado 500 ml de medio de cultivo en el frasco original en un gabinete de bioseguridad: medio de mezcla 199, 1 suplemento de insulina-transferrina-selenio (ITS), 10% suero bovino fetal (FBS), factor de crecimiento endotelial vascular de 5 ng/ml (VEGF), 10 ng/ml FGF-básico, y 2 x antibiótico-antimético. El filtro esteriliza a través del sistema de filtro/almacenamiento de vacío de 0,22 m y guárdalo a 4 oC durante la noche. NOTA: No ajuste el pH, añada VEGF y FGF recién antes de su uso.</li>
	<li>Preparar placas de gel de agar 4%.
	<ol>
<li>Añadir 200 ml de ddH2O esterilizado en un matraz esterilizado de 500 ml. Pesar 8 g de agarosa, y verter suavemente en el matraz. Hervir durante 2 minutos en un microondas, luego enfriar durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Vierta 25 ml en cada plato Petri de 100 mm en un armario de bioseguridad (prepare 6 platos) y espere 1 h para solidificar. Luego, selle las placas con película de parafina, envuelva con una envoltura limpia y guárdelas a 4oC.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar 4 L de 70% de etanol diluyendo el etanol absoluto a prueba de 200 en autoclave ddH2O.</li>
	<li>Preparar 2 x antibiótico-antimicótico en ddH2O esterilizado: mezclar 980 ml de ddH2O esterilizado con 20 ml de antibiótico-antimicótico bajo el gabinete de bioseguridad.</li>
</ol>2. Perfusión del corazón de cerdo
<ol><li>Añadir 1 ml de 1.000 U/ml de heparina a cada 1 L de solución cardiopléjica. Mantenga la solución en hielo. NOTA: Se necesitan al menos 3 L para la perfusión y preservación del corazón durante la transferencia a la sala de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Lleve los siguientes artículos a la sala de cirugía de cerdo: un cubo de hielo grande lleno de hielo, una bandeja de metal esterilizada (mantener en cubo de hielo para la perfusión del corazón), un frasco esterilizado de 500 ml, un frasco de 1 L (para transferir el corazón en solución de cardioplejia de nuevo a la sala de cultivo de tejidos , sobre hielo), y una bandeja de plástico esterilizada llena de hielo (para mantener la solución cardiopléjica sobre hielo).</li>
	<li>Prepare un sistema de perfusión cardíaca in situ que contenga un tapón de 3 vías, una jeringa de 60 ml, un catéter de aguja de mariposa de 18 G y un tubo de extensión al depósito de la solución cardiopléjica.</li>
	<li>Anestetizar el cerdo macho de Yorkshire (2 x 3 meses de edad, 20 x 25 kg) primero con una inyección intramuscular de un cóctel de ketamina (20 mg/kg)/xilazina (2 mg/kg). Confirme la anestesia adecuada por la pérdida de tensión de la mandíbula. A continuación, transferir el cerdo a la sala de cirugía, intubar y ventilar mecánicamente los pulmones como se describió anteriormente14.</li>
	<li>Mantener la anestesia con (1,5-2%) Isoflurano.</li>
	<li>Coloque el animal en la posición lateral derecha y aseque el pelaje de la zona del pecho. Limpie la piel con exfoliación con alcohol y, a continuación, esterilice el sitio quirúrgico con una solución de povidona-yodo al 10% (p/v).</li>
	<li>Abra el pecho por la incisión de toracotomía izquierda usando un bisturí en el espaciointercostal 4, y use un retractor torácico entre las costillas para mantener el pecho abierto y exponer el corazón. NOTA: Utilice todos los instrumentos esterilizados para este procedimiento.</li>
	<li>Inserte el catéter de aguja de mariposa en la aurícula izquierda y fije la aguja con un cierre de cuerda de la bolsa. Después de la inyección intravenosa de una dosis de bolo de heparina (100 U/kg), comience a perfumar el corazón in situ con 500 ml de solución cardiopléjica helada (para disminuir la frecuencia cardíaca) a través del catéter auricular izquierdo.</li>
	<li>Anestesia profundamente al cerdo con 5% de isoflurano. Exbote rápidamente el corazón del pecho con tijeras quirúrgicas. Cannute la aorta con una cánula aórtica y percanda el corazón in vitro con otra 1 L de solución cardiopléjica helada (100 ml/min) para eliminar la sangre de la vasculatura.</li>
	<li>Después de la perfusión cardíaca, mantenga el corazón en un frasco de 1 L lleno de solución de cardioplejia helada y mantenga el hielo durante la transferencia a la sala de cultivo de tejidos.</li>
</ol>3. Corte de tejido cardíaco de cerdo
<ol><li>Configure el baño de tejido en el vibratome, agregue hielo a la chaqueta de enfriamiento del baño de tejido y, a continuación, agregue la solución de Tyrode al baño de tejido. Configure un frasco de plástico de 1 L para recoger la eliminación de hielo derretido de la chaqueta de enfriamiento del baño de tejido.</li>
	<li>Debajo del armario de bioseguridad, transfiera el corazón del cerdo a una bandeja que contenga 1 L de solución cardiopléjica fría fresca.</li>
	<li>Diseccionar el corazón para aislar el ventrículo izquierdo usando bisturíes estériles retráctiles. Luego, corta el ventrículo izquierdo en bloques de 1 x 2 cm3 cada uno usando cuchillas rectangulares de afeitar. Utilice una pieza para cortar y mantenga las piezas restantes en un tubo de 50 ml en solución fría de Tyrode sobre hielo para cortar más tarde, si es necesario. NOTA: Masajear el tejido antes de cortar con las manos, especialmente si este es el segundo bloque. El masaje ayuda a restaurar la configuración correcta de la fibra muscular y previene cualquier rigidez dentro del bloqueo cardíaco.</li>
	<li>Añadir 1 x 2 gotas de pegamento tisular(Tabla de Materiales) al soporte de la muestra de metal y pegar un pedazo del bloque de agar 4% con una superficie de aproximadamente 1 cm2.</li>
	<li>Agregue 1 x 2 gotas de pegamento tisular en el agar.</li>
	<li>Pegue el bloqueo del corazón al agar con el lado del epicardio cardíaco mirando hacia abajo en el pegamento del tejido y asegúrese de que sea lo más plano posible. A continuación, transfiera el soporte de tejido con el bloqueo cardíaco a su posición en el baño de corte del vibratome.</li>
	<li>Fije el tubo de oxígeno al baño de corte y la bandeja de metal llena con la solución de Tyrode para recoger las rodajas (baño de Tyrode oxigenado). A continuación, agregue los coladores de celdas de 40 m en la bandeja de metal para recoger las rodajas después del corte.</li>
	<li>Ajuste de la posición de corte
	<ol>
<li>Usando el software de funcionamiento vibratome y el tablero de control, ajuste la altura de la hoja/muestra. Seleccione el botón de altura y siga las instrucciones en pantalla para ajustar la altura. Idealmente, tener la hoja cerca de la parte superior del tejido, pero por debajo de los músculos papilares y asegúrese de que hay líquido que cubre el tejido y la hoja antes de cortar.</li>
		<li>Ajuste dónde comenzar a cortar el tejido seleccionando el botón de avance. Presione el botón de corte y aumente la velocidad usando la perilla para mover la hoja hacia el borde del tejido. A continuación, pulse slice de nuevo para detener y pulse el botón de avance para desactivar el proceso.</li>
		<li>Ajustar los parámetros de corte: velocidad de avance de 0,03 mm/s, frecuencia de vibración a 80 Hz y amplitud de vibración horizontal a 2 mm. A continuación, inicie el corte seleccionando el botón de corte.</li>
		<li>Dejar que el vibratome se rebane hasta que llegue al extremo del tejido, pero antes de que llegue al extremo posterior del soporte de la muestra. En este punto, presione slice de nuevo para detenerlo. Pulse el botón Retorno para volver a la posición inicial.</li>
		<li>Seleccione la repetición automática (haciendo clic dos veces) que permitirá que el microtome vibratorio repita automáticamente el proceso de corte hasta 99 veces.</li>
	</ol></li>
	<li>Recolección de rebanadas
	<ol>
<li>Espere hasta que las rebanadas estén completas y parezcan buenas (después de pasar las capas musculares papilares), y luego comience a recoger las rebanadas.</li>
		<li>Recoge las rodajas con una pipeta Pasteur de plástico llena de solución fría de Tyrode para agarrar suavemente el tejido del baño. Si es necesario, utilice fórceps y tijeras de resorte para disociar la rebanada del bloqueo cardíaco si el tejido todavía está unido.</li>
		<li>Transfiera la rebanada a un colador de células en el baño de Tyrode oxigenado (ver paso 3.7) y use el líquido en la pipeta de plástico Pasteur para hacer que el tejido se acueste en uno de los coladores celulares, luego agregue una lavadora de metal en la parte superior para sujetar el tejido hacia abajo. NOTA: Las rodajas deben ser incubadas al menos durante 1 h en la solución del Tyrode antes del procesamiento (esto es para que el BDM relaje el tejido).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Culturing Heart Slices
<ol><li>
Preparar las rebanadas para la cultura
	<ol>
<li>Recorte la rebanada de los bordes para evitar bordes desiguales. A continuación, colarlo desde ambos extremos a la correa de distribución de la impresora de poliuretano esterilizado de 6 mm de ancho con cables metálicos incrustados con pegamento de tejido.</li>
		<li>Transfiera las rodajas de corazón apoyadas a 6 platos de pozo que contengan 6 ml de medio de cultivo en cada pocal.</li>
		<li>Coloque la cubierta de la placa de estimulación(Tabla de materiales)en la parte superior de la placa de 6 pocillos y conecte la cubierta al estimulador eléctrico de cultivo celular (Tabla de materiales). Ajuste el estimulador para estimular eléctricamente las rodajas del corazón a 10 V, 1,2 Hz continuamente todo el tiempo. NOTA: Después de conectar la estimulación, las rodajas del corazón comenzarán a latir, y este movimiento será visualmente obvio.</li>
		<li>Transfiera las placas a una incubadora y manténgalas a 37oC con aire humidificado y 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cambiar el medio de cultivo 3 veces al día y añadir 6 ml de medio de cultivo por pozo durante cada cambio de medio. NOTA: El medio de cultivo se oxigena durante 5 minutos antes de cada cambio de medio. El medio debe cambiarse al menos 1 veces al día; esto está bien los fines de semana si es necesario. Dos días de solo 1 cambio de medios por día es el máximo que se prueba.</li>
	<li>
Cambie la cubierta de la placa de estimulación todos los días para evitar la liberación de partículas de grafito tóxicas en el medio de cultivo (generalmente durante el cambio de medios del mediodía).
	<ol>
<li>Retire la cubierta de la placa de estimulación de la placa de cultivo e inserte el tapón de espuma blanca donde la cubierta se conecta al cable para el estimulador eléctrico del cultivo celular, para evitar daños por agua en el circuito eléctrico.</li>
		<li>Coloque la cubierta de la placa en un baño de agua autoclave con 2 x antibiótico-antimicótico. Guárdelo en este baño (es decir, un baño de ingle) durante la noche.</li>
		<li>Al día siguiente, mueva la cubierta de la placa a un baño de etanol del 70% durante 5 x 15 minutos para descontaminar. Agitar tanto líquido del dispositivo antes de cambiar de baño.</li>
		<li>A continuación, transfiera la cubierta de la placa al tercer y último baño (es decir, un baño limpio), que consiste en agua autoclave y 2x antibacteriano-antimicótico, para enjuagar cualquier rastro de etanol restante.</li>
		<li>Después de enjuiciar la cubierta de la placa en el baño limpio, utilice una toallita limpia sin pelusas (pulverizada con etanol) para secar cualquier agua residual en las piezas de plástico, luego retire la pieza de espuma blanca y coloque cuidadosamente la cubierta de la placa de nuevo en la placa de cultivo. NOTA: No toque los electrodos de grafito negro que van en el pozo, ya que el dispositivo ya no será estéril.</li>
		<li>Usando fórceps estériles, asegúrese de que el tejido está en el centro del pozo para que la cubierta de la placa no toque el tejido. Asegúrese de que el lado curvo de la cubierta de la placa coincida con el lado en ángulo de la placa y que las esquinas cuadradas se alineen. NOTA: Para minimizar la contaminación de las cubiertas de las placas de estimulación, manténgalas limpias y vacías 6 placas de pozos después de terminar el experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar un ensayo MTT, mediciones de calcio y evaluaciones de la función contráctil en rodajas de corazón de cerdo fresco (día 0), y después de 6 días en cultivo según Ou et al.13.</li>
</ol>

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</ol>

TMAM tiene participación en Tenaya Therapeutics. Los otros autores no informan de conflictos.

Aquí describimos el protocolo de vídeo detallado para nuestro método publicado recientemente para el método de rendimiento medio simplificado (procesos de hasta 48 rebanadas/dispositivo) que permite el cultivo de rodajas de corazón de cerdo durante un período lo suficientemente largo como para probar la cardiotoxicidad aguda13. Las condiciones propuestas imitan el entorno del corazón, incluyendo la frecuencia de estimulación eléctrica, la disponibilidad de nutrientes y la oxigenación intermitente....

La cardiotoxicidad inducida por fármacos es una de las principales causas de retirada del mercado1. En la última década delsiglo XX, ocho fármacos no cardiovasculares fueron retirados del mercado, ya que resultaron en la muerte súbita debido a arritmias ventriculares2. Además, varias terapias contra el cáncer (aunque en muchos casos eficaces) pueden conducir a varios efectos cardiotóxicos incluyendo cardiomiopatía y arritmias. Por ejemplo, las terapias tradicionales (por ejemplo, antraciclinas y radiación) como las dirigidas (por ejemplo, trastuzumab) pueden dar lugar a complicaciones cardiovasculares en un subconjunto de pacientes3. Una estrecha colaboración entre cardiólogos y oncólogos (a través del campo emergente de la "cardiooncología") ha ayudado a que estas complicaciones sean manejables asegurando que los pacientes puedan ser tratados eficazmente2. Menos claros son los efectos cardiovasculares de los agentes más nuevos, incluyendo los inhibidores Her2 y PI3K, especialmente cuando las terapias se utilizan en combinación. Por lo tanto, existe una creciente necesidad de estrategias de detección preclínica según la vida para las toxicidades cardiovasculares asociadas con las terapias emergentes contra el cáncer antes de los ensayos clínicos en humanos. La falta de disponibilidad de sistemas de cultivo para el tejido cardíaco humano que es funcional y estructuralmente viable para más de 24 h es un factor limitante para las pruebas de cardiotoxicidad confiables. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de desarrollar un sistema confiable para el cultivo del tejido cardíaco humano en condiciones fisiológicas para probar la toxicidad de los medicamentos.
El reciente avance hacia el uso de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (hiPSC-CP) en las pruebas de cardiotoxicidad ha proporcionado una solución parcial para abordar este problema; sin embargo, la naturaleza inmadura de los hiPSC-CP y la pérdida de integridad tisular en comparación con la naturaleza multicelular del tejido cardíaco son las principales limitaciones de esta tecnología4. Un estudio reciente ha superado parcialmente esta limitación a través de la fabricación de tejidos cardíacos a partir de hiPSC-CM en hidrogeles y sometiéndolos a un aumento gradual de la estimulación eléctrica en el tiempo5. Sin embargo, sus propiedades electromecánicas no alcanzaron la madurez vista en el miocardio humano adulto. Por otra parte, el tejido cardíaco es estructuralmente más complicado, siendo compuesto de varios tipos de células incluyendo células endoteliales, neuronas y varios tipos de fibroblastos estromales unidos junto con una mezcla muy específica de proteínas de matriz extracelular6. Esta heterogeneidad de la población celular no cardiomiocito7,8,9 en el corazón adulto de mamífero es un obstáculo importante en el modelado de tejido cardíaco utilizando tipos de células individuales. Estas principales limitaciones ponen de relieve la importancia de desarrollar métodos para permitir el cultivo del tejido cardíaco intacto para estudios óptimos que impliquen condiciones fisiológicas y patológicas del corazón5.
Culturing human heart slices es un modelo prometedor de miocardio humano intacto. Esta tecnología proporciona acceso a un sistema multicelular 3D completo que es similar al tejido cardíaco humano que podría reflejar de manera confiable las condiciones fisiológicas o patológicas del miocardio humano. Sin embargo, su uso se ha visto severamente limitado por el corto período de viabilidad en el cultivo, que no se extiende más allá de las 24 h utilizando los protocolos más robustos reportados hasta 201810,11,12. Esta limitación se debió a múltiples factores, incluyendo el uso de la interfaz aire-líquido para cultivar las rodajas, y el uso de un medio de cultivo simple que no soporta las altas demandas energéticas del tejido cardíaco. Recientemente hemos desarrollado un sistema de cultivo sumergido que es capaz de proporcionar estimulación eléctrica continua y optimizado los componentes de los medios de cultivo para mantener las rebanadas de tejido cardíaco viables hasta 6 días13. Este sistema de cultivo tiene el potencial de convertirse en un potente modelo predictivo humano in situ para pruebas de cardiotoxicidad aguda para cerrar la brecha entre los resultados de las pruebas preclínicas y clínicas. En el artículo actual, estamos detallando el protocolo para cortar y cultivar las rodajas del corazón usando un corazón de cerdo como ejemplo. El mismo proceso se aplica a los corazones humanos, perros, ovinos o gatos. Con este protocolo, esperamos difundir la tecnología a otros laboratorios de la comunidad científica.

<table><tbody><tr><td>1.000 mL, 0,22 y micro; m, Filtro/Sistemas de almacenamiento al vacío</td><td>VWR</td><td>28199-812</td><td></td></tr><tr><td>Monóxido de 2,3-butanediona (BDM)</td><td>Fisher</td><td>AC150375000</td><td></td></tr><tr><td>500 mL, 0,22 y micro; m, Filtro de vacío/Sistemas de almacenamiento</td><td>VWR</td><td>28199-788</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de plato C de 6 pocillos (cubierta de placa de estimulación eléctrica)</td><td>Ion Optix</td><td>CLD6WFC</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Fisher</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Bioline USA</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Thermo</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>C-Pace EM ( estimulador-eléctrico-de-cultivo-celular)</td><td>Ion Optix</td><td>CEP100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de cerámica para micrótomo vibratorio</td><td>Campden Instruments</td><td>7550-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Cooley Retractor de pecho</td><td>Millennium Surgical</td><td>63-G5623</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí Desechable #20</td><td>Biologyproducts.com</td><td>DS20X</td><td></td></tr><tr><td>Coladores de células Falcon, estériles, Corning</td><td>VWR</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo</td><td>A3160502</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe</td><td>Fisher</td><td>NC9475675</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl BLUE Pegamento para tejidos</td><td>Amazon<</td><td></td><td>a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td></tr><tr><td>Tijeras Iris Spring</td><td></td><td></td> Tijeras Fisher NC9019530 <td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Fisher</td><td>731210</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>ITS Suplemento de medios líquidos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina HCl (500 mg/10 mL)</td><td>West-Ward</td><td>NDC 0143-9508</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Tijeras</td> quirúrgicas <td></td> Fisher M33-500 <td></td></tr><tr><td>Mayo SuperCut</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>AROSuperCut&trade; 07.164.17</td><td></td></tr><tr><td>Medio 199, Sales de Earle</td><td>Thermo</td><td>11-150-059</td><td></td></tr><tr><td>Regulador de oxígeno</td><td>Praxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tanques de oxígeno -</td><td>Praxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de plástico Pasteur</td><td>Fisher</td><td>13-711-48</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>AC193780010</tr><tr><td>Correa dentada de la impresora</td><td>Amazon<</td><td></td><td>a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td></tr><tr><td>Cuchillas rectangulares de afeitar</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>FGF humano recombinante basic</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>VEGF humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes retráctiles</td><td>Fisher</td><td>22-079-716</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3)</td><td>Fisher</td><td>AC217125000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>AC327300010</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo vibratorio</td><td>Campden Instruments</td><td>7000 SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina HCl (100 mg/mL)</td><td>Suministro Veterinario Heartland</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

cortar y cultuar corazones de cerdo bajo condiciones fisiológicas

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Muchos fármacos novedosos fallan en los estudios clínicos debido a los efectos secundarios cardiotóxicos, ya que los ensayos in vitro actualmente disponibles y los modelos animales in vivo predicen mal las responsabilidades cardíacas humanas, lo que representa una carga multimillonaria para la industria farmacéutica. Por lo tanto, existe una necesidad médica mundial insatisfecha de mejores enfoques para identificar la cardiotoxicidad de los medicamentos antes de emprender costosos y lentos ensayos "primero en el hombre". Actualmente, sólo se utilizan células cardíacas inmaduras (cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre [hiPSC-CP]) para probar la eficiencia terapéutica y la toxicidad farmacológica, ya que son las únicas células cardíacas humanas que se pueden cultivar durante períodos prolongados para probar la eficacia y toxicidad de los medicamentos. Sin embargo, un solo tipo de célula no puede replicar el fenotipo del tejido cardíaco 3D complejo que se forma de varios tipos de células. Es importante destacar que el efecto de los medicamentos debe probarse en los cardiomiocitos adultos, que tienen diferentes características y respuestas de toxicidad en comparación con los hiPSC-CP inmaduros. La cultuación de las rodajas de corazón humano es un modelo prometedor de miocardio humano intacto. Esta tecnología proporciona acceso a un sistema multicelular completo que imita el tejido cardíaco humano y refleja las condiciones fisiológicas o patológicas del miocardio humano. Recientemente, a través de la optimización de los componentes de los medios de cultivo y las condiciones de cultivo para incluir la estimulación eléctrica continua a 1,2 Hz y la oxigenación intermitente del medio de cultivo, desarrollamos una nueva configuración del sistema de cultivo que preserva la viabilidad y la funcionalidad de las rebanadas de corazón humano y de cerdo durante 6 días en cultivo. En el protocolo actual, estamos detallando el método para cortar y cultivar el corazón del cerdo como ejemplo. El mismo protocolo se utiliza para cultivar rebanadas de corazones humanos, de perros, ovejas o gatos. Este sistema de cultivo tiene el potencial de convertirse en un potente modelo predictivo humano in situ para pruebas de cardiotoxicidad aguda que cierra la brecha entre los resultados de las pruebas preclínicas y clínicas.

Utilizando un estimulador eléctrico de cultivo celular disponible comercialmente que puede acomodar ocho 6 placas de pozos a la vez, emulamos el entorno cardíaco adulto induciendo la estimulación eléctrica a la frecuencia fisiológica (1,2 Hz), y examinamos los componentes medios fundamentales para prolongar la duración de las rodajas funcionales de corazón de cerdo en el cultivo13. Dado que los corazones de cerdo y humanos son similares en tamaño y anatomía<sup cla...

Este protocolo describe cómo cortar y cultivar el tejido cardíaco en condiciones fisiológicas durante 6 días. Este sistema de cultivo podría utilizarse como plataforma para probar la eficacia de nuevas terapias de insuficiencia cardíaca, así como pruebas fiables de cardiotoxicidad aguda en un modelo de corazón 3D.

Cortar y cultuar corazones de cerdo bajo condiciones fisiológicas

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Este protocolo es para cortar y cultivar secciones de tejido cardíaco durante seis días bajo condiciones fisiológicas que se pueden utilizar para pruebas de toxicidad cardíaca aguda, así como pruebas de eficacia de terapias de insuficiencia cardíaca. Este sistema de cultivo tiene el potencial de convertirse en un potente modelo predictivo humano in situ para pruebas de toxicidad cardíaca aguda que cierra la brecha entre los resultados de las pruebas preclínicas y clínicas. Demostrar los procedimientos será Qinghui Qu, un gerente de laboratorio de nuestro laboratorio.Para obtener rodajas de tejido cardíaco de cerdo, primero agregue hielo a la chaqueta de enfriamiento del baño de tejido de un vibratome y agregue la solución de Tyrode al baño. Utilice un frasco de plástico de un litro para recoger la escorrentía de hielo derretida de la chaqueta de enfriamiento del baño de tejido y transferir el corazón del cerdo a una bandeja que contenga un litro de solución cardiopléjica fría fresca en un gabinete de bioseguridad. Usa bisturíes estériles retráctiles para diseccionar el corazón para aislar el ventrículo izquierdo y usa cuchillas rectangulares para cortar el ventrículo izquierdo en b

slicing-and-culturing-pig-hearts-under-physiological-conditions

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

En este trabajo se describe la forma típica de aislar y cultivar el corazón de rata adulta miocitos. Colagenasa y la proteasa se utilizan para digerir y aislar a los miocitos individuales. Miocitos cultivadas seguir este protocolo cumplir con los requisitos de la mayoría de los experimentos.

Cultivo primario de miocitos adultos de corazón de rata

Este video muestra un procedimiento basado en vibrátomo para generar secciones viables y ultradelgadas de corazón de cerdo. Los cortes de tejido preparados se pueden cultivar y utilizar como sistemas modelo para pruebas farmacológicas.

Generación de lonchas ventriculares porcinas: una técnica basada en el vibratomo para preparar lonchas ultrafinas de tejido cardíaco de cerdo

En este video, describimos un protocolo paso a paso para extraer el corazón de un modelo porcino para trasplante cardíaco.

Escisión de corazón porcino: un protocolo para extraer corazón porcino para trasplante cardíaco

Este video describe una técnica ex situ para preservar un corazón porcino aislado mediante la perfusión con una solución de perfusión oxigenada rica en nutrientes. La técnica permite la evaluación integral del rendimiento cardíaco en condiciones fisiológicas.

Perfusión cardíaca ex situ: una técnica para preservar la función cardíaca porcina aislada

Se han desarrollado y descrito varios protocolos para el aislamiento de diferentes tipos de células cardíacas de un corazón de rata. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento de los principales tipos de células cardíacas de alta calidad (cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos) de una sola preparación, reduciendo los costos experimentales.

Aislamiento simultáneo de cardiomiocitos de alta calidad, células endoteliales y fibroblastos de un corazón de rata adulto

Aquí, describimos la preparación de cortes ventriculares viables de ratones adultos y su uso para registros de potencial de acción de electrodos agudos. Estas preparaciones multicelulares proporcionan una estructura de tejido conservada in vivo como, lo que los convierte en un valioso modelo para estudios electrofisiológicos y farmacológicos in vitro .

Racimos del corazón ventricular de eje corto murino para estudios electrofisiológicos

El objetivo de este estudio fue establecer un método para investigar la dinámica cardíaca utilizando un modelo animal traslacional. El enfoque experimental descrito incorpora optocardiografía de doble emisión junto con un estudio electrofisiológico para evaluar la actividad eléctrica en un modelo de corazón porcino aislado e intacto.

Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff

Este protocolo describe el procedimiento para secimiento y cultivo de rebanadas cardíacas humanas para pruebas de fármacos preclínicos y detalla el uso de mapeo óptico para registrar el voltaje transmembrano y las señales de calcio intracelular simultáneamente a partir de estas rebanadas.

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Se describe un método para el aislamiento simultáneo de micocitos y no miocitos tanto de las adriículas como de los ventrículos de un solo corazón de ratón adulto. Este protocolo da como resultado rendimientos consistentes de micocitos cardíacos altamente viables y no miocitos y detalla condiciones óptimas de cultivo específicos de células para fenotipado y análisis in vitro.

Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

Aquí se presenta un protocolo para preservar la contractilidad vascular del tejido pulmonar murino PCLS, lo que resulta en una imagen tridimensional sofisticada de la vasculatura pulmonar y las vías respiratorias, que se puede preservar hasta por 10 días que es susceptible a numerosos procedimientos.

Cortes pulmonares de corte de precisión como herramienta eficiente para estudios ex vivo de estructura de vasos pulmonares y contractilidad

La terapia génica miocárdica para la cardiopatía isquémica es muy prometedora para futuras terapias. Aquí, presentamos un modelo animal grande para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico.

Modelo animal grande para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico

Aprenda a cortar y cultivar secciones de tejido cardíaco de cerdo durante seis días en condiciones fisiológicas. Este método permite evaluar la eficacia de terapias para la insuficiencia cardíaca y probar la toxicidad cardíaca aguda de fármacos.

Cortar y cultuar corazones de cerdo bajo condiciones fisiológicas

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