Manejo avanzado del ritmo cardíaco mediante la aplicación de fotoestimulación optogenética multisitio en corazones murinos

La fibrilación y la desfibrilación cardíacas más subyacentes físicas siguen sin entenderse completamente. La optogenética puede ofrecer una forma de obtener más información sobre los fenómenos cardíacos en un entorno bien controlado. La estimulación de la luz local mediante micro LED permite la innovación de áreas específicas de tejido cardíaco.

Esta estimulación dirigida es una nueva herramienta para desarrollar métodos de terapia antiaritmética suaves para el corazón. El protocolo mostrado se puede utilizar para estudiar el comportamiento del corazón durante la arritmia cardíaca y especialmente durante la terminación. En perspectiva, las técnicas desarrolladas se pueden utilizar para estudiar modelos animales grandes clínicamente más relevantes.

Antes de cada experimento, limpie todos los tubos con agua totalmente desmineralizada. Airear las soluciones tiroideas con carbógeno durante 30 minutos a temperatura ambiente y ajustar el pH a 7,3 con hidróxido de sodio y ácido clorhídrico. Caliente el sistema de perfusión a 37 grados centígrados con una bomba de calor de agua.

Mantenga constante la temperatura de perfusión dentro del baño de agua utilizando un elemento calefactor adicional, como un cable calefactor impermeable. Agregue 500 mililitros de cada solución tiroidea al depósito correspondiente y desairee los tubos, así como la trampa de burbujas, pasando la solución tiroidea a través del sistema de perfusión hasta que no se vean más burbujas de aire atrapadas en los tubos o en la trampa de burbujas. Continuar aireando las soluciones tiroideas durante todo el experimento en los reservorios con carbógeno para asegurar que el pH del perfusión permanezca estable más adelante durante la perfusión.

Después de extraer el corazón, realice la preparación fina bajo un microscopio estereoscópico. Coloque la aorta en la aguja roma y fije el vaso con material de sutura. Como control, inyecte una solución tiroidea helada a través de la aguja en el corazón y verifique que el corazón esté bien montado.

Transfiera el corazón montado al sistema de perfusión y asegúrese de que el perfusión fluya para evitar que el aire entre en el corazón mientras conecta la aguja con la trampa de burbujas. Compruebe que el corazón está cubierto con solución tiroidea en el baño de agua y que está latiendo en pocos minutos. Coloque uno de los electrodos de ECG lo más cerca posible de la superficie del corazón para garantizar una buena calidad de señal.

Suspenda el segundo electrodo de ECG en la solución tiroidea, asegurándose de que se esté registrando el ECG. Coloque la matriz de micro LED en el área de interés. Cambie la perfusión a tiroides baja en potasio con penecidle y examine el corazón durante 15 a 30 minutos.

Para inducir arritmia, ilumine el corazón con LED uno y LED dos con un tren de 20 a 50 pulsos de luz con una frecuencia de 25 a 35 hercios, duración del pulso de dos a 15 milisegundos e intensidad de luz de 2.8 milivatios por milímetro cuadrado. Repita el proceso hasta que se induzca la arritmia. Una vez que se detecta visualmente una arritmia sostenida, aplique una ráfaga de pulsos con diferentes anchos y frecuencias utilizando tres, seis o nueve micro LED de la matriz a una corriente pulsante de muelles de 15 miliamperios.

Si la arritmia continúa después de cinco ensayos de desfibrilación basados en matriz de micro LED, clasifique el intento como fallido y comience la desfibrilación de respaldo, utilizando el LED uno y el LED dos con los mismos parámetros de sincronización. Perfundir el corazón con la solución de blebbistatina y esperar hasta que se produzca el desacoplamiento mecánico, lo que se logra cuando el corazón deja de latir, pero una señal de ECG aún es medible. Administre el colorante de voltaje de un mililitro, colorante 4-A-N-B-D-Q-P-Q como un bolo en la trampa de burbujas de la perfusión de Langendorff y espere de cinco a 10 minutos para permitir que el tinte examine el corazón de manera uniforme.

Encienda el LED tres. Enfoca la cámara en la superficie del corazón y aplica 1,27 milivatios por milímetro cuadrado de potencia óptica. Apague las luces del laboratorio y comience a grabar, asegurándose de que se está adquiriendo una señal óptica comparando la frecuencia de la señal obtenida con la frecuencia del ECG grabado.

Se probaron una serie de experimentos con diferentes frecuencias, número de micro LED y duraciones de pulso para 11 ratones, demostrando que pulsos de 1 a 20 milisegundos pueden desfibrilar con diferentes tasas de éxito. Hay un aumento significativo en la tasa de éxito de los nueve LED con duraciones de pulso de un milisegundo y 20 milisegundos a una frecuencia de desfibrilación de 18 y 20 hercios, que está más cerca de la frecuencia de arritmia media analizada de 22.55 de todas las arritmias con un intervalo de error de más o menos cuatro punto cero tres hercios. Aquí se muestran dos intentos diferentes de desfibrilación con una frecuencia de 14 hercios con sus registros de ECG y sus respectivos espectrogramas.

En un ejemplo de desfibrilación con pulsos de 30 milisegundos, la frecuencia dominante de la arritmia aumenta ligeramente hasta que comienza la fotoestimulación. La FV se convierte en una TV donde la frecuencia dominante cae a 14 hercios seguida de una terminación fallida y vuelve al comportamiento arrítmico con una frecuencia dominante de 24 hercios. En el segundo ejemplo, el segmento uno muestra una TV con frecuencia dominante de 23 hercios y sus componentes armónicos hasta que comienza la fotoestimulación, con un ancho de pulso de 20 milisegundos.

El segmento tres muestra una terminación exitosa que conduce a un ritmo sinusal normal con una frecuencia fundamental de 3,5 hercios y los armónicos resultantes. El mapeo óptico con cámaras de alta velocidad mostró un cambio en la intensidad de fluorescencia durante un solo latido del corazón durante un ritmo sinusal normal. La duración de la perfusión debe mantener todas las condiciones para mantener el corazón sano, a saber, la temperatura, el valor del pH y la oxidación deben permanecer constantes.

Es particularmente importante que la solución tiroidea no se vacíe ya que las burbujas de aire en el sistema pueden dañar el corazón. La matriz de micro realidad ofrece una gran flexibilidad. Puede apuntar a diferentes ubicaciones del corazón o incluso combinar múltiples matrices en un experimento para terminar correctamente la arritmia.