Name: Observación de la función de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes en rodajas de tejido pancreático vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Aprende a preparar rodajas de tejido pancreático vivo para estudiar la fisiología de los islotes y sus interacciones con células inmunes. Este método preserva el microambiente nativo y permite investigar enfermedades como la diabetes tipo I y II.

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Este trabajo fue financiado por las subvenciones de los NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 y P01 AI042288. Esta investigación se realizó con el apoyo de la Red de Donantes de Órganos Pancreáticos con Diabetes (nPOD; RRID: SCR_014641), un proyecto colaborativo de investigación de la diabetes tipo 1 patrocinado por JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) y The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). El contenido y las opiniones expresadas son responsabilidad de los autores y no reflejan necesariamente la opinión oficial de nPOD. Las organizaciones de obtención de órganos (OPO) que se asocian con nPOD para proporcionar recursos de investigación se enumeran en http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Gracias al Dr. Kevin Otto, de la Universidad de Florida, por proporcionar el vibratomo utilizado para generar rodajas de ratón.

<ol><li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li>
<li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%3A+etiology+and+reversibility%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li>
<li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+the+study+of+islet+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology.</a> Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).</li>
<li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li>
<li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+persisting+%CE%B2+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).</li>
<li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li>
<li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anesthesia+and+analgesia+in+laboratory+animals%22">Anesthesia and analgesia in laboratory animals</a>. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li>
<li>Gál, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).</li>
<li>Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638(2013).</li>
<li>Stožer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).</li>
<li>Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136(2021).</li>
<li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li>
<li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706(2013).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

El objetivo de este protocolo es explicar la generación de lonchas de páncreas y los procedimientos necesarios para emplear las rebanadas en estudios funcionales e inmunológicos. Hay muchos beneficios al usar rebanadas pancreáticas vivas. Sin embargo, hay varios pasos críticos que son esenciales para que el tejido siga siendo viable y útil durante los protocolos de experimento descritos. Es imperativo trabajar rápidamente. El tiempo transcurrido entre la inyección del páncreas y la generación de las rebanadas en el vibrá...

La afectación del páncreas es patognomónica a enfermedades como la pancreatitis, la DT1 y la DT21,2,3. El estudio de la función en islotes aislados suele implicar la retirada de los islotes de su entornovológico4. El método de rebanada de tejido pancreático vivo se desarrolló para permitir el estudio del tejido pancreático manteniendo intactos los microambientes de los islotes y evitando el uso de procedimientos estresantes de aislamiento de islotes5,6,7. Las rodajas de tejido pancreático de tejido de donante humano se han utilizado con éxito para estudiar la DT1 y han demostrado procesos de pérdida y disfunción de células beta, además de la infiltración de células inmunes8,9,10,11,12,13. El método de rebanada de tejido pancreático vivo se puede aplicar tanto al tejido pancreático de ratón como al humano5,6,8. Las rebanadas de tejido pancreático humano de tejidos de donantes de órganos se obtienen a través de una colaboración con la Red de Donantes de Órganos Pancreáticos con Diabetes (nPOD). Las rodajas de ratón se pueden generar a partir de una variedad de diferentes cepas de ratón.
Este protocolo se centrará en la recombinación diabética no obesa activando el gen-1-null (NOD. Rag1-/-) y receptor de células T transgénico (AI4) (NOD. Rag1-/-. CEPAS de ratón AI4 α/β). CABECEO. Los ratones Rag1-/- son incapaces de desarrollar células T y B debido a una interrupción en el gen 1 (Rag1)14 activador de la recombinación. CABECEO. Rag1-/-. Los ratones AI4 α/β se utilizan como modelo para la diabetes tipo 1 acelerada porque producen un solo clon de células T que se dirige a un epítopo de insulina, lo que resulta en una infiltración constante de islotes y un rápido desarrollo de la enfermedad15. El protocolo presentado aquí describe procedimientos para estudios funcionales e inmunológicos utilizando cortes pancreáticos vivos humanos y de ratón a través de la aplicación de enfoques de microscopía confocal. Las técnicas descritas en este documento incluyen evaluaciones de viabilidad, identificación y localización de islotes, registros de Ca2+ citosólico, así como tinción e identificación de poblaciones de células inmunes.

<table><tbody><tr><td>#3 Estilo Mango de Bisturí</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-163</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td>Tampón HEPES, 1M Solución</td></tr><tr><td>10 cm Plato de cultivo sin tratar</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Jeringa Luer-Lok</td><td>BD 301029</td><td></td><td>BD con puntas Luer-Lok Aguja</td></tr> de <tr><td>27 g</td><td>BD</td><td>BD 305109</td><td>BD Uso general y precisiónGlide Agujas hipodérmicas 35</td></tr><tr><td>mm cubreobjetos placa de Petri con fondo de vidrio</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td>&micro;-Plato de 35 mm, alto</td></tr><tr><td>50 mL jeringa</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr> 8 <tr><td>pocillos cubreobjetos</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>&micro;-Slide 8 Pocillos</td></tr><tr><td>APC anticuerpo CD8a anti-ratón</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>199898</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>CaCl2 (dihidratado)</td></tr><tr><td>Balancín digital compacto</td><td></td> Microscopio de barrido láser confocal <td>Thermo Fisher Scientific</td> 88880020 <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Estenopeico&thinsp;= 1.5-2 unidades aireadas; adquirido con diafragma numérico de 10x/0,40 HC PL APO CS2 en seco y apertura numérica de 20x/0,75 HC PL APO CS2 en blanco de 512&thinsp; y tiempos; &thinsp; Resolución de 512 píxeles</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td></td><td>Sigma G7021</td><td>C6H12O6</td></tr><tr><td>ddiH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td>Etanol sulfóxido de dimetilo</td></tr><tr><td></td><td>Laboratorios de descontaminación</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos Falcon de 35 mm</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Falcon Placas de cultivo de tejidos de fácil agarre</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Feather n.º 10 Cuchilla quirúrgica</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>7204410</td><td></td></tr><tr><td>fluo-4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>permeable a las células Ca2+ indicador</td></tr><tr><td>Gel Control Super Glue</td><td>Loctite</td><td>45198</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Finas</td><td>Endurecidas Herramientas de Ciencia Fina</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Hanks Solución Salina Equilibrada</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>C8H18N2O4S</td></tr><tr><td>Cubitera</td><td>Fisherbrand</td><td>03-395-150</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson Veterinario NDC</td><td>14043-704-05</td><td></td></tr><tr><td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Roboz Tienda Quirúrgica</td><td>RS-7440</td><td>&nbsp; Recto; 500-900 gramos de presión; </td></tr><tr><td>Toallitas Kimwipes</td> de 1.5" de largo <td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34705</td><td>Kimtech Science&trade; Kimwipes&comercio; Limpiaparabrisas para tareas delicadas, 2 capas</td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Kit de viabilidad/citotoxicidad</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Este kit contiene el colorante de células vivas calceína-AM.</td></tr><tr><td>Glucosa baja DMEM</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td>MgCl2 (hexahidratado)</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>MgSO4 (heptahidratado)</td></tr><tr><td>Plataforma calefactada</td><td>magnética Warner Instruments</td><td>PM-1</td><td>Plataforma para cámara de imagen para estimulación dinámica </td></tr><tr><td>Grabaciones Microondas</td><td>GE</td><td>JES1460DSWW</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Jeringa Filtro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>726-2520</td><td></td></tr><tr><td>No.4 Pincel</td><td>Michaels</td><td>10269140</td><td></td></tr><tr><td>Open Diamond Cámara de imagen de baño de diamante</td><td>Warner Instruments RC-26</td> Cámara <td>de</td><td>imágenes para grabaciones de estimulación dinámica</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>permeable a las células Indicador de Ca2+</td></tr><tr><td>Cámara de imagen nocturna</td><td>Okolab</td><td>H201-LG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td>Para producir agarosa para la generación de rodajas</td></tr><tr><td>Tetrámero de insulina marcado con PE Tetrámero</td> de <td>Emory Secuencia central</td><td>YAIENYLEL</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica 71998</td><td></td><td>para vibrátomo; Acero inoxidable de doble filo, sin recubrimiento</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Lonza</td><td>50101</td><td>Para hacer agarosa para la generación de lonchas</td></tr><tr><td>Anclaje de lonchas</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1421</td><td></td></tr><tr><td>Anclaje de corte (imagen dinámica)</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>Anclaje de corte para cámara</td></tr> <tr><td>de imagen dinámicaBicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monohidratado</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>NaH2PO4 (monohidrato)</td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina de soja</td><td>Sigma</td><td>T6522-1G</td><td>Inhibidor de tripsina de Glycine max (soja)</td></tr><tr><td>Stage Adaptador</td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20MW-AL</td><td>Para adaptarse a la cámara de imagen para registros de estimulación dinámica en la platina del microscopio</td></tr><tr><td>Incubadora de sobremesa</td><td>Okolab</td><td>H201</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscopio</td><td>Leica</td><td>IC90 E MSV266</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Tinción azul de células muertas</td><td>Invitrogen</td><td>S34857</td><td>tinción de ácido nucleico azul fluorescente</td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia</td><td>Falcon</td><td>357575</td><td>Falcon&comercio; Pipetas de transferencia desechables de plástico</td></tr><tr><td>Sistema de control de válvulas</td><td>Warner Instruments</td><td>VCS-8</td><td>Sistema para grabaciones de estimulación dinámica</td></tr><tr><td>Vibratome VT1000 S</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td>Fisherbrand Isotemp Baño de agua de lujo de uso general GPD 02</td></tr></tbody></table>

observación de la función de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes en rodajas de tejido pancreático vivo

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Las rodajas de tejido pancreático vivo permiten el estudio de la fisiología y la función de los islotes en el contexto de un microambiente intacto de los islotes. Las rodajas se preparan a partir de tejido pancreático humano y de ratón vivo incrustado en agarosa y se cortan con un vibratomo. Este método permite que el tejido mantenga la viabilidad y la función, además de preservar patologías subyacentes como la diabetes tipo 1 (DT1) y la diabetes tipo 2 (DT2). El método de corte permite nuevas direcciones en el estudio del páncreas a través del mantenimiento de las estructuras complejas y diversas interacciones intercelulares que comprenden los tejidos endocrinos y exocrinos del páncreas. Este protocolo demuestra cómo realizar la tinción y la microscopía de lapso de tiempo de células inmunes endógenas vivas dentro de cortes pancreáticos junto con evaluaciones de la fisiología de los islotes. Además, este enfoque se puede refinar para discernir las poblaciones de células inmunes específicas para los antígenos de células de los islotes utilizando los principales reactivos complejos multimer de histocompatibilidad.

Este protocolo producirá cortes de tejido pancreático vivo adecuados tanto para estudios de funcionalidad como para registros de células inmunes. La apariencia de las rebanadas tanto en el campo brillante como en la luz reflejada se muestra en la Figura 1A, B. Como se discutió, los islotes se pueden encontrar en rodajas utilizando luz reflejada debido a su mayor granularidad que se produce debido a su contenido de insulina (Figura 1C) y se obser...

Este estudio presenta la aplicación de rodajas de tejido pancreático vivo al estudio de la fisiología de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes.

Observación de la función de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes en rodajas de tejido pancreático vivo

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Nuestro protocolo ayudará a responder el impacto que las interacciones de las células inmunes tienen en la funcionalidad de los islotes. El método de corte de tejido pancreático vivo permite estudiar la fisiología y la función de los islotes mientras se mantienen las patologías subyacentes de los tejidos y el microambiente nativo. Este método podría proporcionar información sobre los procesos de enfermedad de las enfermedades pancreáticas, como la pancreatitis, la diabetes tipo I y la diabetes tipo II.Para comenzar, coloque los bloques en el soporte de la muestra de tal manera que no excedan el ancho de la cuchilla, asegurando que la cuchilla pueda avanzar la menor distancia posible cuando el vibratome se mueva lentamente. Aplique una línea de súper pegamento en el soporte de la muestra, haciendo una capa delgada usando el extremo del dispensador de pegamento, luego voltee los bloques de tejido sobre el pegamento para que el lado cercano al tejido mire hacia arriba. Empuje suavemente hacia abajo los bloques y deje que el pegamento se seque durante tres minutos.A continuación, conecte la placa al vibratomo con un tornillo y ajuste la altura de la cuchilla y la distancia que se recorre para que la cuchilla se mueva a lo largo de los bloques y apenas por encima de ellos. Empuje suavemente los bloques con las pinzas para verificar que el pegamento se haya secado y luego llene la bandeja de vibratomo con una solución extracelular refrigerada hasta que la cuchilla esté cubierta. Coloque el vibratome para hacer rebanadas de 120 micrómetros de espesor y comience, luego observe las rodajas que salen de los bloques de tejido.Levante las rodajas cuando floten fuera del bloque colocando un pincel o fórceps debajo de ellas y coloque las rodajas en tampón de bicarbonato Krebs-Ringer que contenga tres milimolares inhibidores de D-glucosa y tripsina. Coloque las placas que contienen las rodajas en un balancín e incube a temperatura ambiente durante una hora a 25 RPM. Si las rebanadas deben mantenerse durante más tiempo, coloque las rebanadas en 15 mililitros de medio de cultivo de rebanadas y coloque la placa en una incubadora.Incube las rebanadas preparadas a 37 grados Celsius para estudios el mismo día o transfiera las rebanadas que se cultivan a 24 grados Celsius durante la noche a 37 grados Celsius durante al menos una hora antes del experimento. Encienda el microscopio al menos una hora antes de la grabación y equilibre la incubadora superior del escenario a 37 grados centígrados. Asegure la placa de Petri con fondo de vidrio de la cubierta que contiene la rebanada en el escenario.Enfoque el microscopio estableciendo el objetivo 10X en el modo de campo brillante y localice los islotes utilizando el modo de campo brillante buscando óvalos de color marrón anaranjado dentro de la rebanada. Cambie el microscopio a imágenes confocales presionando el botón CS en el controlador de pantalla táctil del microscopio. Para ver los islotes utilizando la reflectancia, encienda el detector láser 638 y el detector PMT.Ajuste la potencia del láser entre uno y 2% y apague los filtros de muesca. Utilice el láser de 405 nanómetros y el detector PMT para observar la mancha de ácido nucleico. El detector híbrido para la detección de anticuerpos CD8 y el detector láser e híbrido de 488 nanómetros para ver el tetrámero de insulina.Centra el islote de interés en el campo de visión utilizando las perillas X e Y del controlador de escenario. Una vez que se encuentra un islote de interés, cambie al objetivo 20X y amplíe para que el islote ocupe la mayor parte del marco. Tome una pila Z del islote, luego encuentre las mejores secciones ópticas donde las células están vivas y las células inmunes circundantes están enfocadas.Configure el microscopio para que grabe en modo XYZT y optimice la configuración para registrar una pila z de los pasos seleccionados cada 20 minutos durante un período de varias horas. Los islotes en una rebanada de tejido pancreático se visualizaron mediante microscopía de campo brillante y luz reflejada. La insulina en los islotes aumenta la granularidad y provoca la absorción de grandes cantidades de luz reflejada, aumentando la visibilidad de los islotes.La viabilidad de una rebanada de tejido pancreático humano vivo se evaluó mediante tinción. Las células vivas están indicadas en verde y las células muertas en azul. Otro indicador positivo de viabilidad es la actividad basal observable.Cuando una rebanada pancreática viva se cargó con un indicador de calcio permeable a las células, se observó estimulación de la glucosa en las rebanadas pancreáticas de ratón y humano. También se cuantificó la fluorescencia de células individuales durante la estimulación de la glucosa. Se observaron islotes intactos y enfermos mediante tinción de ditizona y microscopía de luz reflejada.Los islotes enfermos comienzan a perder granularidad debido a la infiltración de células inmunes y la muerte celular. Las poblaciones de células inmunes se pueden identificar utilizando anticuerpos CD8 y tinción de tetrámeros de insulina. La tinción conjunta indica que las células son células T efectoras que se dirigen específicamente al antígeno de insulina.Lo más importante a recordar en este procedimiento es mantener las rebanadas en soluciones inhibidores de la proteasa en todo momento. Después de este procedimiento, se pueden realizar numerosas funciones en experimentos con células inmunes que permiten estudiar el efecto de las interacciones de las células inmunes y la función de los islotes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Nuevos métodos asistidos por ordenador a gran escala de adquisición y análisis de muestras de páncreas mediante inmunohistoquímica manchadas se describen: (1) Cortar la captura virtual de toda la sección, (2) análisis de la misa de datos a gran escala, (3) Reconstrucción de 2D cortes virtuales , (4) la cartografía en 3D de islotes, y (5) El análisis matemático.

Asistida por ordenador a gran escala de visualización y cuantificación de los islotes pancreáticos, distribución de tamaño y arquitectura

Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Ex vivo islote pancreático estudios son importantes para la investigación de la diabetes. Técnicas existentes para el estudio de islotes cultivados en su arquitectura original de 3 dimensiones son lentos, ineficientes y uso poco frecuente. Este trabajo describe un método nuevo, simple y eficiente para la generación de secciones de la parafina de alta calidad de todo cultos islotes.

Islote pancreático inclusión de secciones de la parafina

Este protocolo describe un método para el análisis cuantitativo de la formación de complejos de proteínas mitophagy específicamente en células beta a partir de muestras de islet humanos primarios. Esta técnica permite así el análisis de la mitopagia a partir de material biológico limitado, que son cruciales en las muestras preciosas de células beta pancreáticas humanas.

Visualización de complejos endógenos de mitophagy in Situ en células beta pancreáticas humanas que utilizan el ensayo de ligadura de proximidad

Aquí, presentamos un protocolo para la toma de imágenes y la cuantificación de la dinámica de calcio en poblaciones de células heterogéneas, como las células de los islotes pancreáticos. Los reporteros fluorescentes se entregan en la capa periférica de las células dentro del islotes, que luego se inmoviliza e imagen, y se realiza un análisis por célula de la dinámica de la intensidad de la fluorescencia.

Imagen de la dinámica del calcio en subpoblaciones de células de islotes pancreáticos de ratón

El objetivo de este protocolo es monitorear continuamente la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos y el huésped contribuyente frente a las células del donante. Esto se logra trasplantando islotes humanos en la cámara anterior del ojo (ACE) de un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor del ratón seguido de imágenes repetidas de 2 fotones.

Longitudinal en Imágenes Vivos y Cuantificación del Injerto de Islotes Pancreáticos Humanos y Células Huésped Contribuyentes en la Cámara Ocular Anterior

Presentamos la preparación de lonchas de tejido pancreático agudo y su uso en microscopía de barrido láser confocal para estudiar la dinámica del calcio simultáneamente en un gran número de células vivas, durante largos períodos de tiempo, y con alta resolución espaciotemporal.

Microscopía de barrido con láser confocal de la dinámica del calcio en rodajas agudas de tejido pancreático de ratón

Las imágenes in vivo de alta resolución del páncreas se facilitaron con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas.

Visualización longitudinal estabilizada a nivel celular in vivo del páncreas en un modelo murino con una ventana de imágenes intravitales pancreáticas

Este protocolo describe cómo generar cortes de páncreas humano a partir de donantes de órganos fallecidos para estudiar la función celular en condiciones casi fisiológicas. Este enfoque innovador permite la investigación de islotes normales y estructuralmente dañados y la intrincada interacción entre los compartimentos endocrinos y exocrinos.

Generación de cortes de tejido pancreático humano para estudiar la fisiología endocrina y exocrina del páncreas

Aprende a preparar rodajas de tejido pancreático vivo para estudiar la fisiología de los islotes y sus interacciones con células inmunes. Este método preserva el microambiente nativo y permite investigar enfermedades como la diabetes tipo I y II.

Observación de la función de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes en rodajas de tejido pancreático vivo (Video) | JoVE Journal

Observación de la función de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes en rodajas de tejido pancreático vivo

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