Name: Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprende a cuantificar la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma SH-SY5Y por macrófagos derivados de iPSC mediante imagen de alto contenido. Este ensayo permite evaluar moduladores genéticos y farmacológicos en enfermedades neurodegenerativas.

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Los autores agradecen al Dr. Val Millar y al Dr. Sohaib Nizami por su ayuda con la microscopía de alto contenido, y al Dr. Daniel Ebner por el acceso a los microscopios de alto contenido. Además, los autores agradecen a la Dra. Emma Mead por el asesoramiento sobre el desarrollo de ensayos y a la Sra. Cathy Browne por el apoyo de iPSC. Este trabajo fue apoyado por el Alzheimer's Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, referencia de subvención ARUK-2020DDI-OX), con apoyo adicional al James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) de la Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award de Parkinson's UK (J-1403); MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 y Momentum MC_PC_16034 Awards.

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<li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+Alzheimer%27s+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout%2C+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research & Therapy. 12, 151(2020).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer%27s+disease+not+evident+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
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<li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li>
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<li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La microglía tiene funciones importantes que afectan la iniciación y progresión de enfermedades neurodegenerativas, incluida la fagocitosis de las neuronas apoptóticas. La fagocitosis microglial alterada y la fagocitosis inapropiada de las sinapsis se han asociado con enfermedades neurodegenerativas, aunque los mecanismos subyacentes y la causalidad no se comprenden bien4,23. Este artículo describe un ensayo de fagocitosis para medir la fagocitosis de células apoptóticas por macrófagos iPSC, con una lectura de imágenes de lapso de tiempo de células vivas o microscopía de alto contenido de células fijas, o una combinación de ambas en un solo ensayo. Esta versatilidad significa que el ensayo se puede utilizar para estudiar eventos fagocíticos individuales a lo largo del tiempo en unos pocos pozos o se puede utilizar para la detección de alto contenido con múltiples afecciones o tratamientos. Dado que el ensayo de alto contenido se fija en un solo punto de tiempo, se podrían preparar múltiples placas de ensayo simultáneamente. El ensayo de alto contenido tiene una utilidad potencial para caracterizar macrófagos / microglía con variantes genéticas asociadas a la enfermedad o detectar inhibidores de moléculas pequeñas para detectar cambios en la fagocitosis. El ensayo también se puede adaptar fácilmente para estudiar la fagocitosis de otros modelos de microglía, o potencialmente astrocitos. El ensayo de fagocitosis puede potencialmente multiplexarse con tinciones de imágenes de células vivas, por ejemplo, mitocondrias, calcio o indicadores ROS, y se puede realizar tinción inmunofluorescente posterior a la fijación para proteínas de interés. En comparación con los ensayos de fagocitosis existentes que utilizan células neuronales apoptóticas, las principales ventajas que confiere este protocolo es que la preparación de la carga fagocítica es relativamente simple y rápida, y da como resultado un producto uniforme. Otros ensayos inducen apoptosis de neuronas o SH-SY5Ys con S-nitroso-L-cisteína durante 2 h25,ácido okadaico durante 3 h22,estaurosporina durante 4-16 h26,27, 28,29o irradiación UV durante24 h30,y pueden dar lugar a células en diferentes etapas de la apoptosis. Además, las imágenes de células vivas y las lecturas de imágenes de alto contenido no se han descrito previamente, hasta donde los autores saben. La principal limitación del uso de la fijación de paraformaldehído para preparar la carga fagocítica es que no recapitula completamente el proceso de apoptosis, ya que la fijación evita que las células se dividan en cuerpos apoptóticos, que es probable que se fagocitan más rápidamente debido a su tamaño más pequeño. No se sabe qué efecto tiene la fijación sobre la secreción de señales de nucleótidos "encuéntrame" (por ejemplo, ATP, UDP) de la célula diana que atraen a los fagocitos. Similar a las células apoptóticas, los SH-SY5Ys fijos exhiben cierta permeabilidad de la membrana al yoduro de propidio. La permeabilidad de la membrana se asocia con la liberación de señales de "encuéntrame"; sin embargo, esto no se ha estudiado en los SH-SY5Y fijos, y si los nucleótidos se liberan demasiado rápido, se eliminarían antes de que los SH-SY5Y se agreguen a los macrófagos iPSC.
El primer paso crítico en el protocolo es la tinción de SH-SY5Ys muertos con un éster STP de un tinte fluorescente rojo sensible al pH. Este tinte reacciona rápida y covalentemente con aminas primarias libres en la superficie de los SH-SY5Y muertos. No es necesario optimizar la duración de la tinción; sin embargo, se debe tener cuidado con la manipulación del tinte antes del etiquetado. La reacción de etiquetado no debe realizarse en tampones que contengan aminas libres. Además, existe un riesgo de precipitación si la población dmSO se diluye en tampón acuoso frío o en alta concentración final. Los precipitados aparecerán como objetos oscuros densos bajo el microscopio. Además, la solución de tinte sensible al pH se adhiere a los tubos de centrífuga de plástico normales y se lava lentamente; por lo tanto, se recomiendan tubos de baja unión para el paso de etiquetado. El uso de un tinte sensible al pH, en lugar de un tinte fluorescente permanente, ayuda a la identificación de partículas engullidas, frente a las partículas vecinas a la membrana plasmática. Dado que hay cierta fluorescencia a pH neutro, la densidad de la carga fagocítica y los macrófagos iPSC deben mantenerse lo suficientemente bajas para una segmentación precisa, aunque lo suficientemente alta como para que se capturen numerosos eventos fagocíticos. La microscopía de alto contenido fue capaz de identificar con precisión la fagocitosis con una densidad media de carga en el pozo (más de 2 SH-SY5Ys por iPSC-macrófago). Por el contrario, debido a una sensibilidad más débil del microscopio en el espectro rojo profundo, la segmentación de los macrófagos iPSC en los datos de imágenes de lapso de tiempo de células vivas fue menos segura y fue necesario utilizar una densidad muy baja de carga para reducir la probabilidad de falsos positivos (1 SH-SY5Y por cada dos macrófagos iPSC). La validación de la segmentación adecuada y la densidad de carga debe realizarse con comparaciones entre pozos no tratados y tratados con citochalasina D. En un ensayo bien optimizado, la citochalasina D debería reducir el número promedio de manchas por célula en un 90% en relación con las muestras no tratadas.
Otro paso crítico en el protocolo es la tinción de macrófagos iPSC, que permite identificar y segmentar la célula en el análisis de imágenes para que cualquier SH-SY5Y externo se excluya del conteo. El colorante recomendado es penetrante celular, convertido en un producto fluorescente insoluble dentro del citoplasma, reparable y no tóxico (ver Tabla de Materiales). El paso de tinción se optimizó para el uso de macrófagos iPSC con el ensayo de fagocitosis por imágenes de alto contenido, y sugerimos que se vuelva a optimizar si se utilizan otros tipos de células. La duración de la tinción celular se puede aumentar para mejorar la deposición del producto fluorescente insoluble dentro de las células. Si se optimiza la concentración de colorante, se debe tener cuidado para evitar los niveles tóxicos del vehículo de disolvente orgánico.
El tercer factor crítico para el éxito del ensayo es el análisis de datos. Las tuberías de análisis proporcionadas están destinadas a ser de orientación en lugar de prescriptivas, ya que las diferencias en la intensidad de tinción o la morfología celular pueden reducir la efectividad de la segmentación de las tuberías tal como están escritas. Por lo tanto, se requerirán algunas optimizaciones, con pruebas de la tubería en controles positivos y negativos apropiados, y los parámetros que deben optimizarse se indican en el texto del protocolo. Los controles negativos deben incluir una afección en la que los macrófagos de iPSC se tratan previamente con un potente inhibidor de la fagocitosis como la citochalasina D antes de la adición de SH-SY5Ys. Otro posible control negativo es la adición del SH-SY5Ys a pozos previamente no tratados de macrófagos iPSC al final del ensayo, 10 minutos antes de la fijación, lo que permite cierto asentamiento de la carga, pero es demasiado corto para que ocurra una cantidad apreciable de fagocitosis. Un evento de fagocitosis se define como un objeto rojo-fluorescente dentro de los límites de un macrófago iPSC, definido por el algoritmo de software que utiliza el canal de fluorescencia de color rojo profundo. Si la segmentación de las células es pobre (Figura 2), muchos SH-SY5Ys no fagocitados en las proximidades de los macrófagos iPSC pueden incluirse erróneamente en el análisis, es decir, falsos positivos. El factor más importante para lograr una buena segmentación es la delineación estricta de los macrófagos iPSC. La segmentación para ambos análisis está automatizada, por lo que no es posible obtener una segmentación perfecta para cada célula; sin embargo, se pueden ajustar algunos parámetros para que la segmentación sea más óptima, utilizando algunas imágenes de prueba como referencia. El control de la citochalasina D es importante para evaluar la segmentación óptima porque un alto número de eventos fagocíticos detectados en esta condición indica que la segmentación es subóptima. Idealmente, la optimización de la canalización de análisis de datos debe repetirse hasta que el número de eventos fagocíticos por célula sea entre un 80% y un 90% menor en la condición de citochalasina D frente a ningún inhibidor.
Los problemas con el ensayo de fagocitosis que tienen más probabilidades de ocurrir son: (1) fluorescencia débil sensible al pH en controles positivos, (2) distribución escasa o desigual de macrófagos al final del ensayo, o (3) alto número de falsos positivos en el análisis de SH-SY5Y no fagocitados. La solución de problemas de fluorescencia débil sensible al pH debe verificar en primer lugar que la tinción del SH-SY5Ys resultó en un gránulo celular con un fuerte color magenta. Si el color es débil, asegúrese de que se utiliza un material de tinte fresco, asegúrese de que el tampón de etiquetado esté libre de aminas, agregue un lavado adicional al SH-SY5Ys antes de la tinción, verifique si se tiñó el número correcto de SH-SY5Y, asegúrese de que no haya precipitados de tinte en evidencia y optimice la concentración de etiquetado del tinte. Si los SH-SY5Y están fuertemente teñidos, verifique si la concentración agregada a la placa de ensayo es correcta y asegúrese de que los macrófagos iPSC estén sanos y no sean demasiado viejos. El segundo tipo de problema, la distribución desigual de macrófagos, puede ser el resultado de la pérdida de células durante el pipeteo y se deben tomar medidas para reducir las fuerzas de pipeteo experimentadas por las células, evitando las puntas de diámetro estrecho. Si el problema persiste, reduzca el tiempo de incubación de la carga de los macrófagos iPSC con colorante permeante celular. El tercer problema, con respecto a la inclusión errónea de partículas no fagocitadas en el análisis, indica que se requiere una mayor optimización de la tubería de análisis. La solución de problemas debe centrarse en primer lugar en la segmentación de celdas y si el software está incluyendo objetos adyacentes. Los parámetros específicos que se pueden ajustar se sugieren en las notas a continuación de los pasos relevantes (pasos 6.1.11-6.1.15 para el análisis de lapso de tiempo de celda viva y pasos 6.2.4-6.2.8 para el análisis de alto contenido). Si la segmentación celular no se puede mejorar aún más, el análisis de alto contenido tiene un paso adicional (paso 6.2.8) que excluye los macrófagos iPSC mal segmentados. Además, se puede optimizar el módulo que filtra los puntos aceptados de fluorescencia sensible al pH dentro de los macrófagos iPSC, aumentando la intensidad umbral de los objetos aceptados, lo que debería ayudar a excluir los SH-SY5Y no fagocitados (paso 6.1.17 para el análisis de lapso de tiempo de células vivas y paso 6.2.11 para el análisis de alto contenido).
Desarrollamos dos tipos de lectura de microscopía para el ensayo de fagocitosis que tienen ventajas y limitaciones. Las imágenes de lapso de tiempo de células vivas tienen el mérito de proporcionar información adicional sobre la cinética de la fagocitosis y están más ampliamente disponibles que las plataformas de imágenes de alto contenido. El software de código abierto recomendado es agnóstico a la fuente del microscopio y podría usarse con cualquier microscopio fluorescente de buena calidad, con o sin capacidad de lapso de tiempo de células vivas. La principal limitación de las imágenes de células vivas es la sensibilidad y la óptica limitadas, lo que hace que sea más difícil detectar y realizar una buena segmentación de los macrófagos iPSC. Esta limitación podría mitigarse aumentando la duración de la tinción de macrófagos iPSC, o cambiando a un microscopio más sensible, si está disponible. El ensayo de fagocitosis por imágenes de alto contenido es la lectura recomendada si hay un sistema de imágenes de alto contenido disponible. Los sistemas de imágenes de alto contenido permiten un mayor rendimiento y datos más confiables, lo que permite que este ensayo se utilice para la detección, en la que se esperaría una robusta Z' de ≥0.7 para la salida "número de puntos por célula"20. En comparación con el método de lapso de tiempo de células vivas, la lectura de microscopía de alto contenido tiene una mayor sensibilidad, un mayor grado de automatización y velocidad, se pueden procesar más pozos y campos de imágenes, y se producen imágenes confocales de alta resolución. La segmentación celular es más efectiva con buenas imágenes, y la segmentación también es ayudada por el software de análisis de imágenes de alto contenido que proporciona más métodos de segmentación celular adecuados para células de forma altamente irregular. El software de análisis de imágenes de alto contenido también calculó más parámetros de fagocitosis, en comparación con el software de código abierto, como el porcentaje de células fagocíticas. La principal limitación del ensayo de fagocitosis de alto contenido es la del costo y la accesibilidad del sistema de imágenes y el software de análisis.
En conclusión, el ensayo cuantitativo de fagocitosis presentado en este artículo es una herramienta útil para modelar la fagocitosis de microglia de neuronas muertas in vitro. La microglía es modelada por iPSC-macrófagos y las neuronas muertas son modeladas por SH-SY5Ys fijado en paraformaldehído. Aunque no son los modelos de microglia y neuronas muertas/apoptóticas más auténticos publicados, estos son fáciles de preparar y escalables. El ensayo en sí es altamente versátil, con dos tipos de lectura de imágenes detalladas, y tiene potencial para ser adaptado para su uso con diferentes modelos de monocultivo de microglia / macrófagos, o un tipo de célula diferente para actuar como carga fagocítica. La lectura de imágenes de alto contenido es ventajosa para obtener datos cuantitativos y se puede escalar para evaluar moduladores de moléculas pequeñas de fagocitosis o variantes genéticas de detección en los macrófagos iPSC. Sin embargo, dado que los sistemas de imágenes de alto contenido son caros y tienen muchos datos, se ha incluido una lectura de imágenes alternativa en el protocolo utilizando un microscopio de lapso de tiempo de células vivas, que podría sustituirse por cualquier microscopio de fluorescencia convencional de buena calidad, si es necesario.

Las microglías son macrófagos residentes en el tejido cerebral, y sus funciones incluyen vigilancia inmune, coordinación de respuestas inflamatorias a lesiones / infecciones, remodelación sináptica y fagocitosis de células muertas, mielina, agregados de proteínas y patógenos. La fagocitosis es el proceso por el cual la microglía reconoce la carga con receptores de superficie y reorganiza su citoesqueleto para envolver el objeto en un fagosoma, que luego se fusiona con lisosomas para la degradación de la carga. Microglia fagocitasa sana células cerebrales apoptóticas para eliminarlas antes de que se conviertan en necróticas1. La fagocitosis de las células apoptóticas también se conoce como efemotosis, y requiere la visualización de una señal de fosfatidilserina "come-me" por parte de la célula moribunda2. Numerosos receptores de microglía se unen directamente a la fosfatidilserina, incluyendo TIM-4, BAI1, Stabilin-2 y TREM2. Los receptores microgliales TAM (por ejemplo, MERTK) y las integrinas se unen indirectamente a la fosfatidilserina, utilizando proteínas accesorias GAS6 o MFG-E8, respectivamente. Otras señales de "comerme" pueden ser necesarias para el reconocimiento de las células moribundas, estas incluyen cambios en la glicosilación o la carga de las proteínas de superficie; expresión de proteínas intracelulares ICAM3, calreticulina, anexina-I en la superficie celular; LDL oxidado; o recubrimiento de la célula apoptótica por complemento producido por microglía C1q1,2.
Las enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la demencia frontotemporal y la esclerosis lateral amiotrófica se han asociado con un deterioro de la función de la microglía, incluida una acumulación de productos de desecho cerebral como células muertas, fragmentos de mielina y agregados de proteínas, y respuestas inflamatorias exageradas a estos estímulos3. La fagocitosis puede verse afectada en enfermedades neurodegenerativas y contribuir a la patología, debido a una combinación de envejecimiento, inflamación o variantes genéticas específicas de riesgo4,5. Por otro lado, también hay evidencia a partir de modelos animales de enfermedades neurodegenerativas de que la microglía puede fagocitar inapropiadamente neuronas viables o sinapsis6,7,8. Es probable que el mecanismo sea instigado por la exhibición de fosfatidilserina de neuritas dañadas, que es detectada directamente por los receptores de fagocitosis microglial TREM2 o GPR56, o indirectamente detectada por el complemento soluble C1q que recubre la membrana enriquecida con fosfatidilserina, lo que lleva a la fagocitosis mediada por CR39,10,11.
Los ensayos in vitro de la función de la fagocitosis, por ejemplo, para evaluar el impacto fenotípico de una variante de riesgo genético en la microglía, se realizan con frecuencia utilizando cargas no fisiológicas como las perlas delátex 4. También se utilizan bacterias y zymosan, que son fisiológicas pero no relevantes para las enfermedades neurodegenerativas. Las cargas fagocíticas no fisiológicas se pueden utilizar para detectar defectos en la maquinaria básica de envolvimiento fagocítico, pero no logran modelar con precisión el primer paso de "reconocimiento" en la fagocitosis de las neuronas apoptóticas. El tamaño, la forma, la rigidez y el tipo de carga también dictan las vías de señalización intracelular que se activan, lo que lleva a diferentes resultados del estado de activación de la microglía. Por ejemplo, las bacterias E. coli son pequeñas y rígidas, a diferencia de las células humanas, y los lipopolisacáridos en su superficie son reconocidos por el receptor 4 tipo Toll (TLR4) que activa la fagocitosis y las vías de señalización proinflamatorias2,12.
En el contexto de los estudios de enfermedades neurodegenerativas, una carga fagocítica más relevante tendría una exhibición de fosfatidilserina en las membranas plasmáticas de los mamíferos, e idealmente sería humana y neuronal, para incluir señales que es probable que encuentre la microglía. Para este protocolo de fagocitosis, se eligió la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y como modelo de neurona fácil de cultivar. La exhibición permanente de fosfatidilserina en la superficie fue inducida artificialmente por el paraformaldehído, que previamente se ha demostrado que causa la exhibición de fosfatidilserina de las plaquetas13. Para el modelo de células de microglía se utilizaron macrófagos iPSC humanos, que imitan la ontogenía y el perfil transcripcional de la microglía humana, y son fagocíticamente competentes14,15,16,17. Los macrófagos iPSC no son el modelo de microglía más auténtico disponible, por ejemplo, no imitan la morfología de la microglía; sin embargo, se puede sustituir por un modelo iPSC de microglía de monocultivo más auténtico, como Haenseler et al.15. Los modelos iPSC humanos son preferibles a la microglía primaria de roedores para estudiar la neurodegeneración, debido a las preocupaciones sobre la superposición limitada de los módulos transcripcionales de microglia observados en tejidos de enfermedades neurodegenerativas humanas versus ratón18. Los SH-SY5Y muertos se tiñen con un colorante sensible al ácido que fluorescencia débilmente a pH neutro y más fuertemente dentro de los faglisosomas de los macrófagos iPSC después de la fagocitosis. El uso de un colorante sensible al ácido mejora la precisión de la detección de eventos fagocíticos, con versatilidad para diferentes lecturas de macrófagos vivos y fijos19. Este protocolo describe tanto la imagen de lapso de tiempo de células vivas de la fagocitosis como un ensayo de imágenes fijas de alto contenido para la fagocitosis, con los mismos pasos de preparación celular antes de la lectura(Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático de la metodología. Esquema del ensayo de fagocitosis, donde la preparación de los SH-SY5Ys y la tinción de los macrófagos iPSC se realiza en paralelo, y luego los SH-SY5Ys se canalizan en los macrófagos iPSC. Las imágenes de lapso de tiempo de células vivas se realizan de inmediato, o las células se incuban a 37 ° C / 5% de CO2 durante la duración requerida y se fijan antes de realizar la microscopía de alto contenido. PFA: paraformaldehído, HBM: medios tamponados hepes libres de rojo fenol, pHr: solución de éster STP de colorante fluorescente rojo sensible al pH, PRFMM: medio de macrófagos libre de rojo de fenol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga cónico de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>Para la centrifugación de celdas</td></tr><tr><td>2-20 y micro; L, 20-200 y micro; L, 100-1000 y micro; L micropipetas</td><td></td><td></td><td></td>monocanal</tr><tr><td>2-mercaptoetanol 50 mM</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>componente de los medios de fábrica</td></tr><tr><td>4% de paraformaldehído en PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>Para la fijación de células Placa de</td></tr><tr><td>6 pocillos, tratamiento</td><td></td><td></td><td></td>con cultivo de tejidos</tr><tr><td>AggreWell-800 Placa de 24 pocillos</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34815</td><td>Micropocillo de baja adherencia Placa de 24 pocillos para la formación de cuerpos embrioides</td></tr><tr><td>Anexina V-FITC Kit de tinción / detección de apoptosis</td><td>Abcam</td><td>ab14085</td><td>Kit para la tinción de anexina V-FITC, como ensayo para el control de calidad de SH-SY5Ys fijas. El kit contiene tampón de unión a anexina, anexina V-FITC y yoduro de propidio.</td></tr><tr><td>Contador</td><td></td><td></td><td></td>de células automatizado</tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>sobremesa</td></tr><tr><td>CellCarrier-96 Ultra Microplacas, tratadas con cultivo de tejidos, negras, de 96 pocillos con tapa</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td>Microplaca tratada con cultivo de tejidos (TC) de 96 pocillos con paredes de pocillos negros y fondo ópticamente transparente, para ensayo</td></tr> <tr><td>de fagocitosisSoftware</td><td></td><td></td> CellProfiler <td>Software de código abierto para el análisis de imágenes de fagocitosis obtenidas por microscopio de lapso de tiempo de células vivas. Descargue gratuitamente desde el sitio web (http://cellprofiler.org/), este protocolo utiliza la versión 2.2.0.</td></tr><tr><td>CellTracker Colorante rojo intenso</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34565</td><td>Colorante fluorescente intenso, permeante a las células, reactivo al éster succinimidilo para la tinción de citoplasma de macrófagos iPS. Disuelve el colorante CellTracker Deep Red en DMSO a 2 mM (1,4 mg/mL). Úselo a 1 &mu; M, por dilución de la culata de DMSO con medios macrófagos.</td></tr><tr>Cabina <td></td><td></td><td></td>de <td>seguridad de flujo de aire laminar de clase 2</td></tr><tr><td>Bombona</td><td></td><td></td><td>de gas CO2</td> Accesorio para</tr><tr><td>incubadora automática < COsub>2 EVOS FL, ajustado a 37 grados; C y 5 % CO2</td>Columbus Image Data Storage and Analysis System Perkin Elmer Columbus Plataforma de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>almacenamiento y análisis de datos para Opera Phenix. Es compatible con todos los principales instrumentos de cribado de alto contenido.</td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Cayman</td><td>11330</td><td>Tratamiento de control negativo para el ensayo de fagocitosis. Reconstituya en DMSO a 10 mM y almacene las alícuotas a -20&deg; C, evite más ciclos de congelación y descongelación. Utilizar en la concentración final 10 &micro;M.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td></td><td>11320074 Componente de los medios SH-SY5Y</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Disolvente para tintes CellTracker y pHrodo Sistema de</td></tr><tr><td>imagen automático EVOS FL</td><td>Microscopio de imagen time-lapse de célula viva</td><td>Fisher</td><td>AMF4300</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube CY5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4656</td><td>para EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>AMEP4650 Accesorio para EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube RFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4652</td><td>Accesorio para EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Incubadora de escenario</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMC1000</td><td>Accesorio para EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>Componente de los medios SH-SY5Y</td></tr><tr><td>Citómetro</td><td></td><td></td><td></td>de</tr><tr><td>flujo Citometría de flujo software</td><td></td><td></td><td></td>de análisis</tr><tr><td>Geltrex Libre de LDEV, calificado para hESC, factor de crecimiento reducido Matriz de membrana basal</td><td>Invitrogen</td><td>A1413302</td><td>Matriz de membrana basal calificada para hESC para cultivo iPSC</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>Componente de medios de fábrica y macrófagos</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>BE 10-547F</td><td>Hank' s solución salina equilibrada para los pasos de lavado</td></tr><tr>BMP4 <td>Gibco</td><td>recombinante humano</td><td>PHC9534</td><td>componente de los medios corporales embrioides</td></tr><tr><td>IL-3 recombinante humano</td><td>Gibco</td><td></td><td>PHC0033 componente de los medios de fábrica y macrófagos</td></tr><tr><td>SCF recombinante humano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-695</td><td>Componente de los medios del cuerpo embrioide</td></tr><tr><td>VEGF recombinante humano</td><td>Gibco</td><td>PHC9394</td><td>Componente de los medios corporales embrionarios Solución de</td></tr><tr><td>imagen de células vivas</td><td>Thermo Fisher</td><td>A14291DJ</td><td>Medios tamponados con HEPES sin rojo fenol para el etiquetado de tubos muertos SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>de baja unión a proteínas de 2 ml Eppendorf</td><td></td><td>30108.132</td><td>Para tinción SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>PHC9501 Componente de medios de fábrica y macrófagos</td></tr><tr><td>mTeSR1 Medio</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Medios iPSC</td></tr><tr>Pipeta <td></td><td></td><td>multicanal de 20-200 uL</td><td>Para la manipulación de líquidos de la placa de 96 pocillos</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reactivo</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37605</td><td>Hoechst 33342 formulación en un frasco gotero para teñir núcleos de macrófagos iPS, utilice 0,5 gotas/ml en medios de macrófagos.</td></tr><tr><td>Sistema de cribado de alto contenido Opera Phenix</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14000000</td><td>Microscopio de imágenes de alto contenido, utilizado con la versión 4.9 del software Harmony.</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Componente de medios de fábrica, macrófagos y SH-SY5Y</td></tr><tr><td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36011</td><td>Tinte fluorescente rojo sensible al pH para el etiquetado de SH-SY5Ys muertos. Reconstituya el polvo de éster rojo STP de pHrodo iFL en DMSO a una concentración de 5 mg/mL. Por cada 1 millón de SH-SY5Ys, agregue 2.5 &mu; L (12,5 &mu; g) de pHrodo iFL Red STP Ester a células precalentadas suspendidas en solución de imágenes de células vivas.</td></tr><tr>Llenadora <td></td><td></td><td></td>de <td>pipetas serológicas</td></tr><tr><td>Matraz T175, tratado</td><td></td><td></td> con cultivo <td>de tejidos Recipiente para la diferenciación de precursores de iPSC-macrófagos, conocido como "Fábricas"</td></tr><tr><td>Matraz</td><td></td><td></td> T75 <td>Recipiente para cultivo SH-SY5Y</td></tr><tr><td>Selladores de placas transparentes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676001</td><td>Para el almacenamiento y transporte de placas de ensayo</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1X), sin rojo de fenol</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>tampón de disociación celular que contiene enzimas recombinantes similares a la tripsina y 1,1 mM de EDTA, use puro.</td></tr><tr><td>Baño de agua, ajustado a 37 grados; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Medio con L-glutamina, gentamicina y rojo de fenol</td><td>Lonza</td><td>BE04-418F</td><td>Componente de medios de fábrica y macrófagos</td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Medio con L-glutamina; sin gentamicina ni rojo de fenol</td><td>Lonza</td><td>04-744Q</td><td>Medio macrófago sin rojo de fenol, para uso en fagocitosis sin aditivos ni factores de crecimiento</td></tr></tbody></table>

ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por ipsc-macrófagos

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

La microglía orquesta las respuestas neuroinmunes en varias enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. La microglía elimina las neuronas muertas y moribundas a través del proceso de efecocitosis, una forma especializada de fagocitosis. La función de la fagocitosis puede verse alterada por factores de riesgo ambientales o genéticos que afectan a la microglía. Este artículo presenta un protocolo de microscopía in vitro rápido y simple para estudiar la efemotosis microglial en un modelo de microglía de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), utilizando una línea celular de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) etiquetada con un colorante sensible al pH para la carga fagocítica. El procedimiento da como resultado un alto rendimiento de células muertas de neuroblastoma, que muestran fosfatidilserina superficial, reconocida como una señal de "comerme" por los fagocitos. El ensayo de placa de 96 pozos es adecuado para imágenes de lapso de tiempo de células vivas, o la placa se puede fijar con éxito antes de su posterior procesamiento y cuantificarse mediante microscopía de alto contenido. La microscopía de alto contenido de células fijas permite ampliar el ensayo para el cribado de inhibidores de moléculas pequeñas o la evaluación de la función fagocítica de las líneas iPSC de variantes genéticas. Si bien este ensayo se desarrolló para estudiar la fagocitosis de células muertas enteras de neuroblastoma por macrófagos iPSC, el ensayo se puede adaptar fácilmente para otras cargas relevantes para enfermedades neurodegenerativas, como sinaptosomas y mielina, y otros tipos de células fagocíticas.

Las imágenes de lapso de tiempo de células vivas se realizaron utilizando el protocolo descrito anteriormente, con macrófagos iPSC de tipo salvaje sembrados a 20,000 células por pozo. Se aplicaron diferentes cantidades de SH-SY5Ys (10.000-30.000 por pozo según lo estimado a partir del recuento celular en el paso 3.1), y el inhibidor de la fagocitosis citochalasina D fue preincubado (1 h) con algunos pozos, actuando como control para inhibir la fagocitosis para cada cantidad de SH-SY5Ys. Las imágenes comenzaron 40 minutos después de la adición de SH-SY5Ys y las imágenes se capturaron a intervalos de 5 minutos durante las siguientes 3 h (los datos incluyen el retraso inicial de 40 minutos). Un video representativo de lapso de tiempo se incluye en los Datos suplementarios,y los datos cuantitativos analizados se muestran en la Figura 3. Con la cantidad de 10,000 SH-SY5Ys por pozo, el número de partículas fagocitadas (manchas) por célula aumentó linealmente con el tiempo, y fue inhibido en aproximadamente un 50% por la citochalasina D. La inhibición por citochalasina D fue más débil de lo previsto, muy probablemente causada por réplicas técnicas o biológicas insuficientes, ya que solo se obtuvo una imagen de un pozo por condición con tres campos de imagen. Con mayores cantidades de SH-SY5Ys por pozo (20,000 y 30,000), la fagocitosis exhibió una linealidad deficiente, probablemente debido a la mala segmentación de los macrófagos iPSC y SH-SY5Ys en un campo de visión más concurrido.
Las imágenes de alto contenido de células fijas se realizaron utilizando el protocolo descrito anteriormente, con macrófagos iPSC de tipo salvaje a 20,000 células por pozo, varias cantidades diferentes de SH-SY5Ys (10,000-80,000 por pozo), y la placa de ensayo se fijó y se obtuvo una imagen después de 5 h. Una imagen representativa de la fagocitosis se presenta en la Figura 4A,y los datos analizados se muestran en la Figura 4B17. El aumento de la cantidad de SH-SY5Ys resultó en un mayor número de partículas fagocitadas (manchas) por célula; sin embargo, una duplicación de la cantidad de SH-SY5Y solo conduce a un aumento de 1.5 veces en el número de manchas por célula. Esto indica que las cantidades analizadas no limitan la tasa de fagocitosis. Posteriormente se validó el ensayo de fagocitosis por imágenes de alto contenido utilizando varios inhibidores de la fagocitosis(Figura 4C)17. Los inhibidores de la polimerización de actina citochalasina D y jasplaquinolide inhibieron significativamente la fagocitosis en un 91% y 90%, respectivamente, cuando se preincubaron durante 1 h antes de la fagocitosis. El robusto Z' del ensayo cuando se utilizan citochalasina D o jasplakinolide como controles negativos se calcula como 0,7 y 0,8, respectivamente20. El inhibidor de la acidificación del lisosoma bafilomycin A1 redujo significativamente la fagocitosis en un 31%, cuando se incubó 1 h antes de la fagocitosis. El efecto más débil del inhibidor de la acidificación del lisosoma frente a los inhibidores de la actina sugieren que la detección de la carga internalizada puede no requerir la acidificación completa del fagosoma. La anexina V recombinante se utilizó como control para bloquear específicamente la fosfatidilserina expuesta en la superficie de SH-SY5Ys, evitando que los receptores fagocíticos accedan al ligando, una importante señal de "comerme". La adición de anexina V recombinante redujo significativamente la fagocitosis en un 30%, cuando se agregó a los pozos inmediatamente antes de la adición de SH-SY5Y. Se confirmó que los SH-SY5Y fijos exponían fosfatidilserina, utilizando una sonda fluorescente de anexina V, mientras que los SH-SY5Y vivos eran negativos para la tinción de anexina V(Figura 4D).
El receptor de fagocitosis microglial TREM2 ha demostrado previamente ser importante para la fagocitosis de las neuronas apoptóticas21. La mutación R47H de TREM2 es un gen de riesgo para el inicio tardío de la enfermedad de Alzheimer, y se plantea la hipótesis de reducir la unión al ligando de TREM223. Con el objetivo de evaluar la función fagocítica de R47H TREM2 y TREM2 KO, se realizó el ensayo de fagocitosis de alto contenido de células fijas utilizando líneas isogénicas iPSC-macrófagos con WT/R47H/KO TREM217. Se probaron varias longitudes de duración de la fagocitosis de 1 a 5 h, utilizando una adición escalonada de carga fagocítica (40,000 SH-SY5Ys). La señal resultante aumenta linealmente a 4 h, estancando ligeramente a las 5 h (Figura 5)17. La reducción de la tasa y capacidad de fagocitosis (% de células positivas puntuales) fue evidente en el TREM2 KO en comparación con WT, mientras que el mutante R47H TREM2 no mostró fagocitosis alterada. El defecto fagocítico en las células TREM2 KO no es fenocopiado por la mutación R47H TREM2, aparentemente porque la función TREM2 es suficiente para apoyar la fagocitosis normal.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Figura 3:Datos de ejemplo para el ensayo de fagocitosis de lapso de tiempo de células vivas. Captación de SH-SY5Ys muertos por macrófagos iPSC de tipo salvaje BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) fotografiados a intervalos de 5 minutos durante 3 h. Los tiempos que se muestran en el gráfico son desde el inicio de la fagocitosis, incluidos los primeros 40 minutos sin medición. Se traza el número promedio de manchas por célula de tres pozos replicados. La fagocitosis de 10.000 SH-SY5Ys se inhibe con citochalasina D de 10 μM con 1 h de pretratamiento, mientras que las cantidades más altas de SH-SY5Ys (20.000 y 30.000) tienen una cuantificación subóptima de la fagocitosis. Media ± desviación estándar (DE), N = 1 experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Figura 4: Optimización y validación del ensayo de fagocitosis de alto contenido de células fijas. (A) Imagen representativa de microscopía de alto contenido de SH-SY5Ys fagocitados por macrófagos iPSC de tipo salvaje BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Se muestra un punto de tiempo de 3 h con 40,000 SH-SY5Ys. Los canales de fluorescencia se fusionan, con la tinción de macrófagos iPSC que se muestra como roja, los núcleos como azules y SH-SY5Ys como amarillos. El panel insertado es una sección de la imagen ampliada 3x. (B) El número de manchas por célula de SH-SY5Ys muertos fagocitados después de 5 h, utilizando diferentes cantidades de carga adicionales a los macrófagos iPSC de tipo salvaje. Media ± error estándar de la media (SEM), para N = 3 cosechas. (C) La fagocitosis (3 h) se inhibe con 10 μM de citochalasina D (Cyt), 1 μM de bafilomicina A1 (Baf), 1 μM de jasplaquinolida (con 1 h de pretratamiento; Jas), y 13 μg/ml de anexina V recombinante (añadida simultáneamente a los SH-SY5Y muertos; Ana). Los macrófagos iPSC sin SH-SY5Ys agregados se utilizaron como control negativo (-ve), y el control positivo (+ve) es iPSC-macrófagos no tratados con SH-SY5Ys agregados. Los datos se normalizaron a la media para la repetición del experimento. Medias ± SEM, para N = cosechas 3-6 y con dos líneas celulares de tipo silvestre (SFC840-03-03, la caracterización de esta línea se describe en (Fernandes et al.21 y BIONi010-C). ANOVA de 1 vía con prueba post-hoc de Dunnett, comparaciones con células no tratadas. *p &lt; 0,05, ***p &lt; 0,001. (D) Los SH-SY5Ys recién fijados se tiñen uniformemente para la visualización de fosfatidilserina (anexina V-FITC) y tienen una permeabilidad celular limitada (yoduro de propidio). Los SH-SY5Y vivos no se tiñen para la anexina V-FITC o el yoduro de propidio, excepto para la tinción focal presente en las pocas células muertas en cultivo. Las cifras se reproducen con permiso de Alzheimer's Research &amp; Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Figura 5: La fagocitosis se reduce en TREM2 KO pero no en R47H TREM2 iPSC-macrófagos. Ensayo de fagocitosis de alto contenido realizado con 40,000 SH-SY5Ys por pozo con adiciones escalonadas. Se cuantificaron las medias para los parámetros: número de manchas por célula, suma de áreas puntuales(μm 2) por célula y porcentaje de células que contienen partículas fagocitadas por campo. Los datos se normalizaron para medias para cada genotipo por experimento. Media ± SEM, para N = 3 cosechas. ANOVA de 2 vías de medidas repetidas, la prueba post-hoc de Dunnett, comparaciones por pares con el WT para cada vez: *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001. Las cifras se reproducen con permiso de Alzheimer's Research &amp; Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria S1: Ejemplo de control de calidad para la preparación de SH-SY5Ys. Los SH-SY5Y disociados se fijaron durante 10 min con 0% (células vivas), 1% y 2% de paraformaldehído (PFA), luego se lavaron. Las células se tiñeron con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) e inmediatamente se midieron por citometría de flujo. Se crearon diagramas de puntos de densidad de color en el software de análisis de citometría de flujo, utilizando los controles de una sola mancha y sin teñir para colocar una puerta cuadrante. Los cuadrantes se anotan con el porcentaje de eventos dentro de ese cuadrante. Las células vivas están principalmente en Q4, y las células fijas están principalmente en Q2. Q1 = anexina V-/PI-, Q2 = anexina V+/PI+, Q3 = anexina V+/PI-, Q4 = anexina V-/PI- (células vivas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video complementario: Fagocitosis de lapso de tiempo de células vivas. Video representativo de lapso de tiempo de SH-SY5Ys fagocitado por macrófagos iPSC de tipo salvaje BIONi010-C (ID de ECACC: 66540023). Las imágenes se tomaron cada 5 minutos durante 3 h. El video se recorta y se ejecuta a 3 cuadros por segundo, mostrando las últimas 1.5 h del ensayo. Los SH-SY5Y teñidos con colorante sensible al ácido se muestran en rojo, la intensidad de la señal aumenta con la acidificación del fagosoma. Los núcleos celulares teñidos con Hoechst 33342 se muestran en azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>

Las enfermedades neurodegenerativas se asocian con funciones de microglía desreguladas. Este artículo describe un ensayo in vitro de fagocitosis de células de neuroblastoma por macrófagos iPSC. Las lecturas de microscopía cuantitativa se describen tanto para imágenes de lapso de tiempo de células vivas como para imágenes de alto contenido de células fijas.

Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Este ensayo de imagen in vitro permite cuantificar el efecto de diferentes tratamientos celulares o diferentes genotipos sobre la fagocitosis microglial. Utilizando dos tipos de células que son relevantes para la enfermedad neurodegenerativa, utilizamos células muertas de neuroblastoma para la carga fagocítica, que se preparan de una manera que se puede ampliar de manera fácil y económica mediante grandes pantallas de imágenes de alto contenido. En un gabinete de seguridad biológica de clase 2, disociar SH-SY5Ys aspirando el medio.Agregue 4 ml de tampón de disociación celular y retire el tampón inmediatamente para que quede menos de 1 ml como una película delgada que cubra las células. Incubar durante 2 a 3 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Luego a 10 ml de HBSS al matraz T-75.Y pipetear el SH-SY5Ys en un tubo de centrífuga cónica de 15 ml. Centrifugar a 400xG durante 5 minutos. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 ml de medios tamponados HEPES libres de fenol en rojo, asegurándose de romper los grupos antes de la fijación.Fije las células agregando 2 ml de formaldehído de 4% de potencia al tubo e incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación suave ocasional. Añadir 10 ml de HBSS al tubo. Luego, centrífuga a 1200xG durante 7 minutos.Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 2 ml de fenenol libre de rojo HEPES buffered media. Cuente y elimine 1 millón de células HS-SY5Y en un tubo de baja unión a proteínas de 2 ml. Lleve el volumen total a 300 a 500 microlitros con medios tamponados HEPES libres de fenol rojo.Luego caliente brevemente el tubo en un baño de agua de 37 grados Centígrados. Reconstituya el éster STP de colorante fluorescente rojo sensible al pH de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego agregue 12.5 microgramos de tinte por millón de células SH-SY5Y.Mezclar suavemente moviendo el tubo. E incubar el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos, protegido de la luz. Agregue 1 ml de HBSS y centrífuga a 1200xG durante 7 minutos y 4 grados centígrados.Deseche el sobrenadante. Y lavar con 2 ml de HBSS. Vuelva a suspender el pellet celular en medios macrófagos libres de fenol rojo a una concentración de 0.2 a 1.2 millones de células por ml, de modo que 50 microlitros contengan 10, 000 a 60, 000 células.En un gabinete de seguridad biológica, prepare una solución de colorante reactivo permeante de células fluorescentes de color rojo profundo succinimidil éster reactivo en medios macrófagos. Agregue Hoechst 33342 y caliente la solución de trabajo a 37 grados Celsius en un baño de agua. Aspire el medio macrófago iPSC suavemente, pipeteando el sobrenadante celular con una pipeta multicanal en un depósito estéril.Agregue 70 microlitros por podo de la solución de tinte a los macrófagos iPSC utilizando una pipeta multicanal. Incubar durante 1 hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Reparar tratamientos experimentales en medios macrófagos libres de fenol rojo.Después de la incubación, aspire el medio macrófago iPSC muy suavemente con una pipeta multicanal y agregue 100 microlitros de HBSS por pozo. Retire inmediatamente el HBSS mediante pipeteo suave. Luego agregue 100 microlitros de medios de macrófagos libres de fenol en rojo, además de tratamientos experimentales en pozos separados.Incubar durante 10 minutos a 1 hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Use una pipeta multicanal para agregar 50 microlitros del SH-SY5Ys etiquetado por pozo desde los lados de cada pozo en el borde del líquido. Luego incubar a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 3 a 5 horas.Después de la incubación de la fagocitosis, aspire suavemente los sobrenadantes celulares mediante pipeteo con una pipeta multicanal y descarte. Lavar una vez con 100 microlitros de PBS. Luego fije las células agregando 100 microlitros de formaldehído de potencia al 2% e incubando durante 15 minutos a temperatura ambiente.Aspirar pozos y añadir 100 microlitros de PBS. Proceda directamente a la obtención de imágenes con el microscopio de alto contenido, o cúbralo con sellador de placas y lámina, y guarde la placa a 4 grados centígrados, hasta que sea necesario. Encienda el microscopio de imágenes de alto contenido y abra el software de captura de imágenes.Cargue la placa de ensayo en el microscopio haciendo clic en el icono CARGAR" en la parte superior de la pantalla. Seleccione la pestaña SETUP". En los menús desplegables en el cuadro superior izquierdo, seleccione el tipo de placa apropiado.La opción de enfoque automático: dos picos"El objetivo: 40x Agua, NA 1.1"Modo confocal" y Binning de 1. Enjuague el objetivo 40x Water antes de usarlo a través del menú de configuración. En el cuadro de selección de canales, use el icono más para agregar los canales DAPI, Alexa 647 y Alexa 568.Establezca estos para medir en un solo plano de un micrómetro. Optimice los ajustes de tiempo y potencia para la eficiencia de tinción de la placa de ensayo. Asegúrese de que los canales no se midan simultáneamente, haciendo clic en la secuencia de canales para separar los canales.En Navegación y diseño definido, seleccione los pozos de medición y seleccione de 9 a 12 campos por pozo. Durante la configuración, haga clic en un campo representativo en el mapa de la placa. Y verifique cada canal de medición a su vez para asegurarse de que la tinción esté presente y que las imágenes estén enfocadas ajustando el desplazamiento del canal.Para cargar los datos en un servidor para su análisis remoto, haga clic en el cuadro "trabajos en línea" y el nombre de pantalla correspondiente. Guarde el protocolo de ensayo haciendo clic en el botón "guardar" y haga clic en la pestaña Ejecutar experimento en la parte superior. Nombre la placa del experimento, luego haga clic en inicio"Un ensayo de fagocitosis de vida de tiempo de célula viva mostró que con 10, 000 SH-SY5Ys por pozo, el número de partículas de fagocitasa por célula aumentó linealmente con el tiempo y fue inhibido en aproximadamente un 50% por citochalasina D.Con mayores cantidades de SH-SY5Ys por pozo, la fagocitosis exhibió una linealidad pobre, probablemente debido a una mala segmentación de iPSC, macrófagos y SH-SY5Ys en un campo de visión más concurrido.Los siguientes resultados se obtuvieron mediante la realización de una imagen de alto contenido de células fijas, incluyendo esta imagen representativa de la fagocitosis. El aumento de la cantidad de SH-SY5Ys resultó en un mayor número de partículas fagocitadas por célula. El ensayo de fagocitosis se validó utilizando varios inhibidores de la fagocitosis.La citochalasina D y la jasplaquinolida inhibieron significativamente la fagocitosis en un 91 y 90 por ciento, respectivamente. Y la bafilomicina A1 redujo significativamente la fagocitosis en un 31% cuando se preincuba durante 1 hora antes de la fagocitosis. La adición de anexina 5 recombinante redujo significativamente la fagocitosis en un 30% cuando se agregó a los pozos inmediatamente antes de la adición de SH-SY5Y.Se ha confirmado que SH-SY5Ys expone fosfatidilserina utilizando una sonda fluorescente Annexin 5. Mientras que los SH-SY5Y vivos fueron negativos para la tinción de la anexina 5. Se probaron varias longitudes de duración de la fagocitosis, de 1 a 5 horas, utilizando la adición escalonada de carga fagocítica.La longitud total de esta protollamada se puede acortar preparando la carga fagocítica y teñiendo los macrófagos iPSC en paralelo. Si desea hacer esto, calcule los tiempos con anticipación y use sus incubaciones para preparar soluciones para los pasos futuros.

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Investigación

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