Name: Un ensayo de crecimiento de neurita y evaluación de neurotoxicidad con neuronas derivadas de células de progenitor neuronales humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T15:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Aprende a realizar un ensayo de crecimiento de neurita y evaluar neurotoxicidad utilizando neuronas derivadas de células progenitoras neuronales humanas. Este método ofrece alta relevancia fisiológica para el descubrimiento de fármacos.

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Esta investigación fue financiada por la beca de investigación NIMAD (940714) otorgada a MAF.

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<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145 (6), 831-834 (2011).</li>
<li>Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomic+phenotyping+of+cell+lines+and+primary+cells+to+assess+preservation+of+cell+type-specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).</li>
<li>Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+profiling+of+primary+versus+immortalized+human+RPE+cells+identifies+expression+patterns+associated+with+cytoskeletal+remodeling+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival.</a> Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).</li>
<li>Yeo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Neural+Lineages+as+In+Vitro+Models+for+Screening+the+Neuroprotective+Properties+of+Lignosus+rhinocerus+%28Cooke%29+Ryvarden%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden.</a> BioMed Research International. 2019, (2019).</li>
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Todos los autores no indican posibles conflictos de intereses.

Este protocolo es uno de los pocos artículos publicados que describen la prueba de la longitud de la neurita tras el tratamiento con compuestos de prueba. Además, describimos cómo utilizar hNPCs para un ensayo de crecimiento de neurita y una evaluación de neurotoxicidad. Mediante la utilización de este ensayo de crecimiento de neurita y la evaluación de la neurotoxicidad en las neuronas derivadas de hNPCs, se demuestra el potencial neurogénico de una categoría de compuestos epigenéticos de moléculas pequeñas, inhibidores...

El crecimiento de la neurita es un proceso fundamental para la formación de la red neuronal y la regeneración nerviosa1,2. Después de una lesión, el crecimiento de la neurita juega un papel clave en la regeneración del sistema nervioso. El crecimiento de la neurita es también un elemento importante de la señalización extracelular en la inducción de actividades regenerativas neuronales para mejorar los resultados de los trastornos neurodegenerativos y lesiones neuronales3,,4,5,6.
Al mantener su potencial de diferenciación en la producción de varios linajes neuronales, las células progenitoras neuronales humanas (hNPC) podrían proporcionar un sistema modelo para los estudios de la función del sistema nervioso central (SNC) y el desarrollo7,,8,,9. El alto potencial traslacional y la relevancia fisiológica de los hNPC como modelo de células humanas primarias ofrecen una ventaja considerable en las pruebas de descubrimiento de fármacos relacionadas con el crecimiento de neuritas. Sin embargo, el mantenimiento y escalado de los modelos de células primarias para ensayos de alto rendimiento podría ser lento y laborioso10,,11,12,13.
Además de la aplicación del método presentado en estudios de crecimiento de neuritas, la evaluación de la neurotoxicidad es otra aplicación utilizando las neuronas derivadas de hNPC. Hay miles de compuestos químicos comerciales que no se examinan o con potencial de neurotoxicidad mal entendido. Por lo tanto, experimentos de cribado más fiables y eficaces para evaluar, distinguir y clasificar compuestos en función de su potencial para provocar neurotoxicidad del desarrollo está en alta demanda14. El aumento de la prevalencia y la incidencia de trastornos neurológicos junto con la abundancia de compuestos no probados en el medio ambiente requiere el desarrollo de experimentos más fiables y eficientes para identificar compuestos ambientales peligrosos que puedan suponer neurotoxicidad15.
El método presentado aquí se puede utilizar para detectar la capacidad de los compuestos para inducir el crecimiento de la neurita y la neurotoxicidad aprovechando las neuronas derivadas de células progenitoras neuronales humanas, un modelo celular que representa estrechamente la biología humana.

<table><tbody><tr><td>Portaobjetos de cámara de vidrio de 4 pocillos</td><td>Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&beta;-Tubulina III</td><td>Thermo</td><td>MA1-118X</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo</td><td></td><td></td>17504001</tr><tr><td>B27 - menos vitamina A</td><td>Thermo</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning</td><td>432000</td><td>Contenedores de congelación de celdas que garantizan una tasa controlada estandarizada -1&#176; Congelación de celdas C/minuto en un -80&#176; C congelador</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td>Medio de criopreservación que contiene 10% DMSO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869-100ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EGF Gibco</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Gibco</td><td>PHG6015</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Thermo</td><td>FB002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco 35050061 Suplemento</td><td></td><td>de L-alanil-L-glutamina</td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Thermo</td><td>50062Z</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Calbiochem</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-Ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A92902-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>StemCell Technologies</td><td>5854</td><td>Medio de criopreservación sin suero diseñado para la criopreservación de células madre pluripotentes embrionarias humanas</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384-Pocillos Microplacas de poliestireno blanco</td><td>Thermo</td><td>164610</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P5899-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Mountant Antidecoloración</td><td>Thermo</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Reactivo de disociación celular que contiene enzimas proteolíticas y colagenolíticas</td></tr><tr><td>Sinaptofisina</td><td>Thermo</td><td>MA5-14532</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo de crecimiento de neurita y evaluación de neurotoxicidad con neuronas derivadas de células de progenitor neuronales humanos

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

El ensayo de crecimiento de la neurita y la evaluación de la neurotoxicidad son dos estudios principales que se pueden realizar utilizando el método presentado en el presente documento. Este protocolo proporciona un análisis fiable de la morfología neuronal junto con mediciones cuantitativas de modificaciones en la longitud de la neurita y la localización de proteínas sinápticas y abundancia en el tratamiento con compuestos de moléculas pequeñas. Además de la aplicación del método presentado en estudios de crecimiento de neuritas, se puede realizar una evaluación de la neurotoxicidad para evaluar, distinguir y clasificar los compuestos químicos comerciales en función de su posible efecto de neurotoxicidad del desarrollo.
A pesar de que las líneas celulares se utilizan hoy en día en ensayos de cribado compuestos en neurociencia, a menudo difieren genética y fenotípicamente de su origen tisular. Las células primarias, por otro lado, mantienen marcadores y funciones importantes observados in vivo. Por lo tanto, debido al potencial de traducción y la relevancia fisiológica que estas células podrían ofrecer un ensayo de crecimiento de neurita y la evaluación de la neurotoxicidad puede beneficiarse considerablemente del uso de células progenitoras neuronales humanas (hNPC) como el modelo de células humanas primarias.
El método presentado aquí se puede utilizar para detectar la capacidad de los compuestos para inducir el crecimiento de la neurita y la neurotoxicidad aprovechando las neuronas derivadas de células progenitoras neuronales humanas, un modelo celular que representa estrechamente la biología humana."

El protocolo presentado en el manuscrito se ha utilizado con éxito en dos artículos publicados recientemente22,,23. La Figura 3 demuestra el uso de neuronas derivadas de hNPCs en el examen del efecto de los inhibidores de la HDAC como compuestos epigenéticos en la extensión de las neuritas como marcador para el crecimiento de la neurita y la posterior capacidad neurogénica de compuestos de moléculas pequeñas.
<p class="jove_conte...

El protocolo presentado describe un método para un ensayo de crecimiento de neurito y la evaluación de la neurotoxicidad de compuestos de moléculas pequeñas.

Un ensayo de crecimiento de neurita y evaluación de neurotoxicidad con neuronas derivadas de células de progenitor neuronales humanos

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

El protocolo presentado que describe el ensayo de crecimiento de neurita que es muy relevante para la evaluación de la biología humana y la neurotoxicidad de un compuesto de molécula pequeña. El alto potencial traslacional y la relevancia fisiológica de las células progenitoras neuronales humanas como el modelo de células humanas primarias ofrecen una ventaja considerable en el cribado de fármacos relacionados con el crecimiento de neuritas y la evaluación de la neurotoxicidad. Utilizando el protocolo presentado, las células madre pluripotentes inducidas por humanos y las neuronas derivadas de células madre embrionarias humanas también se pueden utilizar en cuanto a fuentes celulares alternativas para el ensayo de crecimiento de neurito y la evaluación de la neurotoxicidad.Comience por recolectar los medios con neuroesferas flotantes y transferirlos a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar el tubo a 300 a 400 veces g durante tres minutos. Entonces aspira cuidadosamente el sobrenadante.y resuspender las esferas en 500 microlitros de reactivo de disociación celular descongelada. Incubar las esferas a 37 grados centígrados durante cinco a 15 minutos. Luego agregue de cinco a 10

a-neurite-outgrowth-assay-neurotoxicity-assessment-with-human-neural

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este artículo describe un nuevo protocolo y el reactivo conjunto diseñado para la medición sensible de los efectos neurotóxicos de los compuestos y los tratamientos en co-cultivos de neuronas y astrocitos utilizando el análisis de contenido de alta. Los resultados demuestran que el análisis de contenido de alta tecnología representa una apasionante novela para la evaluación de la neurotoxicidad.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

Hemos establecido un protocolo para la inducción de los neuroblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de progenitores neuronales humanos y los tipos de células neuronales en el desarrollo del SNC para la reparación neural.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Este protocolo de vídeo demuestra un método novedoso para la generación y la posterior purificación de las células progenitoras neuronales de una fuente renovable de células madre neurales (NSC) en base a su físico (granularidad tamaño e interna) y las propiedades fluorescentes utilizando la tecnología de citometría de flujo.

El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo

Este video muestra el ensayo de migración de la neurosfera de células precursoras neurales, un ensayo in vitro para estudiar la respuesta migratoria de las células precursoras neurales de la neurosfera, a través de un análisis microscópico.

Ensayo de la neurosfera NPC: un ensayo in vitro para evaluar la respuesta migratoria de las células precursoras neurales de la neurosfera

En este video, describimos un método basado en luminiscencia para evaluar la neurotoxicidad de los compuestos de moléculas pequeñas promotores del crecimiento de neuritas en la viabilidad de las neuronas derivadas de hNPC. El ensayo mide el nivel de ATP intracelular, un indicador de la viabilidad celular, para evaluar la neurotoxicidad después del tratamiento con compuestos de ensayo.

Ensayo basado en luminiscencia para evaluar la neurotoxicidad de los compuestos de ensayo en las neuronas

Con la intención de caracterizar los cambios en los miRNAs en células madre neurales humanas diferenciadas (hNSCs) describimos la diferenciación de hNSC en un sistema tridimensional, la evaluación de los cambios en la expresión de microRNA por la matriz de PCR de miRNA, y el análisis computacional para la predicción de objetivos de miRNA y su validación por ensayo de luciferasa dual.

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

Es fundamental en neurobiología y neurovirología tener un sistema in vitro fiable y replicable que sirva como modelo traslacional para lo que ocurre in vivo en las neuronas humanas. Este protocolo describe cómo cultivar y diferenciar células de neuroblastoma humano SH-SY5Y en neuronas viables para su uso en aplicaciones in vitro.

La diferenciación de la línea celular SH-SY5Y de neuroblastoma humano

Las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (HiPSCs) se consideran una herramienta poderosa para la detección de drogas y químicos y para el desarrollo de nuevos modelos in vitro para pruebas de toxicidad, incluyendo neurotoxicidad. Aquí, se describe un protocolo detallado para la diferenciación de hiPSCs en neuronas y glia.

Protocolo para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos en cultivos mixtos de neuronas y glia para pruebas de neurotoxicidad

Desarrollo neurológico procesos como proliferación, migración y consecuencia del neurite son a menudo perturbados en enfermedades neuropsiquiátricas. Así, presentamos protocolos evaluar rápida y reproducible estos procesos del neurodesarrollo en NPCs humanos derivado de iPSC. Estos protocolos permiten la evaluación de los efectos relevantes factores de crecimiento y terapias en desarrollo de NPC.

Rápida detección de los fenotipos del neurodesarrollo en las células precursoras neuronales humanos (PNJ)

Este protocolo describe un procedimiento detallado para recuperar y cultivar neuronas derivadas de células madre humanas que previamente se diferenciaron de los progenitores neuronales in vitro durante varias semanas. El procedimiento facilita ensayos basados en imágenes de neurótesis, sinapsis y marcadores neuronales de expresión tardía en un formato compatible con microscopía ligera y cribado de alto contenido.

Replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis

En este informe, describimos un protocolo simple para estudiar el crecimiento de neurita en neuronas corticales de rata embrionaria mediante la co-transfección con EGFP y la proteína de interés.

Un ensayo mejorado basado en proteínas de fluorescencia verde para el estudio del crecimiento de neurita en las neuronas primarias

Aprende a realizar un ensayo de crecimiento de neurita y evaluar neurotoxicidad utilizando neuronas derivadas de células progenitoras neuronales humanas. Este método ofrece alta relevancia fisiológica para el descubrimiento de fármacos.

Un ensayo de crecimiento de neurita y evaluación de neurotoxicidad con neuronas derivadas de células de progenitor neuronales humanos (Video) | JoVE Journal

Un ensayo de crecimiento de neurita y evaluación de neurotoxicidad con neuronas derivadas de células de progenitor neuronales humanos

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