Name: Aplicaciones de inmovilización de tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina para imágenes vivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprende a inmovilizar tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina para imágenes vivas. Este método minimiza la deriva y permite añadir y lavar reactivos durante la observación de procesos neuronales en tiempo real.

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El trabajo en el laboratorio Januschke está respaldado por las subvenciones fiduciarios Wellcome 100031/Z/12/A y 1000032/Z/12/A. La instalación de imágenes tisulares está respaldada por la subvención WT101468 de Wellcome.

<ol><li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744(2016).</li>
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<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li>
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<li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li>
<li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li>
<li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168(2017).</li>
<li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division%2C+differentiation+and+loss%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li>
<li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li>
<li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li>
<li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
<li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588(2013).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%3A+An+iIternational+Journal+On+the+Molecular%2C+Supramolecular+and+Evolutionary+Aspects+of+Chromosome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li>
<li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li>
<li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li>
<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li>
<li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166(2018).</li>
<li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745(2018).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
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<li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li>
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<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
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 <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las imágenes en vivo de cerebros larvarios enteros del monte D. melanogaster proporcionan la oportunidad de observar divisiones asimétricas de células madre neuronales en condiciones cercanas a un contexto fisiológico. La primera parte de nuestro protocolo introduce nuestro enfoque sobre la disección de cerebros larvarios. Como ya se ha dicho13,un aspecto crítico de la preparación es evitar dañar el cerebro. El aspecto más desafiante de esto es separar el cerebro de los discos imaginales vecinos sin tirar excesivamente sobre el cerebro. Nuestro enfoque para "cortar sin tirar" es realizar un movimiento de molienda con las puntas de un par de fórceps, o deslizar una punta de fórceps a lo largo de otras dos puntas de fórceps que sostienen la conexión entre los tejidos(Figura 1A),mientras que Lerit et al. describen los movimientos similares a las sierras con un pasador diseccionador. Aconsejamos al experimentador que pruebe todos los enfoques y adopte el más adecuado para sí mismos. También sugerimos el uso de puntas de pipeta recubiertas de BSA o FCS en lugar de herramientas de disección para transferir cerebros aislados. El revestimiento evita que los tejidos se peguen al plástico y permite la transferencia segura de los tejidos manteniendo siempre completamente sumergidos, sin someterlos a una posible deformación transitoria, ya que se adhieren a la herramienta de disección durante la transferencia. Las puntas recubiertas tienen otras ventajas para permitir la transferencia de varios cerebros a la vez, lo que es particularmente útil cuando es fundamental controlar el tiempo de residencia de las muestras dentro de un medio en particular; son adecuados para la transferencia de otros tejidos, incluso frágiles como, por ejemplo, cuerpos gordos; pueden acomodar una amplia gama de diferentes tamaños de muestra mediante el uso de puntas más grandes o el corte de la extremidad de la punta.
A continuación, este protocolo describe el uso de la coagulación de Fibrinogen para inmovilizar cerebros larvarios en la portada de un plato de cultivo. Un cerebro está orientado dentro de una gota de medio de cultivo + Fibrinógeno, después de lo cual la coagulación es inducida por la adición de trombina. La formación de fibrina es gradual, proporcionando una ventana de tiempo durante la cual la orientación de la muestra se puede ajustar, si es necesario (Figura 2C). Si se requiere una ligera compresión de la muestra - que aconsejamos en el caso de los cerebros larvarios - también se puede ajustar finamente presionando el coágulo más o menos cerca de la muestra durante los pasos 3.4.4 y 3.5.2. La principal ventaja de esta coagulación de Fibrinogen sobre el protocolo descrito en Lerit et al., en el que los cerebros se montan entre una membrana permeable al gas y un tubo de cubierta, es la capacidad de reemplazar el medio de cultivo durante las imágenes en vivo. Una posible ventaja de utilizar una membrana permeable al gas sobre nuestro protocolo podría ser que proporciona una oxigenación óptima de las muestras, que podría ser más limitada con nuestro enfoque a medida que los cerebros están separados del aire por el coágulo y algún medio. Por esta razón, aunque no evaluamos el efecto de la cantidad de medio de cultivo dentro del plato de cultivo, sugerimos limitar la cantidad de medio de cultivo encima de los coágulos manteniendo los coágulos completamente sumergidos.
Como la manipulación de los coágulos puede ser experimentalmente difícil y lenta, recomendamos que el experimentador primero practica manipular coágulos sin muestras. Modular el volumen de la gota de medio de cultivo + Fibrinógeno en el deslizamiento de cubierta, la concentración de Fibrinógeno o el volumen y concentración de trombina podría ayudar a facilitar la preparación y podría ser importante a la hora de adaptar el protocolo a otros tipos de tejidos. Con suficiente experiencia manipulando los coágulos, varios cerebros pueden ser inmovilizados en un coágulo si es necesario, aunque complica el ajuste de la orientación. Se pueden formar varios coágulos en el deslizamiento de cubierta, lo que permite, por ejemplo, tomar muestras de imágenes de diferentes genotipos. También es posible exponer diferentes coágulos en las mismas portadas a diferentes medios de cultivo, aunque hay que tener cuidado de no mezclar nunca las gotas de medio de cultivo que cubren los diferentes coágulos. Una vez que los cerebros larvarios están inmovilizados y listos para la toma de imágenes en vivo, aconsejamos seguir las recomendaciones de Lerit et al.13 para evitar el fotodamage excesivo. Sólo a estas recomendaciones nos sumamos no sólo para mantener los cerebros a 25 °C durante las imágenes en vivo con una incubadora de etapas, sino también para precalentar esta etapa durante al menos 30 minutos antes del inicio de la toma de imágenes. En nuestras manos, no hacerlo sistemáticamente resulta en una fuerte deriva de enfoque.
Puede ser ventajoso en algunos contextos poder realizar microscopía correlacionada y fijar e inmunodeprimar una muestra después de la toma de imágenes en vivo. Sin embargo, una limitación del uso de coágulos de Fibrin es que es casi imposible aislar mecánicamente un cerebro de un coágulo sin dañarlo. Una posible manera de superar esta limitación podría ser desarrollar métodos para degradar coágulos de Fibrina con Plasmin o para inducir el desmontaje del coágulo mediante la adición de un péptido imitando las perillas permitiendo la polimerización fibrina28. Normalmente usamos coágulos de fibrina en muestras que van desde células individuales hasta tejidos largos de 200 μM, pero también podríamos inmovilizarnos con éxito en coágulos y cerebros de imágenes de abejorros adultos de más de 3 mm de ancho. Queda por determinar el límite superior del tamaño de la muestra que se puede inmovilizar en coágulos. Del mismo modo, aunque normalmente tomamos muestras inmovilizadas de imagen durante 4 a 5 h, realizamos imágenes exitosas de neuroblastos en cultivo primario durante un período de hasta 3 días, lo que indica que el coágulo al menos no interfiere con la viabilidad a largo plazo. Por el contrario, los coágulos pueden facilitar la sustitución regular del medio, un requisito para la toma de imágenes a largo plazo, sin necesidad de dispositivos como bombas peristálticas para este fin. Si bien no hemos medido los parámetros de permeabilidad de los coágulos de fibrina, la naturaleza fibrosa similar al gel de los coágulos parece ser penetrable por moléculas permeables celulares. Encontramos que latrunculina A, Colcemid o 1-NAPP1, ligandos de etiqueta HALO y otros tintes estándar utilizados en la biología celular llegan a las células en el coágulo de fibrina sin ningún problema y hasta ahora no han encontrado moléculas que serían retenidas por el coágulo, que, sin embargo, es una posibilidad que necesita ser probada empíricamente.
En conclusión, el uso de coágulos de Fibrin proporciona una forma fiable y relativamente fácil de implementar una forma de inmovilizar los tejidos vivos para obtener imágenes en vivo. Más allá de su utilidad para limitar la deriva lateral, la capacidad de cambiar el medio de cultivo durante las imágenes en vivo ha demostrado ser invaluable para nuestro enfoque de genética química para estudiar la división celular asimétrica de los neuroblastos D. melanogaster 21. Anticipamos que esta técnica será beneficiosa para los estudios en una amplia gama de tejidos diferentes, particularmente si implican genética química o, por ejemplo, autoetiquetamiento de proteínas29.
Nuestra macro MultiHyperStackReg se basa en el plugin TurboReg ImageJ, que alinea fotogramas o sectores sucesivos de una pila, y el plugin MultiStackReg ImageJ, que permite aplicar las transformaciones a otras pilas. MultiHyperStackReg simplemente permite aplicar estas transformaciones a hiperstacks (pilas con al menos cuatro dimensiones). Como el uso de MultiHyperStackReg, como lo describimos, requiere muchas acciones y puede llevar bastante tiempo, también escribimos la macro AutoHyperStackReg, que realiza automáticamente todos los pasos descritos en los pasos 6.2 y 6.3. Sin embargo, contrariamente a MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg actualmente carece de la posibilidad de calcular la alineación de una pila basada en una subregión de esta pila, una opción que encontramos a veces es crucial para una alineación satisfactoria. Otra limitación de AutoHyperStackReg es que su uso está restringido a traducciones y no a las otras transformaciones propuestas por TurboReg y MultiStackReg, mientras que MultiHyperStackReg puede aplicar a un hiperstack cualquier tipo de transformación en caso de que el usuario lo necesite. Las versiones futuras implementarán estas funciones y estarán disponibles en GitHub30. Por último, nuestra macro de líneas giratorias puede ser una forma fácil de medir rápidamente las señales corticales en lapsos de tiempo, incluso si la corteza cambia su posición u orientación con el tiempo. Si su modo de seguimiento o su modo de no seguimiento es el más adecuado para el análisis depende de la calidad y consistencia de la señal cortical. El modo de seguimiento es más fácil de usar, ya que el usuario no necesita considerar dónde estará la corteza para cada punto de tiempo y puede acomodar grandes cambios de posición y orientación con el tiempo. Sin embargo, sólo es adecuado si la señal cortical sigue siendo lo suficientemente fuerte para su detección durante toda la película: una falla en la detección de cualquier otra cosa que no sea la corteza (por ejemplo, un compartimento citoplasmático brillante cerca de la corteza) puede comprometer la detección para cada punto de tiempo siguiente (por ejemplo, el compartimento citoplasmático se aleja de la corteza y las líneas corticales pueden seguirlo durante el resto del lapso de tiempo). El modo de no seguimiento no tiene este escollo, ya que la detección se limita a la línea dibujada originalmente por el usuario (por ejemplo, un compartimento citoplasmático brillante puede hacer que la detección falle durante unos pocos puntos de tiempo, pero a medida que el compartimento citoplasmático se aleja de la zona de detección, se reanuda la detección adecuada de la corteza), pero no se comporta bien si la posición o orientación de la corteza cambia mucho con el tiempo. La siguiente característica (que estará disponible en GitHub30)que se desarrollará para el modo de seguimiento será la opción de analizar solo los puntos de tiempo especificados y definir un punto de tiempo de referencia (en lugar del primer punto de tiempo) antes del cual y después de lo cual se realizará la detección, lo que permitirá al usuario al menos evitar puntos de tiempo problemáticos.

Drosophila sigue siendo un importante sistema modelo para estudiar una amplia gama de cuestiones biológicas y ha destacado en el avance del conocimiento en muchas disciplinas durante décadas. Una característica que lo hace particularmente destacado es que es especialmente adecuado para imágenes en vivo. La capacidad de monitorear los procesos subcelulares o el comportamiento de las células y los tejidos en tiempo real sigue contribuyendo a generar conceptos clave relevantes para la biología celular y del desarrollo. Muchos protocolos exitosos han sido desarrollados por diferentes grupos para mantener vivas y saludables estas muestras de Drosophila para estudiar el comportamiento de la muestra y las moléculas fluorescentes. Órganos y tejidos de la mosca como discos imaginales1,2,el cerebro larvario3,4,5,6,o cámaras de huevos de hembras adultas7,8,9,o el intestino adulto10 por ejemplo pueden ser extraídos y mantenidos en cultivo para imágenes con microscopía de lapso de tiempo. Un desafío clave para la toma de imágenes en vivo es asegurar que la muestra se mantenga cerca de la superficie de imágenes para una resolución óptima e inmóvil sin comprometer la integridad de la muestra que puede ser sensible a los impactos mecánicos. Para estudiar las células madre neuronales, llamadas neuroblastos o neuronas en el cerebro larvario de Drosophila, por ejemplo, mantener muestras cerca de la superficie de imágenes se puede lograr cubriéndolas con medios de cultivo en cámaras de imágenes selladas11,12,13. Sin embargo, este enfoque no permite fácilmente el intercambio de medios, lo que limita el margen de maniobra experimental. Alternativamente, las muestras se pueden preparar y colocar en coverslips tratados para aumentar la adherencia de las células y permitir la microscopía de visita multipunto y imágenes extendidas de células vivas en platos de cultivo abierto, que potencialmente permiten el intercambio de medios, pero no proporcionan medios fáciles para prevenir la deriva o pérdida de la muestra durante el intercambio de medios14,15.
El método de coágulo de Fibrin desarrollado originalmente para estudiar la meiosis en espermatozoides vivos de mosca de la grulla16 es específicamente adecuado para superar estos problemas. Fibringen se disuelve en un medio de cultivo relevante, las muestras colocadas y orientadas en una gota de esta solución en una cámara de imágenes de superficie de vidrio adecuada antes de que se agregue trombina, lo que resulta en la rápida formación de un coágulo de fibrina insoluble, una malla fibrosa pegajosa que se adhiere a la superficie de vidrio y las muestras al tiempo que garantiza el acceso de la muestra al medio de cultivo. A continuación, el medio se puede intercambiar sin perturbar el coágulo o la posición de la muestra. El intercambio medio de cultivo durante la toma de imágenes es, por ejemplo, deseable cuando se deben agregar inhibidores como en el método original o para experimentos de lavado o persecución de pulsos o cuando se añadirán colorantes fluorescentes durante las imágenes celulares vivas mientras se mantienen las células y los tejidos en su lugar. Los coágulos de fibrina son adecuados para la toma de imágenes de tejidos de Drosophila, así como células individuales13,17. Los coágulos de fibrina se pueden utilizar aún más para ayudar a orientar las muestras, que debido a su forma u otras propiedades normalmente no estarían orientados de la manera deseada mediante la modulación de la posición de la muestra dentro del coágulo de Fibrin y la forma del coágulo en sí.
Aquí proporcionamos una actualización sobre nuestros métodos actuales de imágenes basadas en coágulos de Fibrin y proporcionamos herramientas para el análisis de imágenes basado en segmentación y nos centramos en el uso de este método para estudiar las divisiones de neuroblastos en el cerebro mosca en desarrollo. Utilizamos rutinariamente el método de coágulo de Fibrin para seguir múltiples muestras en diferentes coágulos en el mismo plato de cultivo. Esto permite i) imágenes de eventos subcelulares como el comportamiento centroscósmico o la localización de ARNm en vivo18,19, ii) monitoreando el comportamiento de las muestras tras el tratamiento farmacológico de diferentes genotipos bajo la misma configuración de imágenes utilizando visitas multipunto microscopía20, iii) estudiar los efectos de la inhibición aguda de las enzimas21 y iv) minimizando la deriva para estudiar los cambios en la orientación de la división celular de las células dentro de su entorno fisiológico sobre la ablación láser dirigida22. Mientras que los efectos no deseados de trombina y fibrinógeno y el coágulo de Fibrin necesitan ser probados empíricamente para cada muestra, este método es en principio adecuado para inmovilizar cualquier tipo de muestra que deba ser analizada por imágenes de células vivas y en Drosophila se ha utilizado con éxito para estudiar múltiples aspectos de la biología de neuroblastos5,19,20,pero también la dinámica de las proyecciones de citosensores de las células madre de la línea germinal femenina23 y los cambios en la polaridad tras la inhibición aguda de las células folículos de las cámaras de huevos femeninos Drosophila 21.
Las imágenes fluorescentes de lapso de tiempo se traducen en la generación de conjuntos de datos 3D resueltos en el tiempo complejos que requieren métodos para extraer esta información cuantitativa. Aquí describimos nuestro desarrollo adicional de24 macros basadas en ImageJ que se pueden utilizar para corregir la deriva en hiperstacks y macros ImageJ hechas a medida que permiten la cuantificación semiautomática de fluorescencia multicanal en la corteza celular desarrollada para cuantificar proteínas corticales en neuroblastos de cerebros larvarios de Drosophila o de neuroblastos individuales en el cultivo celular primario.

<table><tbody><tr><td>Suero bovino de albúmina, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovie, apto para cultivo celular</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinógeno de plasma</td> <td>humanoSigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Placa de cultivo celular - 35 mm, pozo de 23 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analógico (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex placa puntual con nueve depresiones</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Medio de insectos de Schneider</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Trombina de plasma bovino</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicaciones de inmovilización de tejidos de drosophila con coágulos de fibrina para imágenes vivas

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila es un sistema modelo importante para estudiar una amplia gama de cuestiones biológicas. Varios órganos y tejidos de diferentes etapas de desarrollo de la mosca como discos imaginales, las cámaras larvarias del cerebro o del óvulo de las hembras adultas o el intestino adulto se pueden extraer y mantener en cultivo para la toma de imágenes con microscopía de lapso de tiempo, proporcionando información valiosa sobre la biología celular y del desarrollo. Aquí, describimos en detalle nuestro protocolo actual para la disección de los cerebros larvarios de Drosophila, y luego presentamos nuestro enfoque actual para inmovilizar y orientar cerebros larvarios y otros tejidos en un tubo de cubierta de vidrio usando coágulos de Fibrin. Este método de inmovilización sólo requiere la adición de Fibrinógeno y Trombina al medio de cultivo. Es adecuado para imágenes de lapso de tiempo de alta resolución en microscopios invertidos de múltiples muestras en el mismo plato de cultivo, minimiza la deriva lateral con frecuencia causada por los movimientos de la etapa del microscopio en microscopía visitante multipuntos y permite la adición y eliminación de reactivos durante el transcurso de la toma de imágenes. También presentamos macros hechas a medida que usamos rutinariamente para corregir la deriva y extraer y procesar información cuantitativa específica del análisis de lapso de tiempo.

Inmovilización de los tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina e intercambio medio de cultivo durante las imágenes en vivo. Después de ser diseccionados siguiendo el procedimiento presentado en el paso 2(Figura 1)e inmovilizados en coágulos de Fibrin en el mismo control de cubiertas después del procedimiento presentado en el paso 3(Figura 2),cerebros larvarios que expresan Bazooka etiquetado por GFP (Baz::GFP), el ortolog mosca de la proteína de polaridad Par-3, fueron imaginados durante 30 minutos en imágenes confocales de lapso de tiempo. Baz::GFP se combina con apkcas4,un alelo que permite la inhibición aguda de la proteína atípica quinasa C (aPKC) a través de la adición del pequeño analógico ATP 1-NAPP120. 1-NAPP1 se añadió al medio de cultivo después del procedimiento presentado en el paso 4 y se reanudaron las imágenes en vivo para las 2,5 h. Los cerebros de control que llevaban una versión de tipo salvaje de la quinasa aPKC no reaccionaron al análogo ATP, mientras que los cerebros portadores además de una mutación analógica sensible de aPKC(apkcas4) mostraron una contracción del neuroepithelium y grupos brillantes de Baz en neuroblastos y su progenie(Figura 6, Video 1). Los neuroblastos siguen dividiéndose a lo largo del lapso de tiempo, lo que indica que el tejido permanece sano, y los cerebros muestran poca deriva a pesar del cambio medio del cultivo, lo que indica que están bien inmovilizados. Del mismo modo, tras ser diseccionados tras el procedimiento presentado enel año 27,se inmovilizaron los coágulos de Fibrin en el mismo control de portadas e imágenes durante 8 minutos, tras lo cual la aplicación de 1-NAPP1 indujo la contracción de apkccomo4 células foliculares mutantes pero no de controles(Figura 7, Vídeo 2).
Corrección de deriva lateral y de enfoque mediante MultiHyperstackReg. Un hiperstack que muestra la deriva lateral y de enfoque(Video 3,panel izquierdo) se corrigió primero para la deriva lateral (paso 6.2, Figura 3, Video 3,panel central), luego deriva de enfoque (paso 6.3, Figura 4, Video 3,panel derecho) utilizando el plugin MultiStackReg y la macro MultiHyperstackReg, lo que resulta en una reducción sustancial de los movimientos observados en el hiperstack original.
Medición de señal cortical utilizando líneas giratorias Un neuroblasto que expresa Baz::GFP (verde) y la proteína transmembrana CD4 etiquetada con una proteína fluorescente infrarroja (CD4::mIFP, rojo) se imaginaron durante una mitosis. La señal CD4::mIFP se utilizó como referencia para detectar la corteza en varias partes del neuroblasto con linescans (paso 7, Figura 5, Figura 8A-C)y la señal Baz::GFP se midió en las posiciones detectadas Figura 8D). Durante su división, los neuroblastos se polarizaron transitoriamente estableciendo dominios corticales distintos y opuestos: el polo apical y el polo basal. Baz define el polo apical y, consistentemente, la señal Baz::GFP aumentó en el polo apical del neuroblasto y disminuyó en el polo basal durante la división(Figura 8C,D). La posición de la corteza fue rastreada satisfactoriamente durante todo el lapso de tiempo (Figura 8C, Video 4). Se hace referencia a las líneas y genotipos de Drosophila en la Tabla suplementaria 1–2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Figura 6: Aplicación de un análogo ATP en cerebros larvarios inmovilizados durante imágenes en vivo. (A) Imágenes en vivo de dos cerebros larvarios que expresan Baz::GFP inmovilizado en la misma portada. El medio de cultivo se cambia a una concentración de 10 μM del analógico ATP 1-NAPP1 a 0 min. Los cerebros de control no reaccionan visiblemente al análogo ATP, mientras que los cerebros portadores de una mutación sensible analógica de aPKC(aPKCAS4)muestran una contracción del neuroepithelium (puntas de flecha) y grupos brillantes de Baz en neuroblastos y su progenie. Proyección de intensidad máxima de 33 rebanadas para una profundidad de 23 μM. Barra de escala: 20 μM. (B) Ampliación del neuroepithelium. Barra de escala: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Figura 7: Aplicación de un análogo ATP en cámaras de huevos inmovilizadas durante imágenes en vivo. Imagen en vivo de dos ovarioles que expresan Baz::GFP inmovilizado en el mismo coverslip. El medio de cultivo se cambia a una concentración de 10 μM del analógico ATP 1-NAPP1 a 0 min. Las cámaras de huevos de control no reaccionan visiblemente al análogo ATP, mientras que las cámaras de huevos que llevan una mutación sensible analógica de aPKC(aPKCAS4)muestran una contracción del epitelio (puntas de flecha) que eventualmente conduce a la aparente descomposición de las uniones de adherentes. Proyección de intensidad máxima de 33 rebanadas para una profundidad de 27 μM. Escala bar: 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Figura 8: Medición de la señal cortical utilizando linescans giratorios. (A) Neuroblast D. melanogaster en vivo que expresa Baz::GFP (verde) y CD4::mIFP (rojo). Líneas de cian: líneas de escaneo inicial trazadas perpendicularmente a varias zonas corticales a medir. Barra de escala: 5 μM. (B) Identificación de la corteza (línea azul oscuro) utilizando linescans corticales y CD4::mIFP (rojo) como canal de referencia. Línea de cian: área definida por el parámetro "Medir alrededor" (aquí, 2 píxeles), donde la señal se mide después de la detección de la corteza. Barra de escala: 2 μm. (C) Cian: áreas corticales identificadas durante una división de neuroblasto por el método de linescans giratorios a partir de las líneas de escaneo iniciales mostradas en (A), utilizando CD4::mIFP (rojo) como canal de referencia. Barra de escala: 5 μM. Flecha: polo apical. Punta de flecha: polo basal. (D) Medición de la intensidad de la señal Baz::GFP a lo largo del tiempo en las dos zonas correspondientes identificadas por las líneas giratorias en las que se muestran (C). Durante la mitosis, Baz::GFP se enriquece transitoriamente en el polo apical del neuroblasto y se agota desde el polo basal opuesto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Vídeo 1: Aplicación del intercambio de medios en cerebros larvarios inmovilizados durante imágenes en vivo para añadir un inhibidor, presentado en la Figura 6,barra de escala: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 2: Aplicación del intercambio de medios en cámaras de huevos inmovilizadas durante imágenes en vivo para añadir un inhibidor, presentado en la Figura 7,barra de escala: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargar este video.</a>
Vídeo 3: Corrección de la deriva lateral y de enfoque mediante MultiHyperStackReg. Imágenes en vivo de un neuroblasto que expresa la sonda de membrana PH::GFP. Xy: plano focal único. Xz: reslice ortogonal. Izquierda: antes de la corrección de la deriva. Medio: después de la corrección de la deriva lateral. Derecha: después de la corrección de la deriva lateral y de enfoque, barra de escala: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 4: Detección de la corteza utilizando linescans giratorios, presentados en la Figura 8,escala de barra: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>
Tabla suplementaria 1: Genotipos de tejidos Drosophila en imágenes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla suplementaria 2: Origen de los transgéneos utilizados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Archivo de codificación suplementario 1: Origen de los transgéneos utilizados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 2: Origen de los transgéneos utilizados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 3: Origen de los transgéneos utilizados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo describe las aplicaciones de la inmovilización de muestras utilizando coágulos de Fibrin, limitando la deriva y permitiendo la adición y lavado de reactivos durante las imágenes en vivo. Las muestras se transfieren a una gota de Fibrinógeno que contiene medio de cultivo en la superficie de un deslizamiento de cubierta, después de lo cual la polimerización se induce añadiendo trombina.

Aplicaciones de inmovilización de tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina para imágenes vivas

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Este protocolo describe la inmovilización de muestras mediante coágulos de fibrina. Las muestras se transfieren a una gota de medio de cultivo que contiene fibrinógeno en la superficie de un cubreobjetos, después de lo cual se induce la polimerización mediante la adición de trombina. Bajo un microscopio de disección, use un cepillo para transferir las larvas L3 a un plato de vidrio de borosilicato de nueve pocillos que contiene PBS.Revuelva para separar la mayor parte del alimento para moscas de las larvas y transfiéralo a otro medio de cultivo que contenga un pozo. Use pinzas para agarrar una larva a través de todo su diámetro en la mitad de la longitud de su cuerpo y transfiérala a otro pocillo de la placa de borosilicato que contiene 200 microlitros de medio de cultivo fresco. No sueltes la larva.Para cortar la larva por la mitad en todo su diámetro, triture el área agarrada con el movimiento lateral de las puntas de las pinzas, o deslice una punta de otro par de pinzas entre las dos puntas de las pinzas que sujetan la larva. Use las pinzas para sujetar la larva por su cutícula y otro par de pinzas para despegar la cutícula sin tirar del cerebro. Repita esto hasta que los nervios que se originan en el cerebro sean visibles y se pueda acceder a los órganos que conectan el cerebro con las partes de la boca.Mientras sostiene los nervios que se originan en el cerebro con fórceps, corte la conexión entre el cerebro y las partes de la boca con el otro par de pinzas, separando el cerebro del resto de la cutícula. Sujete el cerebro por los axones que salen del cordón nervioso ventral y arranque los órganos circundantes tirando suavemente de ellos lejos del cerebro. A continuación, agarre la conexión entre los discos imaginales del ojo y el cerebro con el otro par de pinzas, y corte esta conexión sin tirar del cerebro.Asegúrese de que el cerebro esté debidamente limpio de otros tejidos y no se dañe. Deseche el cerebro si muestra signos de daño. Pipetear la solución de recubrimiento con un P20 hacia adentro y hacia afuera para recubrir la punta de la pipeta, luego aspirar el cerebro con la punta recubierta junto con tres microlitros de medio, y pipetear en otro pocillo que contenga 200 microlitros de medio de cultivo limpio.Repita este proceso hasta que se disecen suficientes cerebros, reemplazando ocasionalmente el medio de cultivo del pozo en el que se realizan las disecciones. Utilice una pipeta P20 con una punta recubierta para transferir los cerebros disecados a otro pocillo de la placa de borosilicato que contiene 200 microlitros de medio de cultivo y fibrinógeno. Aspire un cerebro junto con nueve microlitros de medio de cultivo y fibrinógeno.Con el extremo de la punta casi tocando el fondo del cubreobjetos de la placa de cultivo celular, pipetee el contenido de modo que el medio de cultivo toque el cubreobjetos inmediatamente después de salir de la punta de la pipeta. Use una punta de un par de pinzas, o un par de pinzas cerradas, para empujar y posicionar suavemente el cerebro dentro del medio de cultivo y la gota de fibrinógeno. Si es necesario obtener imágenes de la parte ventral del cerebro, inducir la coagulación del fibrinógeno para orientar adecuadamente el cerebro dentro del coágulo.Empuja el cerebro hacia un lado de la gota. Toque el borde de la gota en el lado opuesto del cerebro con la punta de la pipeta y agregue un microlitro de trombina. Espere uno o dos minutos para que el fibrinógeno comience a polimerizarse, lo que resulta en la formación de un precipitado turbio en un lado de la gota, luego empuje suavemente y meta el cerebro en el coágulo de fibrina, asegurándose de que el lado ventral esté lo más cerca posible del cubreobjetos sin deformar el cerebro.Pipetee un microlitro de solución de trombina cerca del lado del cerebro que no está metido en el coágulo de fibrina. Espere dos o tres minutos para que se asiente el segundo coágulo de fibrina, luego presione los bordes del coágulo para que se adhiera más fuertemente al cubreobjetos, teniendo cuidado de no deformar el cerebro. Si el cerebro parece estar demasiado lejos del cubreobjetos, acérquelo presionando el coágulo de fibrina más cerca del cerebro.Para inducir el coágulo de fibrina para obtener imágenes de la parte dorsal del cerebro, coloque el cerebro en el centro de la gota, con la parte dorsal hacia el cubreobjetos. Con una pipeta P2, toque el borde de la gota en el lado opuesto del cerebro con la punta de la pipeta y pipetee un microlitro de trombina. Espere de dos a tres minutos para que el fibrinógeno comience a polimerizarse, lo que resulta en la formación de un precipitado fibroso turbio, luego presione los bordes del coágulo para que se adhiera más fuertemente al cubreobjetos, teniendo cuidado de no deformar el cerebro.Con el extremo de la punta colocado a unos 0,5 centímetros por encima del coágulo, pipetee suavemente 390 microlitros de medio de cultivo sin fibrinógeno gota a gota sobre el coágulo. No agregue el medio de cultivo a los lados del coágulo, ya que puede desprenderlo del cubreobjetos. Para lavar el exceso de trombina, retire 300 microlitros del plato, luego agregue 300 microlitros de medio de cultivo limpio, asegurándose de que los coágulos permanezcan completamente sumergidos.Para evitar que los cambios de temperatura provoquen cambios de enfoque, mantenga la solución con los reactivos a la misma temperatura que la placa de cultivo. Retire la tapa de la placa de cultivo sin desplazar la placa en sí. Para facilitar la extracción, coloque la tapa del plato de 35 milímetros boca abajo encima del plato antes de tomar imágenes.Coloque la punta de la pipeta P1000 cerca de la superficie del medio dentro de la placa de cultivo y libere suavemente el volumen adecuado de solución de reactivo sobre ella, sin generar flujos fuertes que puedan desprender los coágulos. Para homogeneizar la solución dentro de la placa de cultivo, utilice una pipeta P200 para pipetear lentamente una pequeña cantidad de la solución hacia adentro y hacia afuera cinco veces. Vuelva a colocar la tapa sin desplazar la placa de cultivo y reanude la toma de imágenes.Cuando se añadió una NAPP1 a los cerebros de las larvas inmovilizadas con fibrina que expresaban Bazuca marcada con GFP, los cerebros portadores de una mutación sensible análoga de aPKC mostraron una contracción del epitelio neural, así como grupos brillantes de Baz en los neuroblastos y su progenie. El neuroblasto siguió dividiéndose a lo largo del lapso de tiempo, lo que indica que el tejido permaneció sano. Y los cerebros mostraron poca deriva a pesar del cambio en el medio de cultivo.De manera similar, la aplicación de una NAPP1 a los ovarios que expresan Bazooka marcada con GFP indujo la contracción de las células foliculares mutantes aPKC sensibles a análogos, pero no de los controles. Una hiperpila que mostraba tanto la deriva lateral como la enfocada se corrigió primero para la deriva lateral y luego la deriva de enfoque, lo que resultó en una reducción sustancial de los movimientos observados en la hiperpila original. Al intentar este protocolo, es importante meter el cerebro en el coágulo de fibrina parcialmente polimerizado mientras el coágulo aún es maleable pero lo suficientemente sólido como para sostener el cerebro de manera estable.Experimente con la manipulación de coágulos vacíos y pruebe suavemente el coágulo mientras se polimeriza para verificar qué tan resistente es.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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