Name: Explante de tejido corneal porcino para estudiar la eficacia de los antivirales del virus del herpes simple-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprende a utilizar explantes de córnea porcina ex vivo para evaluar la eficacia de fármacos antivirales contra el virus del herpes simple-1. Este modelo reduce costos y personal científico requerido.

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Este estudio fue apoyado por subvenciones de los NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 y RO1 EY029426) a D.S. A.A. fue apoyado por una subvención F30EY025981 del Instituto Nacional del Ojo, NIH. El estudio se realizó utilizando las córneas porcinas obtenidas de Park Packing company, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Todo el tejido porcino utilizado en este estudio fue proporcionado por una organización privada de terceros y ninguno de los manejos de animales fue realizado por personal de la Universidad de Illinois en Chicago.
1. Materiales
<ol><li>
Reactivos
	<ol>
<li>Use los siguientes reactivos para el ensayo de placa: metilcelulosa en polvo, medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino (FBS), penicilina y estreptomicina (P / S) para el ensayo de placa.</li>
		<li>Use tabletas de violeta cristalina y etanol (grado de biología molecular) para preparar la solución de violeta cristalina para el ensayo de placa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medios de crecimiento de células Vero - DMEM whole media
	<ol>
<li>Abra el frasco de medios DMEM dentro de la campana de cultivo de tejidos. Retire 55 ml de medios de la botella con una pipeta serológica y deséchelo. Agregue 50 ml de FBS de P / S a DMEM. Refrigerar a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medios de ensayo de placa - Stock de medios de metilcelulosa al 5%
	<ol>
<li>Mida 2,5 g de polvo de metilcelulosa con un imán de agitación dentro de una botella de vidrio de 500 ml y autoclave. Después de que la botella se enfríe a temperatura ambiente, tome 500 ml de medios enteros DMEM que contengan 50 ml de FBS y 5 ml de P / S y agréguelo a la botella de vidrio que contiene metilcelulosa.</li>
		<li>Revuelva esto a 4 ° C durante 2 días con un agitador magnético. Refrigerar a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de medios para la córnea porcina extirpada
	<ol>
<li>Abra un frasco de medios esenciales mínimos (MEM) dentro de la campana de cultivo de tejidos. Deseche 10 ml de MEM de la botella con una pipeta serológica.</li>
		<li>Añadir 5 ml de insulina-transferrina-selenio (ITS) y 5 ml de antimicótico-antibiótico (AA) al medio y refrigerar a 4°C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maestro y stock de trabajo de cristal violeta:
	<ol>
<li>Para hacer la solución de stock de violeta cristalina, agregue 1 g de polvo de violeta de cristal a 100 ml de etanol al 20% en agua. Este stock (1% p/v de cristal violeta) se puede almacenar y utilizar hasta un año cuando se almacena en un lugar oscuro.</li>
		<li>Para hacer un stock de trabajo a partir de esto, agregue 50 ml de solución de stock original a 350 ml de agua. Agregue 100 ml de etanol a esta solución para hacer una solución violeta de cristal de trabajo de 500 ml (0.1% p / v de cristal violeta). NOTA: Ambas soluciones deben almacenarse en la oscuridad.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Procedimiento
<ol><li>Aislamiento de córneas porcinas de ojos enteros17
	<ol>
<li>Al recibir los ojos porcinos de un vendedor adecuado, almacene en hielo si hay un retraso con el procesamiento de tejidos como se muestra en la Figura 1.</li>
		<li>Asegúrese de que el equipo de protección personal se use y use durante este procedimiento para evitar la contaminación, así como los accidentes por derrame de humor vítreo.</li>
		<li>Rocíe el área de trabajo con etanol al 70% para limpiar y desinfectar. Para asegurarse de que el espacio de trabajo sea estable, extienda una cubierta de banco y pegue con cinta adhesiva los lados de forma segura como se muestra en la Figura 2.</li>
		<li>Coloque los ojos porcinos en la gasa (Figura 3). Usando una gasa de 50 mm, sostenga la sección posterior(Figura 4A)de los ojos porcinos como se muestra en la Figura 4B con una mano.</li>
		<li>Con una aguja de 30 G, haga suavemente un solo golpe en aproximadamente el centro de la superficie epitelial del ojo con cuidado y asegúrese de que no haya daños en el estroma(Figura 5). El poke debe limitarse al epitelio (~100-200 μm) para evitar la afectación del estroma.</li>
		<li>Usando una cuchilla esterilizada afilada, haga una pequeña incisión en la esclerótica a 1 mm de distancia de la córnea. Cortar el borde de la córnea asegurando que el humor vítreo no se filtre utilizando una acción giratoria rápida y suave de la mano (Figura 6A). Al sostener la córnea en el borde de la córnea-esclerótica con una pinza plana, corte las membranas de anclaje restantes del ojo con la cuchilla (Figura 6B).</li>
		<li>Tome la córnea y colóquela en una placa de 12 pozos superpuesta con 2 ml de córnea media. La córnea debe colocarse hacia arriba, demostrada en una serie de pasos en las Figuras 7A-D, Figura 8).</li>
		<li>Añadir 5 μL de la solución del virus que contiene 5 x 105 unidades formadoras de placa (PFU) de 17 GFP al sitio desbridado en la superficie corneal. Coloque la placa de 12 pozos que contiene córneas porcinas infectadas en una incubadora con 5% de CO2 durante 72 h.</li>
		<li>Rocíe cualquier ojo adicional que no se haya utilizado en el experimento con lejía al 10% y se elimine de forma segura en bolsas de riesgo biológico.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualización NOTA: El virus debe visualizarse todos los días antes de la adición de medicamentos.<ol>
<li>Encienda el microscopio estéreo y la fuente de luz LED y permita que la lámpara de la máquina se caliente antes de obtener imágenes de las córneas. Lleve cuidadosamente la placa de córneas al instrumento sin perturbar la solución. Cambie el filtro para que se use GFP (380-460 nm) para observar las muestras. Establezca el tiempo de exposición en 500 ms para capturar imágenes.</li>
		<li>Primero, coloque la placa de la córnea debajo del estereoscopio y capture las imágenes con el aumento más bajo de 7.5x. Siga esto con una serie de imágenes de aumento creciente (por ejemplo, 15x, 25x, 35x) de modo que toda la propagación viral y la formación de dendritas se visualicen claramente.</li>
		<li>Asegúrese de devolver las córneas infectadas a la incubadora de cultivo de tejidos y guarde todas las imágenes que se tomaron.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuantificación de la infección por virus NOTA: Los títulos de virus de las córneas porcinas deben evaluarse todos los días para analizar el efecto del tratamiento farmacológico.<ol>
<li>Para cuantificar el virus, sembrar células Vero a una densidad de 5 x 105 de células por pozo si se utiliza una placa de 6 pozos como se hizo en este experimento. Haga esto un día antes de la infección. Incubar las células chapadas durante la noche para asegurarse de que sean confluentes para la cuantificación del virus.</li>
		<li>Alícuota 500 μL de medios libres séricos en múltiples tubos de microcentrífuga. Inserte un hisopo estéril con punta de algodón sumergido en los tubos llenos de medios libres de suero. Los hisopos de algodón deben sumergirse y humedecerse durante al menos 5 minutos antes del uso.</li>
		<li>Sin perturbar los medios subyacentes, transporte la placa de córnea porcina infectada a un gabinete de bioseguridad. Usando los hisopos húmedos de algodón, haga 3 revoluciones en el sentido de las agujas del reloj y 3 revoluciones en sentido contrario a las agujas del reloj a un diámetro de 5 mm desde el centro de la córnea porcina infectada sin aplicar una presión excesiva.</li>
		<li>Inserte de nuevo el hisopo de algodón en el tubo de microcentrífuga lleno de medios libres de suero y gírelo en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj 5 veces. La punta metálica del hisopo de algodón debe cortarse para que quepa completamente en el tubo de la microcentrífuga y la tapa se pueda cerrar.</li>
		<li>Coloque el tubo de la microcentrífuga que contiene la punta de algodón hisopado en una máquina de vórtice y el vórtice a alta velocidad durante 1 minuto.</li>
		<li>Realizar la cuantificación del virus a través de un ensayo de placa en estas muestras. NOTA: Este paso de cuantificación debe realizarse en los días 2, 4 y, opcionalmente, en 6 días después de la infección.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuantificación del virus mediante ensayo de placa NOTA: Para realizar un ensayo de placa, crezca y platee las células Vero en una placa de 6 pozos y asegure una confluencia del 90% de las células antes del inicio del ensayo. Utilice un matraz confluente de 75 cm2 de estas células. Todos los pasos a continuación deben realizarse dentro de un gabinete de bioseguridad.<ol>
<li>Lave la monocapa confluente de células Vero en el matraz con 10 ml de solución salina tampón de fosfato fresco (PBS) después de aspirar el medio de cultivo. Repita el paso de lavado una vez más con PBS después de aspirar el primer juego de solución de lavado.</li>
		<li>Añadir 1 ml de tripsina al 0,05% a la monocapa celular. Incubar el matraz a 37 °C durante 5 min. A simple vista, asegúrese de que las células estén separadas de la superficie interior del matraz. De lo contrario, espere otros 5 minutos antes de volver a examinar el matraz. Cuando las células parezcan estar separadas, agregue 9 ml de medios enteros a la monocapa para asegurarse de que las células se desalojen completamente de la superficie del matraz.</li>
		<li>Recoge todas las células del matraz junto con todo el medio y colócalas en un tubo centrífugo de 15 ml.</li>
		<li>Para cada pozo de las 6 placas de pozo que se utilizan para el ensayo de placa, use 300 μL del tubo de la centrífuga. Rellene cada pozo de la placa de 6 pozos con 2 ml de medios enteros. Deje las placas en la incubadora durante la noche para permitir que crezcan y formen una monocapa confluente en cada pozo.</li>
		<li>Para realizar un ensayo de placa, se debe realizar una dilución en serie de las muestras antes de la cuantificación del virus.</li>
		<li>Realizar una dilución log101 veces del virus en tubos de microcentrífuga utilizando medios libres de suero hasta alcanzar una dilución de10 -8. Cuando en una dilución de 10-3, transfiera 1 ml de la dilución a la monocapa de células chapadas después de aspirar los medios de crecimiento en las células de la placa de 6 pozos, este será el paso de infección. Incubar la placa infectada a 37 °C incubadora durante 2 h.</li>
		<li>Aspire los medios de infección existentes, lave con PBS dos veces suavemente para recubrir las células y agregue 2 ml de medios cargados de metilcelulosa por pozo a los 6 pozos. Incubar durante 72 h o hasta que se pueda ver la formación de placas. Las placas se pueden identificar por la formación de pequeños espacios entre las células en la monocapa celular.</li>
		<li>Agregue 1 ml de metanol lentamente a la esquina de cada pozo, utilizando la pared como punta guía. Incubar la placa de 6 pozos a temperatura ambiente durante 15 min. Aspire lentamente el contenido de cada pozo de la placa sin perturbar o agitar la monocapa celular.</li>
		<li>Agregue 1 ml de solución de trabajo violeta cristalina a cada pozo de placa de 6 pozos, asegurando que todas las células estén cubiertas. Incubar la placa de 6 pozos en la oscuridad durante 30 min. Deseche la solución violeta cristalina acrispándola y seque los pozos en una hoja de papel absorbente.</li>
		<li>Cuente el número de placas en el pozo de dilución más alto para cuantificar el contenido total del virus en la solución inicial. Repita el proceso dos veces para confirmar el título viral.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li>
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<li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559(2017).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+Histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li>
<li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861(2018).</li>
<li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflicto de intereses ni intereses financieros en competencia.

Investigaciones anteriores han demostrado que BX795 tiene un papel prometedor como agente antiviral contra la infección por HSV-1; inhibiendo la quinasa de unión a TANK 1 (TBK1)16. Tanto TBK1 como la autofagia han desempeñado un papel en ayudar a inhibir la infección por HSV-1, como se ha demostrado en las células epiteliales corneales humanas. BX795 demostró ser máximamente efectivo con actividad antiviral a una concentración de 10μM y utilizando tanto el análisis de western blot como el análisis...

Las personas que sufren de infecciones oculares a menudo incurren en pérdida de la visión1. Con una alta seroprevalencia en todo el mundo, los individuos infectados por el VHS sufren infecciones oculares recurrentes que conducen a cicatrices corneales, queratitis estromal y neovascularización2,3,4,5. Las infecciones por VHS también han demostrado causar con menos frecuencia, una variedad de afecciones graves entre pacientes inmunocomprometidos y no tratados, como encefalitis y morbilidad sistémica6,7,8. Medicamentos como el aciclovir (ACV) y sus análogos de nucleósidos han demostrado un éxito constante en la reducción de la infección por HSV-1 e incluso la reactivación de control, sin embargo, el uso prolongado de estos medicamentos se asocia con insuficiencia renal, anomalías fetales y la incapacidad de restringir la aparición de resistencia a los medicamentos a las cepas virales en evolución9,10,11,12,13. Las complejidades asociadas a las infecciones oculares por HSV-1, han sido previamente estudiadas in vitro utilizando monocapas y cultivos 3D de células corneales humanas e in vivo utilizando infecciones oculares murinas o de conejo. Si bien estos modelos in vitro proporcionan datos significativos sobre los componentes biológicos celulares de las infecciones por HSV-1, sin embargo, no logran imitar la intrincada complejidad del tejido corneal y hacen poco para iluminar la propagación dendrítica del virus14. En contraste, aunque los sistemas in vivo son más perspicaces al mostrar la propagación de la infección en las córneas y las respuestas de activación inmune durante la infección por HSV-1, vienen con la advertencia de que requieren investigadores capacitados y grandes instalaciones para el cuidado de animales para pasar por alto los experimentos.
Aquí utilizamos córneas porcinas como modelo ex vivo para examinar el sistema de heridas inducidas por infección por HSV-1. Tanto la farmacología potencial de ciertos fármacos como la biología celular y molecular del sistema de heridas causado por la infección se pueden estudiar a través de cultivos de explantes de tejidos. Este modelo también puede ser modificado para el uso de otras infecciones virales y bacterianas también. En este estudio, se utilizaron córneas porcinas para probar la eficacia antiviral de una molécula pequeña preclínica, BX795. Se prefirió el uso de córneas porcinas debido a la facilidad de acceso y la rentabilidad. Además, los modelos de córnea porcina son buenos modelos de ojos humanos con las córneas siendo fáciles de aislar, de tamaño adecuado para la infección y visualización y robustas para manejar15. Las córneas porcinas también son comparables a la complejidad de los modelos corneales humanos tanto en permeabilidad trans corneal como en absorción sistémica15. Al usar este modelo para el estudio, pudimos dilucidar cómo BX795 es digno de una mayor investigación como un inhibidor competente de la infección por el virus HSV-1 y se suma a la literatura de clasificarlo como un posible compuesto antiviral de molécula pequeña16.

<table><tbody><tr><td>Agujas hipodérmicas de 30 G.</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>frasco de vidrio de 500 mL.</td><td>Thomas Scientific</td><td>844027</td><td></td></tr><tr><td>Antimicótico y Antibiótico (AA)</td><td>GIBCO</td><td>15240096</td><td>Aliquot en tubos de 5 ml y manténgalo congelado hasta que use</td></tr><tr><td>el vórtice de sobremesa.</td><td>Gabinete de bioseguridad BioDot</td><td>BDVM-3200</td><td></td></tr><tr><td>con certificación de bioseguridad de nivel 2 (BSL-2).</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Herasafe 2030i</td><td></td></tr><tr><td>Calgiswab 6" hisopos estándar estériles de alginato de calcio.</td><td>Puritan</td><td>22029501</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células - 25 cm</td><td>Biologix BE</td><td>70-1180 70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Cristal violeta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6158</td><td>Guarde el polvo en un lugar oscuro</td></tr><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio - DMEM</td><td>GIBCO 41966029</td><td></td><td>Tienda a 4 &deg; C hasta su uso</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino -FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>Alícuota en tubos de 50 mL y manténgalo congelado hasta su uso</td></tr><tr><td>Pinzas de borde plano &ndash; 2.</td> <td>Harward Instruments</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>Congeladores --80 &deg;C. -</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>13 100 790</td><td></td></tr><tr><td>Caja fresca de cuchillas.</td><td>Thomas Scientific</td><td>TE05091</td><td></td></tr><tr><td>Guaze</td><td>Johnson & Carpeta Johnson</td><td></td><td>de 108 pulgadas cuadradas de 12 capas</td></tr><tr><td>HSV-1 17GFP</td><td>cultivada en</td> <td>casa-Cepa</td> <td>original de la Dra. Patricia Spears, Universidad Northwestern. GFP que expresa HSV-1 cepa 17</td></tr><tr><td>Insulina, Transferrina, Selenio - ITS</td><td>GIBCO</td><td>41400045</td><td>Aliquot en tubos de 5 mL y manténgalo congelado hasta que use</td></tr><tr><td>el agitador magnético.</td>Tijeras metálicas <td></td><td></td><td>Thomas Scientific H3710-HS</td></tr><tr><td>.</td><td>Harward Instruments</td><td>72-8400</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas 1 a 1000 &micro;L.</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159M37</td><td></td></tr><tr><td>Medio Esencial Mínimo - MEM</td><td>GIBCO 11095080</td><td></td><td>Tienda a 4 &deg; C hasta el uso</td></tr><tr><td>de OptiMEM&nbsp;</td><td>Tienda GIBCO</td><td>31985047</td><td>a 4 & deg; C hasta el uso</td></tr><tr><td>de Penicilina/estreptomicina.</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td>Aliquot en tubos de 5 mL y manténgalos congelados hasta su uso</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino -PBS</td><td>GIBCO</td><td>10010072</td><td>Almacene a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Porcine Corneas</td><td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td><td></td><td>Pedido especial a pedido</td></tr><tr><td>Procedimiento Fundas de banco - según sea necesario.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>S42400</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>Thomas Scientific</td><td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td><td></td></tr><tr><td>Equipo de pipeteo serológico.</td><td>Thomas Scientific</td><td>Ezpette Pro</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td>SteREO Discovery V20</td><td></td></tr><tr><td>Imán agitador.</td><td>Thomas Scientific</td><td>F37120</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo de tejidos, T175 cm2.</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1275</td><td></td></tr><tr><td>Incubadoras de cultivo de tejidos que pueden mantener un 5% de CO2 y 37 &deg; Temperatura C.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Forma 50145523</td><td></td></tr><tr><td>Placas tratadas con cultivo de tejidos (6 pocillos).</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>GIBCO</td><td>25-300-062</td><td>Alícuota en tubos de 10 mL y mantener congelado hasta su uso</td></tr><tr><td>Células Vero</td><td>Colección de cultivo tipo americano ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr></tbody></table>

explante de tejido corneal porcino para estudiar la eficacia de los antivirales del virus del herpes simple-1

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Los virus y las bacterias pueden causar una variedad de defectos de la superficie ocular y degeneración, como heridas y úlceras a través de la infección corneal. Con una seroprevalencia que oscila entre el 60-90% en todo el mundo, el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) comúnmente causa lesiones mucocutáneas de la región orofacial que también se manifiestan como lesiones y ceguera asociada a la infección. Si bien los medicamentos antivirales actuales son efectivos, la aparición de resistencia y la persistencia de efectos secundarios tóxicos requiere el desarrollo de nuevos antivirales contra este patógeno ubicuo. Aunque la evaluación in vitro proporciona algunos datos funcionales con respecto a un antiviral emergente, no demuestran la complejidad del tejido ocular in vivo. Sin embargo, los estudios in vivo son costosos y requieren personal capacitado, especialmente cuando se trabaja con agentes virales. Por lo tanto, los modelos ex vivo son pasos eficientes pero económicos para las pruebas antivirales. Aquí discutimos un protocolo para estudiar la infección por HSV-1 utilizando córneas porcinas ex vivo y un método para tratarlas tópicamente utilizando medicamentos antivirales existentes y nuevos. También demostramos el método para realizar un ensayo de placa utilizando HSV-1. Los métodos detallados se pueden utilizar para realizar experimentos similares para estudiar infecciones que se asemejan al patógeno HSV-1.

Para comprender la eficacia de los antivirales experimentales, deben probarse ampliamente antes de enviarlos a ensayos clínicos in vivo en humanos. En este sentido, se deben identificar los grupos de control positivo, control negativo y prueba. La trifluorotimidina (TFT) se ha utilizado durante mucho tiempo como el tratamiento preferido para tratar la queratitis por herpes por vía tópica16. Utilizados como un control positivo, los grupos corneales tratados con TFT muestran una menor propagación de...

Describimos el uso de una córnea porcina para probar la eficacia antiviral de los fármacos experimentales.

Explante de tejido corneal porcino para estudiar la eficacia de los antivirales del virus del herpes simple-1

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Comprender la eficacia de los medicamentos en modelos animales es costoso y requiere mucha mano de obra. Nuestro protocolo que utiliza un modelo de explante de tejido ex vivo es significativamente menor tanto en términos de costo como de personal científico requerido para realizar el estudio. La principal ventaja de esta técnica es el uso de ojos porcinos, que tienen una anatomía y fisiología muy similares a los ojos humanos en comparación con algunos otros modelos de animales pequeños.Cuando probamos medicamentos in vitro, pueden mostrar una eficacia que podría estar ausente en modelos animales o humanos. Los sistemas de tejidos ex vivo son la mejor manera de entender si nuestros sistemas in vitro pueden o no traducirse en ensayos en animales y humanos. El sistema de córnea porcina, aunque menos laboriosa, requiere habilidades entrenables para aislar, mantener, infectar y tratar con los medicamentos, especialmente el proceso de aislamiento de la córnea de todo el ojo porcino es difícil de expresar con palabras, pero requiere demostración visual.Al recibir los ojos porcinos de un proveedor adecuado, almacene los pañuelos en hielo hasta su procesamiento y póngase el equipo de protec

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este artículo de vídeo se describe el uso de un...

Ex Vivo organotípicos Modelo corneal aguda de herpes simplex virus tipo epitelial que la infección

La mayoría de los estudios de la enfermedad corneal herpética utilizar un modelo de infección primaria. Sin embargo, la infección primaria con el virus HSV-1 no suele conducir a la enfermedad humana. Aquí se describe un modelo de la enfermedad herpética recurrente corneal, que más estrechamente imita la enfermedad humana.

Queratitis herpética estromal recurrente en ratones, un modelo para el estudio HSK Humanos

Este video describe un protocolo para configurar un modelo ex vivo para la queratitis bacteriana utilizando un botón corneoescleral diseccionado del ojo porcino. Las bacterias inoculadas atraviesan las incisiones epiteliales de la córnea para invadir el estroma subyacente y establecer una infección dentro de los tejidos corneales que imita la infección in vivo.

Modelo de Córnea Porcina Ex vivo de Queratitis Bacteriana: Una Técnica para Establecer la Infección Bacteriana en las Células Epiteliales de la Córnea

Este video muestra un procedimiento no invasivo asistido por láser para dañar selectivamente las células endoteliales de la córnea en el ojo porcino. El modelo ex vivo desarrollado de daño celular endotelial se puede utilizar para estudiar enfermedades del endotelio corneal.

Ablación selectiva asistida por láser de células endoteliales corneales porcinas: una técnica para inducir lesiones endoteliales corneales porcinas focalizadas para estudios ex vivo

Este video muestra el método para realizar un ensayo de placa utilizando un virus obtenido de córnea porcina infectada. La córnea porcina se utiliza para probar la eficacia antiviral de fármacos experimentales.

Determinación de la eficacia antiviral de fármacos experimentales mediante un ensayo de placa

La piel es un tejido objetivo del patógeno humano virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1). Para explorar la ruta de invasión del VHS-1 en el tejido, establecimos un modelo de infección ex vivo de láminas epidérmicas murinas, que representan la capa más externa de la piel.

Ex Vivo Infección de murino Epidermis con virus herpes simplex tipo 1

Este artículo describe un protocolo paso a paso para establecer un modelo ex vivo porcino de queratitis bacteriana. Pseudomonas aeruginosa se utiliza como organismo prototípico. Este modelo innovador imita la infección in vivo, ya que la proliferación bacteriana depende de la capacidad de la bacteria para dañar el tejido corneal.

Establecer un modelo de córnea ex vivo porcina para estudiar tratamientos farmacológicos contra la queratitis bacteriana

Desarrollamos un modelo de rata de inflamación corneal severa a través de legrado de epitelio corneal combinado con suturas corneales. El estudio evaluó los patrones de inflamación de la córnea, la proliferación epitelial y los cambios en las células madre limbales en condiciones inflamatorias.

Establecimiento de un modelo de inflamación corneal severa en ratas basado en legrado del epitelio corneal combinado con suturas corneales

El cultivo de órganos ex vivo de córnea porcina y la cicatrización de heridas epiteliales proporcionan un medio económico, ético, reproducible y cuantitativo para probar la toxicidad ocular de los productos químicos. También ayudan a dilucidar los mecanismos subyacentes a la regulación de la epitelización y la reparación de tejidos, y a evaluar terapias para el tratamiento de la queratopatía diabética y el retraso en la cicatrización de heridas.

Evaluación de la toxicidad terapéutica y química mediante el cultivo de órganos de córneas porcinas y la cicatrización de heridas epiteliales

A la inversa sistema de genética de la cepa del virus de la fiebre del Valle del Rift MP-12 vacuna es una herramienta útil para la creación de nuevas MP-12 mutantes con mayor atenuación e inmunogenicidad. Se describe el protocolo para la generación y caracterización de cepas mutantes Sociedades Nacionales.

Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia

Aprende a utilizar explantes de córnea porcina ex vivo para evaluar la eficacia de fármacos antivirales contra el virus del herpes simple-1. Este modelo reduce costos y personal científico requerido.

Explante de tejido corneal porcino para estudiar la eficacia de los antivirales del virus del herpes simple-1

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