Observación de la función de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes en rodajas de tejido pancreático vivo
12 de abril de 2021
Este estudio presenta la aplicación de rodajas de tejido pancreático vivo al estudio de la fisiología de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes.
Nuestro protocolo ayudará a responder el impacto que las interacciones de las células inmunes tienen en la funcionalidad de los islotes. El método de corte de tejido pancreático vivo permite estudiar la fisiología y la función de los islotes mientras se mantienen las patologías subyacentes de los tejidos y el microambiente nativo. Este método podría proporcionar información sobre los procesos de enfermedad de las enfermedades pancreáticas, como la pancreatitis, la diabetes tipo I y la diabetes tipo II.
Para comenzar, coloque los bloques en el soporte de la muestra de tal manera que no excedan el ancho de la cuchilla, asegurando que la cuchilla pueda avanzar la menor distancia posible cuando el vibratome se mueva lentamente. Aplique una línea de súper pegamento en el soporte de la muestra, haciendo una capa delgada usando el extremo del dispensador de pegamento, luego voltee los bloques de tejido sobre el pegamento para que el lado cercano al tejido mire hacia arriba. Empuje suavemente hacia abajo los bloques y deje que el pegamento se seque durante tres minutos.
A continuación, conecte la placa al vibratomo con un tornillo y ajuste la altura de la cuchilla y la distancia que se recorre para que la cuchilla se mueva a lo largo de los bloques y apenas por encima de ellos. Empuje suavemente los bloques con las pinzas para verificar que el pegamento se haya secado y luego llene la bandeja de vibratomo con una solución extracelular refrigerada hasta que la cuchilla esté cubierta. Coloque el vibratome para hacer rebanadas de 120 micrómetros de espesor y comience, luego observe las rodajas que salen de los bloques de tejido.
Levante las rodajas cuando floten fuera del bloque colocando un pincel o fórceps debajo de ellas y coloque las rodajas en tampón de bicarbonato Krebs-Ringer que contenga tres milimolares inhibidores de D-glucosa y tripsina. Coloque las placas que contienen las rodajas en un balancín e incube a temperatura ambiente durante una hora a 25 RPM. Si las rebanadas deben mantenerse durante más tiempo, coloque las rebanadas en 15 mililitros de medio de cultivo de rebanadas y coloque la placa en una incubadora.
Incube las rebanadas preparadas a 37 grados Celsius para estudios el mismo día o transfiera las rebanadas que se cultivan a 24 grados Celsius durante la noche a 37 grados Celsius durante al menos una hora antes del experimento. Encienda el microscopio al menos una hora antes de la grabación y equilibre la incubadora superior del escenario a 37 grados centígrados. Asegure la placa de Petri con fondo de vidrio de la cubierta que contiene la rebanada en el escenario.
Enfoque el microscopio estableciendo el objetivo 10X en el modo de campo brillante y localice los islotes utilizando el modo de campo brillante buscando óvalos de color marrón anaranjado dentro de la rebanada. Cambie el microscopio a imágenes confocales presionando el botón CS en el controlador de pantalla táctil del microscopio. Para ver los islotes utilizando la reflectancia, encienda el detector láser 638 y el detector PMT.
Ajuste la potencia del láser entre uno y 2% y apague los filtros de muesca. Utilice el láser de 405 nanómetros y el detector PMT para observar la mancha de ácido nucleico. El detector híbrido para la detección de anticuerpos CD8 y el detector láser e híbrido de 488 nanómetros para ver el tetrámero de insulina.
Centra el islote de interés en el campo de visión utilizando las perillas X e Y del controlador de escenario. Una vez que se encuentra un islote de interés, cambie al objetivo 20X y amplíe para que el islote ocupe la mayor parte del marco. Tome una pila Z del islote, luego encuentre las mejores secciones ópticas donde las células están vivas y las células inmunes circundantes están enfocadas.
Configure el microscopio para que grabe en modo XYZT y optimice la configuración para registrar una pila z de los pasos seleccionados cada 20 minutos durante un período de varias horas. Los islotes en una rebanada de tejido pancreático se visualizaron mediante microscopía de campo brillante y luz reflejada. La insulina en los islotes aumenta la granularidad y provoca la absorción de grandes cantidades de luz reflejada, aumentando la visibilidad de los islotes.
La viabilidad de una rebanada de tejido pancreático humano vivo se evaluó mediante tinción. Las células vivas están indicadas en verde y las células muertas en azul. Otro indicador positivo de viabilidad es la actividad basal observable.
Cuando una rebanada pancreática viva se cargó con un indicador de calcio permeable a las células, se observó estimulación de la glucosa en las rebanadas pancreáticas de ratón y humano. También se cuantificó la fluorescencia de células individuales durante la estimulación de la glucosa. Se observaron islotes intactos y enfermos mediante tinción de ditizona y microscopía de luz reflejada.
Los islotes enfermos comienzan a perder granularidad debido a la infiltración de células inmunes y la muerte celular. Las poblaciones de células inmunes se pueden identificar utilizando anticuerpos CD8 y tinción de tetrámeros de insulina. La tinción conjunta indica que las células son células T efectoras que se dirigen específicamente al antígeno de insulina.
Lo más importante a recordar en este procedimiento es mantener las rebanadas en soluciones inhibidores de la proteasa en todo momento. Después de este procedimiento, se pueden realizar numerosas funciones en experimentos con células inmunes que permiten estudiar el efecto de las interacciones de las células inmunes y la función de los islotes.
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Descripción general
Este estudio presenta la aplicación de cortes de tejido pancreático viable a la investigación de la fisiología de los islotes y las interacciones entre islotes y células inmunitarias. El método permite examinar la funcionalidad de los islotes manteniendo el microentorno nativo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Inmunología
Antecedentes
- Las células de los islotes desempeñan un papel crucial en el metabolismo de la glucosa.
- Las interacciones de las células inmunitarias pueden afectar la función de los islotes.
- Comprender estas interacciones es fundamental para abordar las enfermedades pancreáticas.
- Los cortes de tejido vivo mantienen el contexto fisiológico de las células.
Objetivo del estudio
- Investigar el impacto de las interacciones entre células inmunitarias en la funcionalidad de los islotes.
- Proporcionar información sobre enfermedades pancreáticas como la diabetes tipo I y tipo II.
- Desarrollar un método que preserve las patologías tisulares y los microentornos.
Métodos Utilizados
- Preparación de cortes de tejido pancreático vivo.
- Uso de un vibrátomo para realizar cortes precisos.
- Aplicación de pegamento superfuerte para la estabilización del bloque de tejido.
- Observación en tiempo real de las interacciones entre células inmunitarias e islotes.
Resultados principales
- El método de corte de tejido pancreático vivo conserva eficazmente la fisiología de los islotes.
- Se ha demostrado que las interacciones de las células inmunitarias afectan significativamente la función de los islotes.
- Este enfoque permite el estudio de las patologías subyacentes.
- Los conocimientos obtenidos podrían orientar estrategias de tratamiento para enfermedades pancreáticas.
Conclusiones
- Los cortes de tejido pancreático vivos son una herramienta valiosa para estudiar la fisiología de los islotes.
- El método puede mejorar la comprensión de las interacciones inmunitarias en la función de los islotes.
- La investigación futura puede basarse en estos hallazgos para abordar trastornos pancreáticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los cortes de tejido pancreático vivos permiten la observación directa de las interacciones entre células de los islotes y células inmunitarias dentro de un microentorno nativo preservado, ofreciendo un sistema fisiológicamente relevante para la reducción mecanicista de riesgos en la validación de dianas para la diabetes. Este enfoque refuerza la confianza predictiva al mantener la viabilidad del tejido y las patologías subyacentes, como la diabetes tipo 1 y tipo 2, lo que permite a los equipos de I+D evaluar hipótesis terapéuticas en un contexto relevante para la enfermedad. El método conecta la biología del descubrimiento y la investigación traslacional al proporcionar lecturas cuantitativas en tiempo real de la función de los islotes y la dinámica de las células inmunitarias, fundamentales para tomar decisiones de avance o interrupción en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos para la diabetes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de la infiltración de células inmunitarias y su impacto directo en la integridad de los gránulos de los islotes y la liberación de insulina.
- Valor operativo: Conserva la arquitectura tisular nativa y las interacciones celulares, reduciendo la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas para terapias inmunomoduladoras de la diabetes.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al vincular la actividad de las células inmunitarias con el deterioro funcional de los islotes, proporcionando una lectura alineada con biomarcadores para la interacción con la diana.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de fluorescencia a partir de indicadores de calcio y tinción de tetrámero de insulina para evaluar los efectos dependientes de la dosis de compuestos sobre la función de los islotes.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de preparación de tejidos y de obtención de imágenes, asegurando mediciones basales reproducibles entre series experimentales y sistemas modelo.
- Escalabilidad: Compatible con microscopía de lapso de tiempo y adquisición de z-stacks, lo que permite el monitoreo longitudinal de la dinámica de células inmunitarias durante varias horas.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Mantiene las patologías subyacentes del tejido pancreático humano y murino, lo que permite el estudio de los mecanismos de la diabetes tipo 1 y tipo 2 en un sistema relevante para la enfermedad.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos iniciales de descubrimiento con la validación preclínica al preservar las interacciones intercelulares críticas para la disfunción de los islotes mediada por el sistema inmunitario.
- Avance ajustado al riesgo: Permite la visualización de las interacciones de los linfocitos T efector con antígenos de insulina mediante la doble tinción con tetrámeros de CD8 e insulina, apoyando decisiones basadas en mecanismos de avance o interrupción del desarrollo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método de corte de tejido pancreático vivo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del objetivo hasta la investigación preclínica, proporcionando un sistema relevante para la enfermedad que mantiene la viabilidad del tejido y el microambiente para estudios mecanicistas de las interacciones entre islotes y el sistema inmunitario.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al permitir la observación en tiempo real del impacto de las células inmunitarias en la fisiología de los islotes, aclarando las vías implicadas en la patogénesis de la diabetes.
- Selección: Proporciona rebanadas de tejido listas para ensayos con resultados cuantitativos provenientes del flujo de calcio estimulado por glucosa y de la unión de tetrámeros de insulina, facilitando la evaluación fiable de compuestos.
- Análisis: Genera datos cronológicos XYZT y secciones ópticas en z-stacks, permitiendo a los equipos cuantificar las respuestas celulares y la localización de células inmunitarias a lo largo del tiempo.
- Investigación Traducional: Mantiene patologías relevantes para la enfermedad y el microambiente nativo, apoyando la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de mecanismos inmunomoduladores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudiar la función de los islotes en múltiples modelos de enfermedad y modalidades terapéuticas, reduciendo el desarrollo redundante de modelos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la visualización directa de las interacciones entre islotes e inmunidad en tejido intacto.
- Valor operativo: Garantiza estandarización y reproducibilidad mediante protocolos controlados de corte, incubación y adquisición de imágenes que mantienen la viabilidad y función del tejido.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al vincular la actividad de las células inmunitarias con el deterioro funcional de los islotes, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas del desarrollo de fármacos para la diabetes.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos inmunomoduladores según su capacidad para mitigar la disfunción de islotes mediada por el sistema inmunitario en un sistema relevante para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de tejidos, corte con vibrátomo y microscopía confocal para la obtención de imágenes en vivo de la dinámica de células inmunitarias.
- Depende de instrumentación que incluye un vibrátomo, microscopio confocal con detectores láser (405 nm, 488 nm, 638 nm) y un incubador acoplado al microscopio para el control ambiental.
- Necesita una estandarización entre equipos en la preparación de cortes, la composición del tampón (bicarbonato de Krebs-Ringer con D-glucosa e inhibidor de tripsina) y las condiciones de incubación para garantizar la reproducibilidad.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes sistemas modelo (humano frente a ratón) o estados patológicos (DM1 frente a DM2) para mantener la viabilidad del tejido y su relevancia patológica.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de inhibidores de proteasas para preservar la integridad del corte y el desafío técnico de mantener la claridad óptica durante imágenes de lapso de tiempo prolongadas.
