Name: Hi-C en el núcleo en células de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Aprende el protocolo Hi-C en núcleo para mapear interacciones cromatínicas de alta resolución en células de Drosophila. Este método permite estudiar la organización del genoma y los límites de dominios topológicos.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención número IN207319 del Programa de Apoyo a la Innovación Tecnológica y la Investigación (PAPIIT) de la UNAM y la beca número 303068 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-FORDECyT). A.E.-L. es un estudiante de maestría apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) CVU número 968128.

1. Fijación
<ol><li>Comience con 10 millones de células de la línea 2 plus (S2R+) de Schneider para preparar 17,5 ml de suspensión celular en medio Schneider que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Añadir formaldehído libre de metanol para obtener una concentración final del 2%. Mezclar e incubar durante 10 min en RT, teniendo cuidado de mezclar cada minuto. NOTA: El formaldehído es un producto químico peligroso. Siga las normas de salud y seguridad apropiadas, y trabaje en la campana de humos.</li>
	<li>Apaga la reacción añadiendo glicina para conseguir una concentración final de 0,125 M y mezclar. Incubar durante 5 min en RT, seguido de 15 min en hielo.</li>
	<li>Centrifugadora durante 400 × g a RT durante 5 min y luego durante 10 min a 4 °C; deseche el sobrenadante. Resuspenda el pellet cuidadosamente en 25 ml de solución salina fría tamponada con fosfato 1x.</li>
	<li>Centrifugar a 400 × g durante 10 min a 4 °C, luego desechar el sobrenadante. NOTA: Si continúa con el protocolo, vaya al paso 2.1 para la lisis; de lo contrario, congele el pellet en líquido N2 y guárdelo a -80 °C.</li>
</ol>2. Lisis
<ol><li>Resuspend las células en 1 mL de tampón de lisis helado-frío (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% de surfactante no iónico (ver la Tabla de Materiales);10 mM NaCl; 1x inhibidores de la proteasa), y ajustar el volumen a 10 mL con tampón de lisis helado. Ajustar el volumen para obtener una concentración de 1 × 106 células/ml. Incubar en hielo durante 30 min, mezclando cada 2 min invirtiendo los tubos.</li>
	<li>Centrifugar los núcleos a 300 × g durante 5 min a 4 °C, y luego desechar cuidadosamente el sobrenadante. Lave el pellet 1x con 1 ml de tampón de lisis en frío y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga. Lave el pellet 1x con 1 mL de tampón de restricción frío de 1.25x, y vuelva a gastar cada pellet de célula en 360 μL de tampón de restricción de 1.25x.</li>
	<li>Añadir 11 μL de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% por tubo (concentración final del 0,3%), mezclar cuidadosamente mediante pipeteo e incubar a 37 °C durante 45 min, agitando a 700-950 rpm. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para interrumpir los grumos varias veces durante la incubación.</li>
	<li>Snchs el SDS añadiendo 75 μL de surfactante no iónico (solución al 10%, véase la Tabla de Materiales)por tubo (concentración final del 1,6%) e incubar a 37 °C durante 45 min, agitando a 950 rpm. Pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para interrumpir los grupos durante la incubación. NOTA: Si los grupos son grandes y difíciles de interrumpir, disminuya la velocidad de rotación a 400 rpm durante los tratamientos con SDS y surfactante. Si los grupos son difíciles de desagregar mediante pipeteo, divida la muestra en dos; ajustar los volúmenes de tampón de restricción, SDS y surfactante; y proceder a la permeabilización. A continuación, gire los núcleos a una velocidad mínima (200 × g),deseche cuidadosamente el sobrenadante, aglutina las muestras en un tampón de restricción 1X y proceda con la digestión. Tome una alícuota de 10 μL como muestra no digerída (UD).</li>
</ol>3. Digestión enzimática
<ol><li>Digiera la cromatina añadiendo 200 unidades (U) de Mbo I por tubo, e incube a 37 °C durante un período que va desde 4 h hasta durante la noche mientras gira (950 rpm).</li>
	<li>Al día siguiente, agregue 50 U adicionales de Mbo I por tubo e incube a 37 ° C durante 2 h mientras gira (950 rpm).</li>
	<li>Inactivar la enzima incubando los tubos a 60 °C durante 20 min. Coloque los tubos sobre hielo. NOTA: Tome una alícuota de 10 μL como muestra digerida (D).</li>
</ol>4. Biotinilación de los extremos del ADN
<ol><li>Para rellenar los voladizos de fragmentos de restricción y etiquetar los extremos de ADN con biotina, agregue 1.5 μL cada uno de 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL de 0.4 mM de biotina dATP, 17.5 μL de tampón Tris low-EDTA (TLE) [10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0] y 10 μL de 5 U / μL de Klenow (fragmento grande de ADN polimerasa I) a todos los tubos. Mezclar cuidadosamente e incubar durante 75 min a 37 °C. Agitar a 700 rpm cada 10 s durante 30 s. Coloque todos los tubos sobre hielo mientras prepara la mezcla de ligadura.</li>
</ol>5. Ligadura
<ol><li>Transfiera cada mezcla de cromatina digerida a un tubo separado de 1 ml con mezcla de ligadura (100 μL de tampón de ligadura 10x, 10 μL de albúmina sérica bovina de 10 mg/ml, 15 U de ligasa de ADN T4 y 425 μL de agua de doble destilación [ddH2O]). Mezclar bien mediante pipeteo suave e incubar durante la noche a 16 °C.</li>
</ol>6. Reversión de reticulación y purificación de ADN
<ol><li>Degradar las proteínas añadiendo 50 μL de 10 mg/ml de proteinasa K por tubo, e incubar a 37 °C durante 2 h. Reticula los enlaces cruzados aumentando la temperatura a 65 °C e incuba durante la noche.</li>
	<li>Degradar el ARN añadiendo 20 μL de 10 mg/ml de RNasa A, e incubar a 37 °C durante 1 h.</li>
	<li>Realizar extracción de fenol:cloroformo seguida de precipitación de etanol.<ol>
<li>Añadir 1 volumen de fenol-cloroformo, y mezclar bien por inversión para obtener una fase blanca homogénea. NOTA: El fenol es un químico peligroso. Siga las normas de salud y seguridad apropiadas. Trabajar en la campana de humos.</li>
		<li>Centrifugadora a 15.000 × g durante 15 min. Transfiera la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga fresco de 2 ml. Realice una extracción posterior de la capa inferior con 100 μL de tampón TLE y transfiera la fase acuosa al mismo tubo de 2 ml.</li>
		<li>Precipitar el ADN añadiendo 2 volúmenes de alcohol etílico al 100% (EtOH), 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2 μL de glucógeno de 20 mg/ml. Incubar a -20 °C durante un período que va desde 2 h hasta la noche.</li>
		<li>Girar a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C, y lavar los pellets 2x con 70% etOH helado. Seque los gránulos en RT y vuelva a sususpend en 100 μL de tampón TLE. Cuantificar el ADN utilizando un colorante fluorogénico que se une selectivamente al ADN y un fluorómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales). NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Almacene los productos de ligadura a 4 °C a corto plazo o a -20 °C a largo plazo. Utilice una alícuota (100 ng) del material como muestra ligada (L) para el control de calidad.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Evalúe la calidad de la plantilla Hi-C
<ol><li>Controles cualitativos de digestión y ligadura<ol>
<li>Purificar el ADN de las alícuotas UD y D invirtiendo los enlaces cruzados, y realizar la extracción de fenol:cloroformo y precipitación de etanol como se describió anteriormente.</li>
		<li>Cargue 100 ng de muestras de UD, D y L en un gel de agarosa al 1,5%. Busque un frotis centrado alrededor de 500 pb en la muestra D frente a una banda de alto peso molecular para la muestra L (ver resultados representativos).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Control cuantitativo de la eficiencia de la digestión NOTA: Para evaluar la eficiencia de la digestión con mayor precisión, utilice las muestras UD y D como plantillas para realizar reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) utilizando cebadores diseñados de la siguiente manera.<ol>
<li>Diseñe un par de cebadores que amplifiquen un fragmento de ADN que contenga el sitio de restricción de ADN para la enzima utilizada para la digestión (Mbo I en el presente protocolo), llamado R en la fórmula del paso 7.2.3.</li>
		<li>Diseñe un par de cebadores que amplifiquen un fragmento de ADN de control que no contenga el sitio de restricción para la enzima utilizada para la digestión (Mbo I para el presente protocolo), llamado C en la fórmula del paso 7.2.3.</li>
		<li>Utilice los valores umbral de ciclo (valores ct) de la amplificación para calcular la eficiencia de restricción de acuerdo con la fórmula que se muestra a continuación: % restricción = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD} Donde CtR se refiere al valor Ct del fragmento R, y CtC se refiere al valor Ct del fragmento C para la muestra D y la muestra UD. NOTA: El porcentaje de restricción refleja la eficiencia de la enzima de restricción que escinde el fragmento de ADN restringido (R) en comparación con un fragmento de ADN de control (C) que no contiene el sitio de ADN de restricción. Se recomienda una eficiencia de restricción de ≥ 80%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detección de interacciones conocidas<ol>
<li>Realizar PCR para amplificar un control de ligadura interna para examinar interacciones de corto y/o medio o largo alcance (ver resultados representativos).</li>
		<li>Alternativamente, diseñe cebadores para amplificar un producto de ligadura en el que los cebadores estén en orientación hacia adelante-adelante o hacia atrás-hacia atrás en fragmentos de restricción adyacentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Control de relleno y etiquetado de biotina<ol>
<li>Verificar el marcado Hi-C y la eficiencia de la ligadura mediante la amplificación y digestión de una interacción conocida o un producto de ligadura entre fragmentos de restricción adyacentes en el genoma, como se describió anteriormente. NOTA: El relleno y la ligadura exitosos del sitio Mbo I (GATC) generan un nuevo sitio para la enzima de restricción Cla I (ATCGAT) en la unión de ligadura y regeneran el sitio Mbo I.</li>
		<li>Digiera el producto de PCR con Mbo I, Cla I o ambos. Después de ejecutar las muestras en un gel al 1,5-2%, estimar el número relativo de uniones de ligadura 3C y Hi-C cuantificando la intensidad de las bandas cortadas y sin cortar26. NOTA: Se desea una eficiencia de > 70% (ver resultados representativos).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Sonicación
<ol><li>Sonicar las muestras para obtener fragmentos de ADN de 200-500 pb. Para el instrumento utilizado en este protocolo (véase la Tabla de materiales),diluya la muestra (de 5 a 10 μg) en 130 μL de ddH2O por tubo, y ajuste el instrumento a sonicar a 400 pb: nivel de llenado: 10; factor de derecho: 10%; potencia máxima incidente (w): 140; ciclos por ráfaga: 200; tiempo(s): 80.</li>
</ol>9. Eliminación de biotina / reparación final
NOTA: Los pasos que se muestran a continuación se ajustan para 5 μg de ADN Hi-C.
<ol><li>Para realizar la eliminación de biotina, transfiera la muestra (130 μL) a un tubo de microcentrífuga fresco. Añadir 16 μL de tampón de ligadura 10x, 2 μL de dATP de 10 mM, 5 μL de ADN polimerasa T4 (15U) y 7 μL de ddH2O (160 μL de volumen total). Incubar a 20 °C durante 30 min.</li>
	<li>Añadir 5 μL de 10 mM dNTP, 4 μL de tampón de ligadura 10x, 5 μL de polinucleótido quinasa T4 (10 U/μL), 1 μL de Klenow y 25 μL de ddH2O (200 μL de volumen total). Incubar a 20 °C durante 30 min.</li>
</ol>10. Selección de tamaño
<ol><li>Para seleccionar fragmentos principalmente en el rango de tamaño de 250-550 pb, realice primero la selección secuencial de tamaño de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) con 0.6x, seguida de 0.90x de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y eluye el ADN usando 100 μL de TLE.</li>
</ol>11. Ligadura de biotina pulldown/A-tailing/adapter
NOTA: Realice los lavados resuspensando las perlas magnéticas mediante vórtice, gire las muestras durante 3 minutos en una rueda giratoria y luego gire brevemente hacia abajo la muestra y colóquela en el soporte magnético. Deje que las cuentas se peguen al imán, deseche el sobrenadante y continúe con el siguiente paso de lavado. Realice los lavados a 55 °C en un termobloque con rotación en lugar de la rueda giratoria.
<ol><li>Ensanar el volumen final a 300 μL por muestra con TLE para pull-down. Prepare los tampones de lavado de cuentas: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% Tween), 0.5x TB, 1x No-Tween buffer (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.</li>
	<li>Utilice 150 μL de perlas magnéticas ligadas a la estreptavidina (consulte la Tabla de materiales)por biblioteca. Lavar las perlas 2x con 400 μL de 1x TB. Luego resuspenda las perlas en 300 μL 2x NTB.</li>
	<li>Mezcle las perlas con el material Hi-C de 300 μL e incube en RT durante 30 minutos en una rueda giratoria para permitir que la biotina se una a las perlas de estreptavidina.</li>
	<li>Lavar las perlas con 400 μL de 0,5x TB, e incubar a 55 °C durante 3 min, girando a 750 rpm. Lave las perlas en 200 μL de tampón de restricción 1x.</li>
	<li>Resuspend las perlas en 100 μL de mezcla de relaves dATP (5 μL de 10 mM dATP, 10 μL de tampón de restricción 10x, 5 μL de klenow exo-, y 80 μL de ddH2O). Incubar a 37 °C durante 30 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante, lave las perlas 2x con 400 μL de 0,5x TB incubando a 55 °C durante 3 min y girando a 750 rpm.</li>
	<li>Lavar las perlas con 400 μL de 1x NTB y luego con 100 μL de 1x tampón de ligadura.</li>
	<li>Resuspend las perlas en 50 μL de tampón de ligadura 1x, y transfiera la suspensión a un nuevo tubo. Añadir 4 μL de adaptadores de PE precocidos (15 μM de stock) y 2 μL de ligasa T4 (400 U/μL, es decir, 800 U/tubo); incubar en RT durante 2 h. NOTA: Pre-anneal los adaptadores añadiendo volúmenes iguales de adaptadores PE 1.0 y PE 2.0 (stock de 30 μM) e incubando durante 10 min en RT (ver la Tabla de Materiales).</li>
	<li>Vuelva a capturar las perlas quitando el sobrenadante y lavando las perlas 2x con 400 μL de TB. Lave las perlas con 200 μL de 1x NTB, luego con 100 μL de tampón de restricción 1x, y resuspenda las perlas en 40 μL de 1x buffer de restricción.</li>
</ol>12. Amplificación por PCR
<ol><li>Configure PCR de 25 μL de volumen con 5, 6, 7 y 8 ciclos. Para cada PCR, utilice:<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Receta de reacción</td>
			</tr>
<tr>
<td>Cuentas Hi-C</td>
				<td>2,5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Imprimación PCR PE 10 μM 1 (Tabla de materiales)</td>
				<td>0,75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Imprimación PCR PE 10 μM 2 (Tabla de materiales)</td>
				<td>0,75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 mM dNTP</td>
				<td>0,6 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Búfer de reacción 5x</td>
				<td>5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>ADN polimerasa</td>
				<td>0,3 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
				<td>14,65 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Total</td>
				<td>25 μL</td>
			</tr>
</tbody></table>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ciclos</td>
				<td>Temperatura</td>
				<td>Hora</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td rowspan="3">n ciclos</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>10 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>65 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>72 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>72 °C</td>
				<td>7 minutos</td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
</ol>13. Amplificación final por PCR
<ol><li>Realizar la amplificación final por PCR utilizando las mismas condiciones descritas anteriormente y el número de ciclos seleccionados. Divida la muestra usando 5 μL de perlas Hi-C como plantilla en reacciones de 50 μL.</li>
	<li>Recoja todas las reacciones de PCR y transfiéralas a un tubo nuevo. Use el imán para eliminar las perlas de estreptavidina y recuperar el sobrenadante (productos de PCR). Transfiera las perlas a un tubo nuevo, lave las perlas como se indica en el paso 11.2.9 y guárdelas en un búfer de restricción 1x a 4 °C como respaldo.</li>
	<li>Purifique los productos de PCR utilizando 0,85 veces el volumen de las perlas SPRI de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Elute con 30 μL de tampón TLE.</li>
	<li>Cuantificar la biblioteca Hi-C utilizando un instrumento fluorométrico y confirmar la calidad de la biblioteca mediante electroforesis capilar basada en chip.</li>
	<li>Como último punto de control de calidad, utilice 1 μL de la biblioteca Hi-C como plantilla para realizar una reacción de PCR utilizando 10 ciclos utilizando las mismas condiciones descritas en el paso 12.1. Divida el producto de PCR en dos tubos de microcentrífuga: digiera uno con Cla I y deje el otro sin digerir como control. Ejecute los productos en un gel de agarosa al 1.5-2% (ver resultados representativos).</li>
	<li>Proceda a la secuenciación de extremo pareado de 50 pb o 75 pb en una plataforma de secuenciación adecuada.</li>
</ol>

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<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
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<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189(2018).</li>
<li>Ulianov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+chromatin+and+transcription+play+a+key+role+in+chromosome+partitioning+into+topologically+associating+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains.</a> Genome Research. 26, 70-84 (2016).</li>
<li>Rowley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+conserved+principles+predict+3D+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization.</a> Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).</li>
<li>Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actual+ligation+frequencies+in+the+chromosome+conformation+capture+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure.</a> PLoS One. 8, 60403(2013).</li>
<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosure+of+a+structural+milieu+for+the+proximity+ligation+reveals+the+elusive+nature+of+an+active+chromatin+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub.</a> Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li>
<li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Hi-C+results+using+in-solution+versus+in-nucleus+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation.</a> Genome Biology. 16, 175(2015).</li>
<li>Arzate-Mejía, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+dissection+of+domain+boundaries+affect+genome+topology+and+gene+transcription+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila.</a> Nature Communications. 11, 894(2020).</li>
<li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+capture+Hi-C%3A+high-resolution%2C+genome-wide+profiling+of+promoter+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).</li>
<li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiC-Pro%3A+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing.</a> Genome Biology. 16, 259(2015).</li>
<li>Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiQC%3A+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 10, 1093(2016).</li>
<li>Wingett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCUP%3A+pipeline+for+mapping+and+processing+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Research%22%5BJournal%5D)">HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data.</a> F1000 Research. 4, 1310(2015).</li>
<li>Imakaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+correction+of+Hi-C+data+reveals+hallmarks+of+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization.</a> Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).</li>
<li>Akdemir, K. C., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCPlotter+integrates+genomic+data+with+interaction+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biolog%22%5BJournal%5D)">HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices.</a> Genome Biolog. 16, 198(2015).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189(2018).</li>
<li>Ando-Kuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+and+promoter-centric+3D+genome+organization+temporally+resolved+during+a+circadian+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Cuellar-Partida, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+priors+for+identifying+active+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites.</a> Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137(2008).</li>
<li>Ong, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 155 (1), 148-159 (2013).</li>
<li>Fresán, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li>
<li>Quinodoz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+promotes+the+formation+of+spatial+compartments+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus.</a> Cell. 174, 744-757 (2018).</li>
<li>Olivares-Chauvet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pairwise+and+multi-way+chromosomal+conformations+using+chromosomal+walks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks.</a> Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).</li>
<li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li>
<li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li>
<li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-BERST%3A+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

El método Hi-C en núcleo que aquí se presenta ha permitido una exploración detallada de la topología del genoma de Drosophila a alta resolución, proporcionando una visión de las interacciones genómicas a diferentes escalas genómicas, desde bucles de cromatina entre elementos reguladores como promotores y potenciadores hasta TADs e identificación de grandes compartimentos25. La misma tecnología también se ha aplicado eficientemente a los tejidos de mamíferos con algunas modificaciones<sup class="xr...

En los eucariotas, el genoma se divide en cromosomas que ocupan territorios específicos en el espacio nuclear durante la interfase1. La cromatina que forma los cromosomas se puede dividir en dos estados principales: uno de cromatina accesible que es transcripcionalmente permisiva, y el otro de cromatina compacta que es transcripcionalmente represiva. Estos estados de cromatina segregan y rara vez se mezclan en el espacio nuclear, formando dos compartimentos distintos en el núcleo2. En la escala sub-megabase, los límites separan los dominios de las interacciones de cromatina de alta frecuencia, llamadas TADs, que marcan la organización cromosómica3,4,5. En los mamíferos, los límites tad están ocupados por la cohesina y el factor de unión a CCCTC (CTCF)6,7,8. El complejo de cohesina extruye la cromatina y se detiene en los sitios de unión a CTCF que se disponen en una orientación convergente en la secuencia genómica para formar bucles de cromatina estables9,10,13,14. La alteración genética del sitio de unión al ADN de CTCF en los límites o la reducción de la abundancia de CTCF y proteína de cohesina da como resultado interacciones anormales entre los elementos reguladores, la pérdida de la formación de TAD y la desregulación de la expresión génica9,10,11,13,14.
En Drosophila, los límites entre los TADs están ocupados por varios AP, incluyendo el factor asociado al elemento límite 32 kDa (BEAF-32), la proteína de unión al Motivo 1 (M1BP), la proteína centrosómica 190 (CP190), el supresor del ala peluda (SuHW) y el CTCF, y están enriquecidos en modificaciones activas de histonas y polimerasa II16,17,18. Se ha sugerido que en Drosophila, los TADs aparecen como consecuencia de la transcripción13, 17,19,y el papel exacto de los AP independientes en la formación de límites y las propiedades de aislamiento aún está bajo investigación. Por lo tanto, queda por caracterizar completamente si los dominios en Drosophila son una consecuencia exclusiva de la agregación de regiones de estados transcripcionales similares o si los AP, incluido el CTCF, contribuyen a la formación de límites. La exploración de contactos genómicos a alta resolución ha sido posible a través del desarrollo de tecnologías de captura de conformación cromosómica junto con la secuenciación de próxima generación. El protocolo Hi-C se describió por primera vez con la etapa de ligadura realizada "en solución"2 en un intento de evitar productos de ligadura espurios entre fragmentos de cromatina. Sin embargo, varios estudios apuntaron a la comprensión de que la señal útil en los datos provenía de productos de ligadura formados en núcleos parcialmente lisados que no estaban en la solución20,21.
El protocolo se modificó para realizar la ligadura dentro del núcleo como parte del experimento Hi-C unicelular22. El protocolo Hi-C en el núcleo se incorporó posteriormente a la población celular Hi-C para producir una cobertura más consistente en todo el rango de distancias genómicas y producir datos con menos ruido técnico23,24. El protocolo, descrito en detalle aquí, se basa en el protocolo Hi-C de la población en el núcleo23,24 y se utilizó para investigar las consecuencias de eliminar genéticamente los motivos de unión al ADN para CTCF y M1BP de un límite de dominio en el locus del gen Notch en Drosophila25. Los resultados muestran que la alteración de los motivos de unión al ADN para los AP en el límite tiene consecuencias drásticas para la formación del dominio Notch, defectos topológicos más grandes en las regiones que rodean el locus Notch y la desregulación de la expresión génica. Esto indica que los elementos genéticos en los límites del dominio son importantes para el mantenimiento de la topología del genoma y la expresión génica en Drosophila25.

<table><tbody><tr><td>Solución de paraformaldehído al 16% (vol/vol)</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-14-dATP</td><td>Invitrogen</td><td>CA1524-016</td><td></td></tr><tr><td>Enzima ClaI</td><td>NEB</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>COVARIS Ultrasonicador Covaris</td><td></td><td>LE220-M220</td><td></td></tr><tr><td>Cut Smart</td><td>NEB</td><td>B72002S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptabidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS) estéril filtrado</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Dna PolI fragmento grande</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow exo(-)</td><td>NEB</td><td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de ligadura</td><td>NEB</td><td>B020S</td><td></td></tr><tr><td>Enzima MboI</td><td>NEB</td><td>R0147M</td><td></td></tr><tr><td>NP40-Igepal</td><td>SIGMA</td><td>CA-420</td><td>Tensioactivo no iónico para adición en tampón de lisis</td></tr><tr><td>Adaptador de PE 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>adaptador 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-ACACTCTCTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>PCR cebador 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>cebador de PCR 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATCTCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'Fenol</td><td></td></tr><tr><td>: Cloroformo:Alcohol isoamílico 25:24:1</td><td>SIGMA</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Cebador 1 (interacción conocida, Figura 2A)</td><td>Sigma</td><td>5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer</td><td></td></tr> <tr><td>2 (interacciones conocidas, Figura 2A)</td><td>Sigma</td><td>5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'Tableta de cóctel de</td> inhibidores de <td></td></tr><tr><td>proteasa</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>SPRI Beads</td><td>Beckman</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polimerasa</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleótido quinasa (PNK)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>TaqPhusion</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>ADN polimerasa</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Surfactante no iónico para el enfriamiento de SDS</td></tr></tbody></table>

hi-c en el núcleo en células de drosophila

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

El genoma está organizado en dominios topológicamente asociativos (TADs) delimitados por límites que aíslan las interacciones entre dominios. En Drosophila, los mecanismos subyacentes a la formación y los límites de TAD aún están bajo investigación. La aplicación del método Hi-C en el núcleo descrito aquí ayudó a diseccionar la función de los sitios de unión a proteínas arquitectónicas (AP) en los límites de TAD aislando el gen Notch. La modificación genética de los límites del dominio que causan la pérdida de AP da como resultado la fusión de TAD, defectos transcripcionales y alteraciones topológicas de largo alcance. Estos resultados proporcionaron evidencia que demuestra la contribución de los elementos genéticos a la formación de límites de dominio y al control de la expresión génica en Drosophila. Aquí, se ha descrito en detalle el método Hi-C en el núcleo, que proporciona puntos de control importantes para evaluar la calidad del experimento junto con el protocolo. También se muestran los números requeridos de lecturas de secuenciación y pares Hi-C válidos para analizar las interacciones genómicas a diferentes escalas genómicas. La edición genética mediada por CRISPR/Cas9 de elementos reguladores y el perfil de alta resolución de las interacciones genómicas utilizando este protocolo Hi-C en el núcleo podrían ser una combinación poderosa para la investigación de la función estructural de los elementos genéticos.

A continuación se describen los resultados de un protocolo Hi-C exitoso (consulte un resumen del flujo de trabajo del protocolo Hi-C en la Figura 1A). Hay varios puntos de control de calidad durante el experimento Hi-C en el núcleo. Las alícuotas de muestra se recogieron antes (UD) y después (D) del paso de restricción de cromatina, así como después de la ligadura (L). Los enlaces cruzados se invirtieron, y el ADN se purificó y se ejecutó en un gel de agarosa. Se observó un frotis de 200-100...

El genoma está organizado en el espacio nuclear en diferentes estructuras que pueden revelarse a través de tecnologías de captura de conformación cromosómica. El método Hi-C en el núcleo proporciona una colección de interacciones de cromatina en líneas celulares de Drosophila en todo el genoma, que genera mapas de contacto que se pueden explorar a resolución de megabase a nivel de fragmento de restricción.

Hi-C en el núcleo en células de Drosophila

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Los protocolos Hi-C del núcleo permiten la exploración de la confirmación cromosómica a diferente resolución para la caracterización de bucles de cromatina, dominios y compartimentos que organizan el genoma. Este protocolo proporciona perfiles de alta resolución de interacciones genómicas a diferentes escalas, lo que produce una cobertura más consistente en toda la gama de distancias genómicas y datos con menos ruido técnico. La combinación de este protocolo con la edición genética es una estrategia poderosa para probar la función estructural de los elementos genéticos.También se puede aplicar a la caracterización de variaciones estructurales que conducen a la enfermedad. El protocolo Hi-C del núcleo se puede aplicar para explorar la organización del genoma de cualquier genoma eucariota. Hacer el tratamiento SDS y Triton desagrega cualquier grupo nuclear por pipeteo, ya que los agregados interfieren con la eficiencia de la reacción enzimática, y asegúrese de realizar la medición de control de calidad adecuada antes de la secuenciación.Comience agregando formaldehído sin metanol a una vez 10 a las siete células Drosophila De la Línea 2 Plus de Schneider en 17.5 mililitros de medio S

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Investigación

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Genetics

Genética

Este protocolo muestra cómo realizar técnicas de inmunohistoquímica sobre disecados larvas de Drosophila.

Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica

En este trabajo se demuestra el uso de un microscopio confocal de barrido rápido de comportamiento de las células de imagen directamente a través de la pupa. Al dejar el caso de pupa intacta, este método permite la observación y medición de los procesos dinámicos de célula en una etapa de desarrollo de Drosophila que es difícil de estudiar directamente.

Imaging A través de la envoltura pupal de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Tejidos de Drosophila a menudo contienen una mezcla heterogénea de tipos celulares. Para examinar la expresión génica en tipos de células específicas de un tejido particular, los núcleos pueden ser etiquetados genéticamente y aislados posteriormente utilizando un enfoque basado en la afinidad. Núcleos aislados se pueden utilizar para aplicaciones posteriores tales como análisis de la expresión génica y la inmunoprecipitación de la cromatina.

Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos para análisis de expresión génica

El RNA se describe en situ hibridación protocolo permite la detección de RNA en todo Drosophila embriones o tejidos disecados. Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos y amplificación de la señal tyramide, transcripciones pueden ser detectadas en el rendimiento, sensibilidad y alta resolución y a un costo relativamente bajo.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

La poliploidización inducida por heridas es una estrategia de reparación de tejido conservada donde las células crecen en tamaño en lugar de dividirse para compensar la pérdida celular. Aquí hay un protocolo detallado sobre cómo utilizar la mosca de la fruta como modelo para medir la ploidy y su regulación genética en la reparación epitelial de heridas.

Un modelo de Drosophila para estudiar la poliploidización inducida por heridas

El objetivo de este protocolo es inyectar actina globular conjugada con rhodamina en embriones de Drosophila y el conjunto de barras de actina intranuclear de imagen después del estrés térmico.

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El análisis del ciclo celular con etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) y fosfo-histona H3 (pH3) es un procedimiento de varios pasos que puede requerir una optimización extensa. Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe todos los pasos para este procedimiento, incluido el análisis de imágenes y la cuantificación para distinguir las células en diferentes fases del ciclo celular.

Protocolo de doble marcado de 5-etinil-2'-desoxiuridina/fosfo-histona H3 para el análisis de progresión del ciclo celular en células madre neurales de Drosophila

En Drosophila,el núcleo de ovocitos sufre una migración dependiente de microtúbulos durante la oogénesis. Aquí, describimos un protocolo que se desarrolló para seguir la migración mediante la realización de imágenes en vivo en cámaras de óvulos ex-vivo. Nuestro procedimiento mantiene vivas las cámaras de huevos durante 12 h para adquirir películas de lapso de tiempo 3D multi posición utilizando microscopía confocal de disco giratorio.

Migración nuclear en el ovocito Drosophila

Este protocolo describe los pasos necesarios para realizar la hibridación de hibridación fluorescente fluorescente in situ (HCR-FISH) en los lóbulos ópticos larvales de Drosophila melanogaster . Se detallan procedimientos para el diseño de la sonda, hibridación, amplificación y montaje de tejidos para facilitar la visualización del lóbulo óptico en desarrollo.

Reacción en cadena de hibridación FISH en el lóbulo óptico en desarrollo de Drosophila

Aprende el protocolo Hi-C en núcleo para mapear interacciones cromatínicas de alta resolución en células de Drosophila. Este método permite estudiar la organización del genoma y los límites de dominios topológicos.

Hi-C en el núcleo en células de Drosophila

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