Aplicaciones de inmovilización de tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina para imágenes vivas

Este protocolo describe la inmovilización de muestras mediante coágulos de fibrina. Las muestras se transfieren a una gota de medio de cultivo que contiene fibrinógeno en la superficie de un cubreobjetos, después de lo cual se induce la polimerización mediante la adición de trombina. Bajo un microscopio de disección, use un cepillo para transferir las larvas L3 a un plato de vidrio de borosilicato de nueve pocillos que contiene PBS.

Revuelva para separar la mayor parte del alimento para moscas de las larvas y transfiéralo a otro medio de cultivo que contenga un pozo. Use pinzas para agarrar una larva a través de todo su diámetro en la mitad de la longitud de su cuerpo y transfiérala a otro pocillo de la placa de borosilicato que contiene 200 microlitros de medio de cultivo fresco. No sueltes la larva.

Para cortar la larva por la mitad en todo su diámetro, triture el área agarrada con el movimiento lateral de las puntas de las pinzas, o deslice una punta de otro par de pinzas entre las dos puntas de las pinzas que sujetan la larva. Use las pinzas para sujetar la larva por su cutícula y otro par de pinzas para despegar la cutícula sin tirar del cerebro. Repita esto hasta que los nervios que se originan en el cerebro sean visibles y se pueda acceder a los órganos que conectan el cerebro con las partes de la boca.

Mientras sostiene los nervios que se originan en el cerebro con fórceps, corte la conexión entre el cerebro y las partes de la boca con el otro par de pinzas, separando el cerebro del resto de la cutícula. Sujete el cerebro por los axones que salen del cordón nervioso ventral y arranque los órganos circundantes tirando suavemente de ellos lejos del cerebro. A continuación, agarre la conexión entre los discos imaginales del ojo y el cerebro con el otro par de pinzas, y corte esta conexión sin tirar del cerebro.

Asegúrese de que el cerebro esté debidamente limpio de otros tejidos y no se dañe. Deseche el cerebro si muestra signos de daño. Pipetear la solución de recubrimiento con un P20 hacia adentro y hacia afuera para recubrir la punta de la pipeta, luego aspirar el cerebro con la punta recubierta junto con tres microlitros de medio, y pipetear en otro pocillo que contenga 200 microlitros de medio de cultivo limpio.

Repita este proceso hasta que se disecen suficientes cerebros, reemplazando ocasionalmente el medio de cultivo del pozo en el que se realizan las disecciones. Utilice una pipeta P20 con una punta recubierta para transferir los cerebros disecados a otro pocillo de la placa de borosilicato que contiene 200 microlitros de medio de cultivo y fibrinógeno. Aspire un cerebro junto con nueve microlitros de medio de cultivo y fibrinógeno.

Con el extremo de la punta casi tocando el fondo del cubreobjetos de la placa de cultivo celular, pipetee el contenido de modo que el medio de cultivo toque el cubreobjetos inmediatamente después de salir de la punta de la pipeta. Use una punta de un par de pinzas, o un par de pinzas cerradas, para empujar y posicionar suavemente el cerebro dentro del medio de cultivo y la gota de fibrinógeno. Si es necesario obtener imágenes de la parte ventral del cerebro, inducir la coagulación del fibrinógeno para orientar adecuadamente el cerebro dentro del coágulo.

Empuja el cerebro hacia un lado de la gota. Toque el borde de la gota en el lado opuesto del cerebro con la punta de la pipeta y agregue un microlitro de trombina. Espere uno o dos minutos para que el fibrinógeno comience a polimerizarse, lo que resulta en la formación de un precipitado turbio en un lado de la gota, luego empuje suavemente y meta el cerebro en el coágulo de fibrina, asegurándose de que el lado ventral esté lo más cerca posible del cubreobjetos sin deformar el cerebro.

Pipetee un microlitro de solución de trombina cerca del lado del cerebro que no está metido en el coágulo de fibrina. Espere dos o tres minutos para que se asiente el segundo coágulo de fibrina, luego presione los bordes del coágulo para que se adhiera más fuertemente al cubreobjetos, teniendo cuidado de no deformar el cerebro. Si el cerebro parece estar demasiado lejos del cubreobjetos, acérquelo presionando el coágulo de fibrina más cerca del cerebro.

Para inducir el coágulo de fibrina para obtener imágenes de la parte dorsal del cerebro, coloque el cerebro en el centro de la gota, con la parte dorsal hacia el cubreobjetos. Con una pipeta P2, toque el borde de la gota en el lado opuesto del cerebro con la punta de la pipeta y pipetee un microlitro de trombina. Espere de dos a tres minutos para que el fibrinógeno comience a polimerizarse, lo que resulta en la formación de un precipitado fibroso turbio, luego presione los bordes del coágulo para que se adhiera más fuertemente al cubreobjetos, teniendo cuidado de no deformar el cerebro.

Con el extremo de la punta colocado a unos 0,5 centímetros por encima del coágulo, pipetee suavemente 390 microlitros de medio de cultivo sin fibrinógeno gota a gota sobre el coágulo. No agregue el medio de cultivo a los lados del coágulo, ya que puede desprenderlo del cubreobjetos. Para lavar el exceso de trombina, retire 300 microlitros del plato, luego agregue 300 microlitros de medio de cultivo limpio, asegurándose de que los coágulos permanezcan completamente sumergidos.

Para evitar que los cambios de temperatura provoquen cambios de enfoque, mantenga la solución con los reactivos a la misma temperatura que la placa de cultivo. Retire la tapa de la placa de cultivo sin desplazar la placa en sí. Para facilitar la extracción, coloque la tapa del plato de 35 milímetros boca abajo encima del plato antes de tomar imágenes.

Coloque la punta de la pipeta P1000 cerca de la superficie del medio dentro de la placa de cultivo y libere suavemente el volumen adecuado de solución de reactivo sobre ella, sin generar flujos fuertes que puedan desprender los coágulos. Para homogeneizar la solución dentro de la placa de cultivo, utilice una pipeta P200 para pipetear lentamente una pequeña cantidad de la solución hacia adentro y hacia afuera cinco veces. Vuelva a colocar la tapa sin desplazar la placa de cultivo y reanude la toma de imágenes.

Cuando se añadió una NAPP1 a los cerebros de las larvas inmovilizadas con fibrina que expresaban Bazuca marcada con GFP, los cerebros portadores de una mutación sensible análoga de aPKC mostraron una contracción del epitelio neural, así como grupos brillantes de Baz en los neuroblastos y su progenie. El neuroblasto siguió dividiéndose a lo largo del lapso de tiempo, lo que indica que el tejido permaneció sano. Y los cerebros mostraron poca deriva a pesar del cambio en el medio de cultivo.

De manera similar, la aplicación de una NAPP1 a los ovarios que expresan Bazooka marcada con GFP indujo la contracción de las células foliculares mutantes aPKC sensibles a análogos, pero no de los controles. Una hiperpila que mostraba tanto la deriva lateral como la enfocada se corrigió primero para la deriva lateral y luego la deriva de enfoque, lo que resultó en una reducción sustancial de los movimientos observados en la hiperpila original. Al intentar este protocolo, es importante meter el cerebro en el coágulo de fibrina parcialmente polimerizado mientras el coágulo aún es maleable pero lo suficientemente sólido como para sostener el cerebro de manera estable.

Experimente con la manipulación de coágulos vacíos y pruebe suavemente el coágulo mientras se polimeriza para verificar qué tan resistente es.