Name: Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Aprenda el método de entrega intra-arterial de células madre neuronales en ratas y ratones para terapia de isquemia cerebral. Esta técnica permite la distribución amplia y detección de células hasta 30 días post-inyección.

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Esta investigación fue apoyada por lo siguiente: Premio AHA 14SDG20480186 para LC, equipo de innovación de asignaturas de la Universidad De Shanxi de Medicina China 2019-QN07 para BZ, y Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust subvención 14-12A para KES y LC.

Todos los procedimientos en temas animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) de la Universidad de Kentucky, y se tomó el cuidado adecuado para minimizar el estrés o el dolor asociado con la cirugía.
1. Preparación del catéter de inyección y ganchos quirúrgicos
<ol><li>Construir el catéter de inyección (Figura 1). Reúna los materiales necesarios, incluyendo: tubos MRE010, MRE025 y MRE050, agujas de inyección de 20 G, 26 G y 27 G(Figura 2A),papel de lija de grano 600, superpege y epoxi de dos componentes de 5 minutos.<ol>
<li>Cortar 20 G y 26 G agujas a 1 cm del cubo de la aguja y pulir el extremo en papel de lija (Figura 2B). Enjuague las agujas con 10 ml de agua doble destilada para limpiar el orificio de la aguja. NOTA: Se utilizan dos diseños diferentes (Figura 1). El diseño 1 tiene un solo conector y se utiliza para la inyección de soluciones o suspensiones. El diseño 2 tiene conectores de bloqueo Luer de 20 G y 26 G para inyección de células (aguja de 20 G) y enjuague del volumen muerto (aguja de 26 G) para garantizar la entrega del volumen completo de la solución que contiene NSC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diseño 1: Inserte un catéter MRE010 de 3-4 cm de longitud en un catéter MRE025 de 15 cm de longitud y fije con superpegamento.<ol>
<li>Conecte el otro extremo del tubo MRE025 a un segmento del catéter MRE050 y asegúrelo con superpegamento. Inserte una aguja opaca de 20 G en el extremo restante del catéter MRE050 y asegúrela con superpegamento (Figura 1).</li>
		<li>Refuerce aún más los sitios de conexión con pegamento epoxi. Este diseño de catéter es óptimo para la inyección de reactivos (como soluciones químicas o farmacológicas u otros productos biológicos como citoquinas).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diseño 2: Inserte un catéter MRE010 de 3-4 cm de longitud en un catéter MRE025 de 15 cm de longitud y fije con superpegamento.<ol>
<li>Conecte el otro extremo del tubo MRE025 a un segmento del catéter MRE050 y asegúrelo con superpegamento. Inserte una aguja opaca de 20 G en el extremo restante del catéter MRE050 y asegúrela con el superpegamento.</li>
		<li>Inserte una aguja opaca de 26 G en el tubo MRE050 cerca de la punta de la primera aguja, siguiendo la dirección del flujo de inyección, y asegúrela con superpegamento(Figura 1 y Figura 2C). Refuerce tanto las agujas como el segmento del tubo MRE050 con epoxi transparente(Figura 2C). Este diseño permite la inyección de la solución del vehículo a través de la aguja 2 (26 G) después de la inyección NSC a través de la aguja 1 (20 G) para vaciar el volumen muerto en el catéter en la circulación cerebral, logrando un control más preciso de los volúmenes de inyección.</li>
		<li>Utilice una aguja de 20 G para la inyección de NSC con el fin de minimizar el daño a los NSC, lo que podría afectar negativamente a la viabilidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la construcción, lavar los catéteres con 10 ml de agua doble destilada, seguido de 70% de etanol, y luego remojarlos en 70% de etanol durante la noche.</li>
	<li>Antes de la cirugía, retire los catéteres de 70% de etanol y enjuague con 10 ml de PBS estéril, y colóquelos en una caja de herramientas quirúrgica autoclave para almacenamiento y transporte.</li>
	<li>Preparación de los ganchos quirúrgicos<ol>
<li>Corte un eje de aguja de 1,5 cm de largo de una aguja de 27 G, y pula ambos extremos en papel de lija hasta que estén apagados. A continuación, utilice una pequeña abrazadera hemostática para doblar el eje en un gancho en un extremo y una forma de anillo en el otro extremo.</li>
		<li>Inserte un catéter MRE025 de 10-15 cm de largo a través del anillo y asegúrelo con cinta quirúrgica transparente(Figura 2D). Haz 2 ganchos más usando el mismo método.</li>
		<li>Remoje todos los ganchos y sistemas de catéter en 70% etanol hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación animal: Entrega, vivienda, adaptación al medio ambiente
<ol><li>En este estudio se utilizaron ratones C57BL/6 machos y hembras (10-12 semanas, no10/punto de tiempo) y ratas Wistar (10-12 semanas, n.o 10).</li>
	<li>Alojarlos en un vivarium animal ambientalmente controlado con alimentos y agua ad libitum.</li>
	<li>Permita que se adapten al medio ambiente al menos 1 semana antes de la cirugía de accidente cerebrovascular. NOTA: Un ratón y una rata murieron a 1 d después de la cirugía de accidente cerebrovascular y un ratón fue eutanizado a las 3 d después del accidente cerebrovascular antes de la inyección de NSC por razones humanas debido a una parálisis grave.</li>
</ol>3. Cultivo de células madre neurales de ratón y rata (NSC)
NOTA: Los INE se aislaron y cultivaron siguiendo un protocolo establecido20.
<ol><li>Ratón<ol>
<li>Aísle los NSC con etiqueta de tipo salvaje (WT) y GFP de la corteza embrionaria E18 de ratones C57BL/6 hembras de embarazo cronolagado acoplados con ratones machoS positivos en GFP (B6 ACTb-EGFP). Para identificar embriones GFP (+), observe los embriones cosechados en un microscopio de fluorescencia utilizando el canal FITC. Los embriones GFP (+) producen una señal de fluorescencia verde, mientras que los embriones WT muestran sólo una autofluorescencia débil(Figura 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rata<ol>
<li>Aísle los ISN de la zona subventricular (SVZ) de ratas CON WT de adultos jóvenes. Etiquetarlos con DiI justo antes de la inyección siguiendo las instrucciones del fabricante21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultivo de ratón o rata NSCs hasta que se convierten en neuroesferas, y pasarlos cuando el diámetro de la esfera alcanza alrededor de 100 m(Figura 3B). Utilice los NSC para la inyección entre los pasajes 3 y 5.</li>
	<li>Verifique sus propiedades de células madre utilizando un panel marcador de células madre embrionarias (Figura 3C).</li>
	<li>El día de la inyección, recoja las esferas NSC y disocia con la solución de desprendimiento celular, suspenda en PBS libre de calcio y magnesio a una concentración de 107 células/ml, y colóquelo sobre hielo húmedo hasta la inyección.</li>
</ol>4. Preparación quirúrgica
<ol><li>Antes de la cirugía, marque un punto en la sutura comercial MCAO con un rotulador de plata a 9 mm (para ratón) o 15 mm (para rata) desde la punta para la referencia en cirugía de la longitud de inserción. Autoclave las herramientas quirúrgicas (tijeras, fórceps) y los instrumentos antes de cada cirugía, y esterilizar térmicamente en un esterilizador de cuentas de vidrio entre operaciones.</li>
	<li>Inducir la anestesia en animales con 5% de isoflurano por inhalación y mantener la anestesia con 1-2% de isoflurano. Evaluar la profundidad de la anestesia a través de la observación de las condiciones generales (patrón de respiración, movimiento del bigote, y postura de corrección espontánea del cuerpo), reflejo corneal y respuesta a la pellizca del dedo del dedo del final.</li>
	<li>Poner el animal supino en una almohadilla de calentamiento, y preparar el sitio quirúrgico en el animal mediante el recorte y lavado con solución de betadina seguido de 70% etanol. Proteja los ojos del animal del secado aplicando pomada oftalmológica (por ejemplo, pomada de lágrima artificial) durante la cirugía.</li>
	<li>Pida a los cirujanos que se froten bien las manos con un exfoliante bacteriocida y usen una máscara, guantes estériles y una capa de laboratorio limpia.</li>
</ol>5. Cirugía de accidente cerebrovascular de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO)
NOTA: Las cirugías para inducir un accidente cerebrovascular isquémico en un hemisferio de ratón o rata son similares en que se introduce una sutura en la arteria carótida interna (ICA) para ocluir el flujo sanguíneo (Figura 4)17,18,19,22. Sin embargo, la arteria seleccionada para la inserción de sutura difiere en función del espacio de operación disponible necesario para la posterior inyección de células madre. La rata tiene un amplio espacio en el segmento de la arteria carótida externa (ECA) para permitir dos cirugías secuenciales separadas (inyección de accidente cerebrovascular y NSC), pero el ratón no, que requiere un enfoque alternativo. Se han notificado cambios en el flujo sanguíneo cerebral inducido por accidente cerebrovascular, tamaño del infarto cerebral y déficits neurológicos como en los informes anteriores de los autores17,,18,,19.
<ol><li>Para inducir un accidente cerebrovascular isquémico, comiencen las cirugías de ratón y de rata con una incisión de línea media en la zona cervical, y el aislamiento de la arteria carótida común izquierda (CCA), ECA e ICA (Figura 4). Tenga cuidado de no estirar, desplazar o apretar el nervio CCA o vago. Dado que la selección de la arteria y los pasos quirúrgicos son diferentes a partir de entonces, la cirugía de MCAO en el ratón y la rata se describirá por separado.</li>
	<li>Cirugía MCAO en el ratón (Figura 4A)<ol>
<li>Colocar tres suturas trenzadas de nylon 6-0 bajo la CCA(Figura 4A, paso 1), y hacer un nudo quirúrgico apretado para ocluir el recipiente lo más lejos posible de la bifurcación utilizando la cuerda proximal(Figura 4A, paso 2). Recorta los extremos de la sutura.</li>
		<li>Haga un slipknot en el lado distal de CCA (precaución: no apriete demasiado, ya que se liberará en el paso 6) y un slipknot suelto entre los dos nudos apretados(Figura 4A, paso 2).</li>
		<li>Cortar una pequeña incisión (1/4 - 1/3 de la circunferencia) cerca del nudo proximal en la CCA con microscisores(Figura 4A, paso 3), e insertar cuidadosamente la sutura maciza de nylon de caucho de silicona comercial recubierta 7-0 (Figura 4A,paso 4). Asegure esta sutura con la cuerda media, apretando lo suficiente(Figura 4A, paso 5) para asegurar que no haya fugas de sangre de la incisión y sin movimiento del filamento de nylon recubierto de caucho de silicona por el contraflujo de ICA, mientras que todavía permite el avance de la sutura hacia el ECA con un suave empuje por las pinzas.</li>
		<li>Suelte el dendo superior (distal)(Figura 4A, paso 6) y avance la sutura de nylon en el ICA hasta que su punta pase la bifurcación durante 9 mm (utilizando el marcador de plata en la sutura como referencia). Apriete los dos trozos superiores para asegurar la sutura y evitar el flujo sanguíneo.</li>
		<li>Retirar el filamento 1 h más tarde(Figura 4A, paso 7) y ligar el CCA usando el nudo medio para prevenir el sangrado (Figura 4A, pasos 5-7 en orden inverso, resultados finales como se ve en el paso 8). Suelte el nudo superior. Cierre la herida con una sutura quirúrgica 4-0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cirugía MCAO en rata(Figura 4B)<ol>
<li>Coloque dos suturas trenzadas de nylon 6-0 bajo el ECA(Figura 4B, paso 1), y haga un nudo apretado en el extremo distal lo más lejos posible(Figura 4B, paso 2).</li>
		<li>Coloque los clips de los vasos en el ICA y CCA para ocluir el flujo sanguíneo arterial(Figura 4B,paso 3). Un slipknot se puede utilizar como alternativa para un clip de recipiente.</li>
		<li>Haga una pequeña incisión en el TCE con microscisores(Figura 4B, pasos 3-4), inserte un filamento de nylon de goma de silicona comercial recubierto de 6-0(Figura 4B, paso 5), y asegure correctamente con un slipknot en el ECA.</li>
		<li>Suelte el clip del recipiente en el ICA, avance el filamento en el ICA hasta que el marcador de plata (15 mm) alcance la bifurcación(Figura 4B, paso 6), y luego fije la sutura con el2o nudo en el ECA (Figura 4B, paso 6).</li>
		<li>Después de 1 h de isquemia, retire este filamento y ligar la incisión para evitar el sangrado(Figura 4B, paso 7), retire el clip del vaso de CCA (resultado final como en el paso 8), y cierre la herida con 4-0 sutura quirúrgica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Recuperación
<ol><li>Después de la cirugía de accidente cerebrovascular, coloque los animales en una almohadilla de calentamiento hasta que recuperen completamente la conciencia.</li>
	<li>Proporcionar analgesia mediante inyección subcutánea. Devuelva a los animales a sus jaulas de origen con acceso al agua y a los alimentos ad libitum.</li>
</ol>7. Inyección intra-arterial
<ol><li>Lave todo el catéter con 70% de etanol y remoje durante la noche hasta su uso. Justo antes de la inyección, conecte el bloqueo Luer de la aguja con una jeringa estéril y lave todo el lado lumen del sistema de catéter con 10 ml de PBS estéril.</li>
	<li>Ventana de tiempo y preparación para la inyección de NSC NOTA: Basado en la experiencia y los informes de otros equipos de investigación, el momento de la inyección de NSC es crucial para la supervivencia de ambos sujetos y los INEógenos exógenos. En nuestro estudio piloto, la inyección de NSC en los primeros puntos de tiempo (dentro de las primeras 6 h después de la reperfusión) condujo a una mayor mortalidad. Por lo tanto, probamos puntos de tiempo de inyección posteriores y determinamos la ventana de tiempo entre 2 d (48 h) a 3 d (72 h) después de un accidente cerebrovascular es seguro y tolerable para los animales, y es eficiente en lograr la distribución intraparenquimal de las NIC NSC.<ol>
<li>Ajuste la velocidad de inyección de la bomba de jeringa a 20 ml/min para ratones y 50 l/min para ratas. La velocidad excesiva o la duración de la inyección pueden dar lugar a una sobrecarga de volumen sistémica, a la que los ratones son más vulnerables que las ratas.</li>
		<li>En resumen, a las 3 d después de la cirugía de accidente cerebrovascular, anestesiar a los animales con isoflurano y ponerlos supinos sobre una almohadilla de calentamiento.</li>
		<li>Vuelva a abrir la herida cervical y exponga de nuevo la ECA, la ICA y la CCA(Figura 5, paso 1). Al igual que en las cirugías de accidente cerebrovascular, determinar la ruta de inyección en función de la especie. Utilice el CCA para la inyección NSC en el ratón, y el ECA para la rata23.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyección intra-arterial a través de la CCA en el ratón<ol>
<li>Coloque dos suturas de nylon trenzadas 6-0 debajo de la CCA. Cree un slipknot suelto con cada uno de ellos entre la bifurcación y los nudos inferiores de la cirugía de accidente cerebrovascular anterior(Figura 5, paso 2).</li>
		<li>Apriete el dendo superior y luego haga una pequeña incisión por encima del nudo inferior(Figura 5, paso 3). Inserte un catéter MRE010 a través de la incisión(Figura 5, paso 4) y fije con el nudo medio sin bloquear el flujo de inyección(Figura 5, paso 5). El flujo de sangre debe ser visible en el catéter al liberar el nudo superior y ajustar la posición del catéter.</li>
		<li>Coloque un clip de recipiente en el TCE, inyecte 1 x 106 GFP-NSC a través de este catéter a 20 l/min durante 5 min con una bomba de jeringa, seguido de un lavado con 50-100 l de PBS a la misma velocidad.</li>
		<li>Después de la inyección, ligar el CCA por encima de la incisión con el nudo de deslizamiento superior y retirar el catéter MRE010(Figura 5, paso 6). Apriete y recorte el nudo medio y el nudo superior. Retire el clip del recipiente del TCE. Refiera a la imagen final en el cuadro 5,paso 7.</li>
		<li>Cierre la herida con una sutura quirúrgica 4-0.</li>
		<li>Después de proporcionar una recuperación adecuada en una almohadilla de calentamiento y la inyección analgésica subcutánea, devolver a los animales a su jaula de origen.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyección intras arterial a través del TCE en rata<ol>
<li>Ocluir temporalmente el ECA y el CCA con clips de recipiente(Figura 5, paso 2).</li>
		<li>Haga una pequeña incisión en el lado proximal de ECA(Figura 5, paso 3), inserte el catéter MRE010 y asegure con un nudo(Figura 5, paso 4).</li>
		<li>Retire ambos clips de recipiente, inyecte 5 x10 6 NSCs en 100 l de PBS a 50 l/min durante 2 min, seguido de un vaciado con 50-100 l de PBS(Figura 5, paso 5) a la misma velocidad, utilizando una bomba de jeringa motorizada.</li>
		<li>Después de la inyección, ocluir de nuevo la CCA y la ECA con clips de recipiente y ligar el TCE en el lado proximal de la segunda incisión después de la retirada del catéter de inyección(Figura 5, paso 6).</li>
		<li>Retire los dos clips del recipiente(Figura 5, paso 7) y cierre la herida con una sutura quirúrgica 4-0.</li>
		<li>Después de proporcionar una recuperación adecuada en una almohadilla de calentamiento y la inyección analgésica subcutánea, devolver a los animales a su jaula de origen.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo histológico<ol>
<li>Recoger cerebros de ratones y ratas que recibieron accidente cerebrovascular isquémico seguido de inyección de NSC o solución del vehículo después de la eutanasia y perfusión intracardiaca con 4% de paraformaldehído a 1 d (ratón y rata), 7 d (ratón) y 30 d (ratón) después de la inyección. Cada uno de estos cuatro grupos consistía en 5 NSC y 5 animales inyectados en vehículos.</li>
		<li>Arreglar cerebros durante la noche y criopreservar en 30% sacarosa para 3 d.</li>
		<li>Incrustar los cerebros en el OCT, cortar a 40 m de espesor, y examinar la distribución de las NSC después de la inmunosumanidad con marcadores específicos de la célula, incluyendo proteína ácida fibribrillaria glial (GFAP, astrocitos), Tuj1 (neuronas maduras) y doblecortina (DCX, neuronas inmaduras). NOTA: Debido a la falta de una cepa de rata que expresa la GFP, utilizamos DiI, una etiqueta fluorescente transitoria, para los NSC de ratas, que sólo permite la observación relativamente a corto plazo. Por lo tanto, la distribución de NSC sólo se examinó a 1 d después del accidente cerebrovascular en ratas.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3, 20130001(2013).</li>
<li>Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Ischemic+Stroke+and+Ischemia-reperfusion+in+Mice+Using+the+Middle+Artery+Occlusion+Technique+and+Visualization+of+Infarct+Area%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Microsurgery+Infusion+Technique+for+Targeted+Substance+Delivery+into+the+CNS+via+the+Internal+Carotid+Artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Chua, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-arterial+injection+of+neural+stem+cells+using+a+microneedle+technique+does+not+cause+microembolic+strokes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).</li>
<li>Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+for+cell+transplantation+into+the+central+nervous+system%3A+Design+considerations+and+emerging+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Neurology+International%22%5BJournal%5D)">Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies.</a> Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).</li>
<li>Duma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intracerebroventricular+%28ICV%29+injection+of+autologous%2C+non-engineered%2C+adipose-derived+stromal+vascular+fraction+%28ADSVF%29+for+neurodegenerative+disorders%3A+results+of+a+3-year+phase+1+study+of+113+injections+in+31+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients.</a> Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).</li>
</ol>

La terapia con células madre para enfermedades neurológicas todavía se encuentra en una etapa exploratoria temprana. Un problema importante es que no existe un método establecido para la entrega suficiente de SCs o NSC en el cerebro.
Aunque se pueden detectar CCS/NSC exógenos en el cerebro después de la inyección intravenosa (IV), intraperitoneal (IP) o intraparenquimal/intracerebral, cada enfoque de administración tiene inconvenientes. Se estima que la población detectable dentro del cerebro ...

La terapia con células madre (SC) tiene un enorme potencial como tratamiento para enfermedades neurológicas, incluyendo accidente cerebrovascular, traumatismo craneoencefálico y demencia1,2,3,4,5,6. Sin embargo, un método eficiente para entregar SCs exógenos al cerebro enfermo sigue siendo problemático2,6,7,8,9,10,11,12,13. Los CC que se administran a través de vías de administración periféricas, incluidas las inyecciones intravenosas (IV) o intraperitoneales (IP), están sujetas a filtrado de primer paso en la microcirculación, especialmente en el pulmón, el hígado, el bazo y el músculo8,,9,,13,,14,lo que aumenta las posibilidades de acumulación de células en zonas no objetivo. El método de inyección intracerebral invasivo da como resultado daños localizados en el tejido cerebral y una distribución muy restringida de SCs cerca del lugar de inyección2,6,8,14,15,16. Recientemente hemos establecido un método de inyección intra-arterial basado en catéter para entregar SCs neuronales exógenos (NSC), que se describe aquí en un modelo de roedores de accidente cerebrovascular isquémico focal. Inducimos una lesión transitoria (1 h) de isquemia-reperfusión en un hemisferio utilizando un filamento recubierto de caucho de silicona para ocluir la arteria cerebral media izquierda (MCA) en el ratón o la rata17,,18,,19. En este modelo hemos observado reproduciblemente aproximadamente 75-85% depresión del flujo sanguíneo cerebral (CBF) en hemisferio ipsilateral con imágenes de laser Doppler o laser speckle17,,19,produciendo déficits neurológicos consistentes17,,18,,19.
Para ahorrar tiempo, el vídeo está configurado para reproducirse al doble de la velocidad normal y no se presentan procedimientos quirúrgicos rutinarios, como la preparación de la piel y el cierre de la herida con sutura y el uso y la configuración de la bomba de jeringa motorizada. El método de administración intra arterial de las CEN se demuestra en el contexto del modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) del accidente cerebrovascular experimental en roedores. Por lo tanto, incluimos el procedimiento de accidente cerebrovascular isquémico transitorio con el fin de demostrar más tarde cómo se realiza la segunda cirugía, la inyección intra-arterial, utilizando el sitio quirúrgico anterior en el mismo animal. La viabilidad de la administración intradesal de NSC en modelos de accidente cerebrovascular de roedores se demuestra mediante la evaluación de la distribución y supervivencia de las RSE exógenas. La eficacia del tratamiento con NSC para atenuar la patología cerebral y la disfunción neurológica se notificará por separado.

<table><tbody><tr><td>Aguja de 20 G</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305175</td><td>preparación del catéter de inyección aguja de</td></tr><tr><td>26 G</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305111</td><td>preparación de catéter de inyección</td></tr><tr><td>aguja de 27 G</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305136</td><td>preparación de catéter de inyección</td></tr><tr><td>4-0 NFS-2 sutura con aguja</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56905</td><td>cirugía</td></tr><tr><td>6-0 sutura de nailon</td><td>Teleflex/Braintree Scientific</td><td>104-s</td><td>cirugía</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7922</td> cuchilla de <td>solución de desprendimiento</td></tr><tr><td>de</td> células <td>Bard-Parker</td><td>10</td><td>cirugía</td></tr><tr><td>Buprenorfina-SR Lab</td><td>ZooPharm</td><td>Buprenorfina-SR Lab&reg;</td><td>Analgesia (0,6-1 mg/kg durante 3 d)</td></tr><tr><td>PBS libre de calcio/magnesio</td><td>VWR</td><td>02-0119-0500</td><td>Disociación NSC</td></tr><tr><td>DCX anticuerpo</td><td>Millipore</td><td>AB2253</td><td>inmunotinción</td></tr><tr><td>GFAP anticuerpo</td><td>Invitrogen</td><td>180063</td><td>inmunotinción</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50562-1</td><td>cirugía</td></tr><tr><td>Filamento MCAO para ratón</td><td>Doccol</td><td>702223PK5Re</td><td>cirugía</td></tr><tr><td>Filamento MCAO para rata</td><td>Doccol</td><td>503334PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>cirugía MRE010 catéter</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE010</td><td>preparación de catéter de inyección</td></tr><tr><td>MRE025 catéter</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE025</td><td>preparación de catéter de inyección</td></tr><tr><td>MRE050 catéter</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE050</td><td>preparación de catéter de inyección</td></tr><tr><td>Nu-Tears Ungüento</td><td>NuLife Pharmaceuticals</td><td>Nu-Tears Ungüento para el</td><td>cuidado de los ojos durante la cirugía</td></tr><tr><td>S& Pinzas en T - Puntas SuperGrip JF-5TC Angled</td><td>Fine Science Tools</td><td>00649-11</td><td>cirugía</td></tr><tr><td>S& Pinzas en T - Puntas SuperGrip JF-5TC rectas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>00632-11</td><td>cirugía</td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Pacer Technology</td><td>15187</td><td>preparación de catéter de inyección</td></tr><tr><td>bomba de jeringa</td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td></td></tr><tr><td>cirugía Tuj1 anticuerpo</td><td>Millipore</td><td>MAb1637</td><td>inmunotinción</td></tr><tr><td>bicomponente epoxi de 5 minutos</td><td>Devcon</td><td>20445</td><td>preparación del catéter de inyección</td></tr><tr><td>tijeras de resorte Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>pinzas vasculares para</td> cirugía <td>Fine Science Tools</td><td>00400-03</td><td></td></tr><tr><td>microscopio Zeiss para cirugía Microscopía Zeiss</td><td></td><td>Axio Imager 2</td><td></td></tr></tbody></table>

entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

La terapia con células madre neurales (NSC) es un tratamiento innovador emergente para accidentes cerebrovasculares, lesiones cerebrales traumáticas y trastornos neurodegenerativos. En comparación con la administración intracraneal, la administración intraextesal de INE es menos invasiva y produce una distribución más difusa de las RSE dentro del parénquima cerebral. Además, la administración intra arterial permite el efecto de primer paso en la circulación cerebral, disminuyendo el potencial de captura de células en órganos periféricos, como el hígado y el bazo, una complicación asociada con las inyecciones periféricas. Aquí, detallamos la metodología, tanto en ratones como en ratas, para la entrega de INE a través de la arteria carótida común (ratón) o la arteria carótida externa (rata) al hemisferio ipsilateral después de un accidente cerebrovascular isquémico. Utilizando NSC con etiqueta GFP, ilustramos la distribución generalizada lograda en todo el hemisferio ipsilateral de roedores a 1 d, 1 semana y 4 semanas después del parto postestémico, con una mayor densidad en o cerca del sitio de lesiones isquémicas. Además de la supervivencia a largo plazo, mostramos evidencia de diferenciación de células etiquetadas por GFP a las 4 semanas. El enfoque de entrega intra arterial descrito aquí para las INE también se puede utilizar para la administración de compuestos terapéuticos, y por lo tanto tiene una amplia aplicabilidad a diversos modelos de lesiones y enfermedades del SNC en múltiples especies.

Los ISC etiquetados por la GFP se detectaron fácilmente en el cerebro isquémico, principalmente en el hemisferio ipsilateral, especialmente en la penumbra y a lo largo del borde de la lesión (Figura 6). El examinador fue ciego durante la toma de imágenes y el análisis.
Por ejemplo, a 1 d después de la inyección, se detectaron NSC dentro del hipocampo del ratón. Un subconjunto de NSC mostró coexpresión del marcador de neurona inmaduro DCX en el giro dentado incluso...

Se ha notificado un método para la entrega de células madre neurales, adaptable para inyectar soluciones o suspensiones, a través de la arteria carótida común (ratón) o la arteria carótida externa (rata) después de un accidente cerebrovascular isquémico. Las células inyectadas se distribuyen ampliamente por todo el parénquima cerebral y se pueden detectar hasta 30 d después del parto.

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

El accidente cerebrovascular es la principal causa de mortalidad y discapacidad en todo el mundo. Aunque la trombólisis y la extirpación quirúrgica de la oclusión vascular cerebral se pueden realizar en pacientes seleccionados, todavía hay una necesidad urgente de terapias eficaces contra el accidente cerebrovascular. Aquí, demostramos una administración intra arterial basada en catéter de células madre al hemisferio isquémico como un régimen potencial para la terapia de accidente cerebrovascular.En primer lugar, presentamos cómo preparar el catéter de inyección y ganchos quirúrgicos. Diseñamos dos tipos de catéteres de inyección para la inyección intra-arterial. El diseño uno se utiliza para la inyección de una solución o suspensión que no requiere lavado del tubo.El diseño dos permite la inyección de células madre neurales, seguido de un lavado del volumen muerto para entregar todo el volumen. Para construir un conjunto de catéteres de inyección, necesitará agujas de calibre 26 y calibre 20, una longitud de 10 a 15 centímetros de catéter MRE 25 y tres centímetros de longitud de catéteres MRE 50 y MRE 10. Corte ambas puntas de aguja y pula el extremo metálico en el papel de lija p

intra-arterial-delivery-neural-stem-cells-to-rat-mouse-brain

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo describe un método no viral de la entrega de las construcciones genéticas en un área determinada del cerebro de roedor viviente. El método consiste en la preparación de plásmidos, fabricación micropipeta, la cirugía de las crías de rata neonatal, la microinyección de la construcción,...

Gen de entrega de cerebro de rata postnatal por la inyección no ventricular plásmido y electroporación

El modelo de inyección de sangre autóloga de la hemorragia intracerebral en ratones descritos en este protocolo se utiliza la técnica de doble inyección para minimizar el riesgo de reflujo de sangre hasta el trayecto de la aguja, no los anticoagulantes en el sistema de bombeo, y elimina todo el espacio muerto y el tubo extensible en el sistema.

Inyección de sangre autóloga al modelo hemorragia intracerebral espontánea en ratones

La arteria cerebral media (MCA) ligadura es una técnica para estudiar la isquemia cerebral focal en modelos animales. En este método, la arteria cerebral media se expone mediante craneotomía y se liga con cauterización. Este método da volumen del infarto altamente reproducible y el aumento de post-operatorio las tasas de supervivencia en comparación con otros métodos disponibles.

La aplicación de la Permanente Ligadura arteria cerebral media en el ratón

Se utilizan modelos preclínicos de hemorragia intracerebral para imitar ciertos aspectos de la enfermedad clínica. Por lo tanto, se pueden explorar los mecanismos de lesión y las posibles estrategias terapéuticas. En este protocolo se describen dos modelos de hemorragia intracerebral, inyecciones intraestriadas (ganglios basales) de sangre autóloga o colagenasa.

Inyección intraestriatal de sangre autóloga o clostridial colagenasa como modelos murinos de la hemorragia intracerebral

En este artículo se describe la metodología para la administración de cortos períodos de hipoxia intermitente para postnatales días 1-8 de ratón o rata crías. Este enfoque suscita efectivamente un nivel de tejido robusto "efecto priming" en células progenitoras neurales cultivadas que se cosechan en los 30 minutos de exposición a la hipoxia.

Entrega de<em&gt; En Vivo</em&gt; Aguda intermitente hipoxia neonatal en roedores a derivados de la Zona Prime subventricular progenitoras neurales Cultivos Celulares

Con el fin de estudiar la reorganización del cerebro en condiciones patológicas, utilizamos bombas miniosmóticas para la entrega directa de proteínas al cerebro, eludiendo la barrera hematoencefálica. A continuación, se inyectan trazadores del tracto para estudiar las alteraciones en la conectividad cerebral bajo la influencia de la proteína.

Implantación de miniosmótica Bombas y Entrega de Trazadores del Tracto para estudiar la reorganización del cerebro en condiciones fisiopatológicas

Las células madre son portadores terapéuticos prometedores para tratar tumores cerebrales debido a su tropismo tumoral intrínseco. La administración intranasal no intrusiva de células madre evita la barrera hematoencefálica y demuestra un fuerte potencial para la traducción clínica. Este artículo resume los principios básicos de la entrega de células madre intranasales en un modelo de ratón de glioma.

Entrega intranasal de células madre terapéuticas a glioblastoma en un modelo de ratón

Aquí, describimos un método para suministrar medicamentos al sistema nervioso central de la rata mediante la implantación de un catéter en el espacio intratecal lumbar de la columna vertebral. Nos centramos en la entrega de oligonucleótidos antisentido, aunque este método es adecuado para la entrega de otras modalidades terapéuticas también.

Entrega intratecal de oligonucleótidos antisentido en el sistema nervioso central de Rata

Células madre se investigan continuamente como tratamientos potenciales para individuos con daño miocárdico, sin embargo, su disminución de la viabilidad y retención dentro del tejido lesionado puede afectar su eficacia a largo plazo. En este manuscrito describimos un método alternativo para la entrega de células madre en un modelo murino de lesión por reperfusión de isquemia.

Retraso en la administración intramiocardio de células madre después de la lesión por reperfusión de isquemia en un modelo murino

La reparación de la arteria intracarótida en un modelo de ratón después de la inyección devuelve el flujo sanguíneo a la arteria sin afectar negativamente la distribución del material inyectado. La reparación en el lugar de la inyección facilita las inyecciones posteriores a través de la misma arteria y previene la isquemia cerebral en cepas de ratón que carecen de un Círculo de Willis completo.

Facilitación de la repetición de inyecciones intracarotídeas en modelos de ratón mediante una novedosa técnica de reparación en el lugar de la inyección

Aprenda el método de entrega intra-arterial de células madre neuronales en ratas y ratones para terapia de isquemia cerebral. Esta técnica permite la distribución amplia y detección de células hasta 30 días post-inyección.

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

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