Un modelo murino de exposición fetal a la inflamación materna para estudiar los efectos de la coleamnionitis aguda en el desarrollo intestinal neonatal

Desarrollamos un modelo de coleamnionitis para simular la exposición fetal a la inflamación materna (FEMI) sin complicaciones de organismos vivos para examinar los efectos del FEMI en el desarrollo del tracto intestinal de la descendencia. Esto permite el estudio de causas mecanicistas para el desarrollo de lesiones intestinales después de la coleamnionitis.

Este protocolo FEMI permite investigar los efectos a largo plazo para los neonatos después de la exposición fetal a la inflamación materna. Esto es especialmente relevante para el desarrollo de enterocolitis necrotizante, o ECN. Esta técnica imita la inflamación estéril que a menudo se observa en la corioamnionitis, y la falta de bacterias vivas puede tener efectos confusos en el tracto intestinal en desarrollo y el microbioma.

El paso más importante de este protocolo es la inyección de LPS para inducir FEMI. Es de vital importancia que se utilice una dosis adecuada de LPS y que la inyección no cause un traumatismo intraperitoneal en el ratón grávido. Comience diluyendo el caldo de LPS de uno a 100 con solución salina estéril para obtener una concentración de trabajo de 20 microgramos por mililitro.

Inyectar a las madres embarazadas el día de gestación E15. Pesar los ratones inmediatamente antes de la inyección para determinar la dosis adecuada de LPS, utilizando un volumen equivalente de solución salina normal para los animales de control. Agita la solución de LPS tres veces durante 15 segundos en altura.

A continuación, sácalo en una jeringa de un mililitro. Utilice la técnica de desaliño para sujetar a la rata embarazada y manténgala en la posición de decúbito dorsal. Inserte aproximadamente un cuarto a la mitad de una aguja de calibre 30 de ocho milímetros biselada hacia arriba, superponiendo el cuadrante inferior derecho del abdomen en un ángulo de 30 a 40 grados.

Tire hacia atrás del émbolo de la jeringa para asegurar la presión negativa. A continuación, proceda con la inyección si hay presión negativa. Monitoree a los ratones durante aproximadamente 30 minutos y luego devuélvalos a las jaulas durante el resto del embarazo.

Dar a luz a las crías por vía vaginal en E20 y permitirles permanecer con las madres, recibiendo alimentaciones ad libitum. Cosecha los intestinos en el día postnatal 14. Use tijeras y fórceps para hacer una incisión vertical a lo largo de la línea media del abdomen, a través de la piel y el peritoneo, a lo largo de todo el abdomen.

Extirpar el intestino delgado desde el estómago hasta el ciego y extraer el mesenterio. Aislar el tercio distal del intestino delgado, descartando el intestino delgado proximal, el ciego y el colon. Divida la porción del íleon por la mitad con unas tijeras.

A continuación, coloque la mitad proximal en una solución de estabilización de ARN para la cuantificación del ARN y la mitad distal en formol tamponado neutro al 10% para la preparación del portaobjetos. Divida el tejido incrustado en parafina en rodajas de cinco micrómetros de grosor y móntelas en portaobjetos de vidrio. Desparafinar los portaobjetos, luego teñir las secciones con hematoxilina y eosina de acuerdo con los procedimientos estándar.

Utilice la microscopía óptica para evaluar la lesión intestinal generalizada realizada por dos investigadores ciegos separados en una escala de tres puntos, evaluando la integridad de las vellosidades y la separación de la membrana basal. Asigne una puntuación de cero para describir la mucosa normal. Asigne una puntuación de uno para describir una lesión leve, que incluye el desarrollo del espacio de Gruenhagen subepitelial, la vacuolización o el levantamiento subepitelial limitado a la lámina propia o las puntas de las vellosidades.

Asigne una puntuación de dos para describir una lesión grave, indicada por elevación epitelial y vacuolización de más de la mitad de las vellosidades, distorsión de las vellosidades o ulceración de la mucosa y desintegración de la lámina propia. Sumerja los portaobjetos en xileno dos veces durante 10 minutos. Luego enjuáguelos con etanol al 100%.

Sumerja los portaobjetos durante tres minutos en etanol al 100 %, al 90 % de etanol, al 70 % de etanol y al 50 % de etanol. A continuación, lave los portaobjetos con agua corriente durante cinco minutos, alejando la sección del agua para evitar la pérdida de la muestra de tejido. Filtre la solución de tinte azul alcián con un filtro de café estándar y úselo para teñir los portaobjetos durante 15 minutos.

A continuación, lávelos con agua corriente del grifo durante dos minutos. Diluya un miligramo de ácido peryódico en 200 mililitros de agua bidestilada y sumerja los portaobjetos en esta solución durante cinco minutos. Después de un lavado de un minuto con agua corriente, tiñe los portaobjetos con el reactivo de Schiff durante 10 minutos y lávalos de nuevo durante cinco minutos.

A continuación, tíñelos con hematoxilina durante un minuto y lávalos con agua durante dos minutos. Sumérjalos en alcohol ácido durante un minuto, luego en agua del grifo de Scott durante un minuto, seguido de un lavado con agua corriente del grifo durante un minuto. Para deshidratar los portaobjetos, sumerja cada portaobjetos 10 veces en 70 % de etanol, 90 % de etanol y luego 100 % de etanol.

Sumerja los portaobjetos en etanol al 100% durante 10 minutos, seguido de una inmersión dos veces en xileno fresco durante tres minutos cada vez. Coloque una gota de medio de montaje en la muestra y un cubreobjetos en la parte superior. Cuente las células caliciformes bajo el microscopio.

Para cada pedazo de tejido intestinal, cuente el número de células caliciformes y 500 células epiteliales. A continuación, extraiga las células caliciformes como una proporción por cada 100 células epiteliales. Cuenta las células de Paneth.

Para cada pieza de tejido intestinal, registre la proporción de células de Paneth por cripta intestinal, contando 100 criptas intestinales por cada pieza de tejido intestinal. La exposición fetal a la inflamación materna (FEMI, por sus siglas en inglés) en el día embrionario 15 conduce a una pérdida del embarazo dependiente de la dosis y a una tasa de parto prematuro dependiente de la dosis. La FEMI induce una lesión intestinal importante al nacer y a las ocho semanas de vida.

Esta lesión se produce en ausencia de estímulos adicionales para los animales, lo que sugiere que la FEMI por sí sola interrumpe la homeostasis normal del tracto intestinal murino del recién nacido. Se cuantificó el número de células caliciformes productoras de mucina y células de Paneth productoras de péptidos antimicrobianos en el tercio distal del tracto intestinal delgado. Se encontró que el IAMIO alteró la composición normal del epitelio intestinal al inducir la pérdida de ambos tipos de células, en comparación con los animales sin IAM.

Para investigar los efectos de FEMI en la respuesta inflamatoria neonatal, se cuantificaron una variedad de marcadores inflamatorios séricos, incluidos interleucina-1 beta, interleucina-10, KCGRO e interleucina-6, del suero de cachorros con y sin FEMI. FEMI aumentó significativamente la cascada inflamatoria para todas las citocinas en P0. La cascada inflamatoria en edades posteriores difirió según el momento y la citocina. Curiosamente, hubo niveles similares de IL6 en P7 a P28 en los grupos FEMI y simulado.

Sin embargo, hubo niveles significativamente más altos en el grupo FEMI en P56, a pesar de que no hubo intervención secundaria. Es fundamental realizar una curva de dosis inicial de LPS, ya que las diferentes existencias de LPS pueden tener diferentes potencias. Hemos encontrado que nuestros resultados neonatales dependen de la dosis de LPS utilizada para inducir el FEMI.