Name: Cortes pulmonares de corte de precisión como herramienta eficiente para estudios ex vivo de estructura de vasos pulmonares y contractilidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprende a preparar cortes pulmonares de precisión en modelo murino para estudiar la estructura vascular y la contractilidad en tiempo real. Este método ex vivo permite análisis de imagen, ensayos funcionales y extracción de ARN y proteínas.

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Los autores desean agradecer a los doctores Yuan Hao y Kaifeng Liu por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por un NIH 1R01 HL150106-01A1, la Beca Parker B. Francis y el Premio de Investigación Aldrighetti de la Asociación de Hipertensión Pulmonar al Dr. Ke Yuan.

Todo el cuidado de los animales estaba de acuerdo con las pautas del Boston Children's Hospital y los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Los ratones utilizados en este estudio son ratones salvajes tipo C57/B6 y ratones cruzados Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.
1. Preparación de soluciones
<ol><li>Prepare la solución tampón de fosfato (1x PBS) y la solución de agarosa al 2% requerida durante el experimento con anticipación.<ol>
<li>Mezcle 2 g de polvo de agarosa en 100 ml de agua en autoclave. Calentar en el microondas unos segundos a la vez hasta que la solución esté clara.</li>
		<li>Coloque la solución en un baño de agua a 42 °C hasta su uso. NOTA: Tanto el PBS como la agarosa al 2% se pueden almacenar a temperatura ambiente durante semanas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extracción del pulmón del ratón
<ol><li>Eutanasia al ratón por sobredosis de isoflurano. Lograr la sobredosis de isoflurano colocando una pequeña cantidad de isoflurano sobre papel tisú en el nivel inferior y colocando el ratón en el nivel superior en un desecador. El ratón permanece en el desecador hasta quedar inconsciente.</li>
	<li>Asegure la muerte del ratón aplicando una presión inferior en el cuello y tirando de la caudal en la cola. Lleve el ratón a la superficie de disección.</li>
	<li>Coloque el ratón en posición supina y asegúrelo en su lugar pegando las patas y la nariz a la mesa con cinta adhesiva.</li>
	<li>Rocíe la superficie ventral del ratón con etanol al 70% y limpie el exceso de etanol.</li>
	<li>Levante la piel abdominal del ratón con pórceps en la ubicación de la vejiga y corte en la línea media con tijeras quirúrgicas, moviéndose superiormente a la región cervical, exponiendo la tráquea.</li>
	<li>Levante la capa fascial subyacente con pinzas y corte con tijeras quirúrgicas para exponer los órganos viscerales y el compartimiento mediastínico, nuevamente cortando inferiormente a superior.</li>
	<li>Corte el esternón en la línea media para exponer el corazón y el pulmón.</li>
	<li>Usando disección contundente, separe el diafragma del hígado y el compartimiento abdominal.</li>
	<li>Localice la vena cava inferior (IVC) debajo de los intestinos y corte la IVC.</li>
	<li>Localice el ventrículo derecho. NOTA: El ventrículo derecho tendrá un aspecto más ligero en comparación con el ventrículo izquierdo y se debe visualizar el tabique intraventricular, separando el ventrículo derecho del ventrículo izquierdo.</li>
	<li>Inyecte 0,5 ml de heparina fraccionada al 1% en el ventrículo derecho con una aguja de mariposa de 25-30 G y luego enjuague lenta pero constantemente con 10-15 ml de 1x PBS(Figura 1A).<ol>
<li>Tenga cuidado de no insertar la aguja a través del corazón e inyectar heparina en la cavidad mediastínica. NOTA: La inyección de 1x PBS vuelve el tejido pulmonar blanco. El líquido que extravasa de la aorta abdominal debe ser claro e incoloro y el hígado puede volverse blanco en apariencia después de un enrojecimiento exitoso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Localice la laringe y diseccione la fascia y el tejido circundantes con pinzas de punta roma.</li>
	<li>Coloque la sutura quirúrgica debajo de la tráquea y ate libremente un nudo quirúrgico.</li>
	<li>Coloque un pequeño orificio en la tráquea superior a la cuerda y canula con una aguja roma de 20 G.</li>
	<li>Apriete la sutura alrededor de la aguja y la tráquea con un nudo quirúrgico.</li>
	<li>Inyecte 2.5-4 ml de agarosa en la tráquea y controle la inflación del pulmón.</li>
	<li>Después de inculcar la agarosa, vierta 1x PBS frío y frío sobre el pulmón para solidificar la agarosa.</li>
	<li>Cortar la tráquea superior a la sutura quirúrgica y diseccionar el pulmón y el corazón del mediastino mediante la eliminación de las adherencias y la fascia.</li>
	<li>Después de la solidificación, coloque 1x DMEM (suficiente para sumergir el tejido) en una placa de Petri para mantenerse en hielo. Corte inmediatamente un lóbulo usando una máquina vibratome (Figura 1B).</li>
</ol>3. Cortes de pulmón cortados con precisión
<ol><li>Conecte la muestra a la plataforma con superpegamento, manteniendo el lado medial de la muestra hacia arriba.</li>
	<li>Llene el recipiente de la muestra con 1x PBS, asegurándose de que la muestra esté completamente sumergida.</li>
	<li>Llene el recipiente que rodea el recipiente de muestra con hielo para mantener el PBS circundante y la muestra fría.</li>
	<li>Encienda el vibratome y ajuste a la configuración deseada a continuación.<ol>
<li>Establezca el grosor en 300um.</li>
		<li>Ajuste la frecuencia a 100 Hz.</li>
		<li>Ajuste la amplitud a 0,6 mm.</li>
		<li>Ajuste la velocidad a 5 μm/s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Con una llave Allen, gire el soporte de la cuchilla en la posición segura y abra las mandíbulas para insertar una cuchilla.</li>
	<li>Apriete las mandíbulas con una llave Allen y gire el soporte de la cuchilla en la posición adecuada para cortar.</li>
	<li>Coloque la muestra y la plataforma en la caja y deslícese frente a la cuchilla.</li>
	<li>Llene la caja alrededor de la plataforma de muestra con 1x PBS hasta que la muestra esté sumergida.</li>
	<li>Lleve la cuchilla del vibratomo hasta el borde del bloque y baje manualmente la cuchilla hasta que esté uniforme con la parte superior de la muestra.</li>
	<li>Confirme la configuración adecuada y ejecute el vibratomo (Figura 2).</li>
	<li>A medida que se cortan las rodajas frescas, retire las muestras del PBS y colóquelas en una placa de Petri estéril con 10 ml de 1x DMEM que contenga 1x antibiótico-antimicótico.</li>
	<li>Cuando termine, retraiga la cuchilla por completo y luego use la llave Allen para elevar la cuchilla a una posición segura.</li>
	<li>Almacene las muestras en 1x DMEM en una incubadora a 37 °C con viabilidad conservada durante un hasta 10 días (consulte el experimento de viabilidad a continuación).</li>
</ol>4. Ejemplo de experimento vasoconstrictor
<ol><li>Coloque una rebanada de vibratomo en un portaobjetos de microscopio.</li>
	<li>Antes de colocarlo en el portaobjetos, use una toallita de limpieza para deshacerse del exceso de medio (PBS).</li>
	<li>Coloque la muestra bajo microscopía de contraste de fase y use un aumento de 10-20x para identificar un vaso.</li>
	<li>Coloque 500 μL de vasoconstrictores, como 60 mM KCl o 1 μM Endothelin-1 para sumergir completamente el portaobjetos.</li>
	<li>Observe y capture el video grabando durante 30 s-60 s (Video 1).</li>
</ol>5. Preparación del tejido para la lisis de ARN o proteínas en PCLS
<ol><li>Antes de comenzar el experimento, llene una pequeña caja de espuma de poliestireno con 1 L de nitrógeno líquido.</li>
	<li>Coloque dos tubos pequeños de microcentrífuga (1,5 ml) en el recipiente con nitrógeno líquido antes de comenzar. NOTA: El nitrógeno líquido debe enfriarse fuera de los tubos, sin embargo, no debe estar dentro. Asegúrese de manejar el nitrógeno líquido con cuidado y no exponga la piel al nitrógeno líquido. Use forrceps y guantes para colocar y quitar los tubos de la caja.</li>
	<li>Coloque 4-5 rodajas frescas de vibratomo en un tazón de mortero.</li>
	<li>Vierta 5-10 ml de N2 líquido sobre las rebanadas en el tazón de mortero.</li>
	<li>Use rápidamente el mortero para moler las rodajas de congelación flash en polvo antes de que el nitrógeno líquido se evapore. NOTA: El tejido debe condensarse en un polvo fino. De lo contrario, agregue nitrógeno líquido adicional hasta que se logre.</li>
	<li>Usando una cuchara de laboratorio de acero (preenfriada con nitrógeno líquido), cuchara el polvo en los dos tubos de microcentrífuga refrigerados.</li>
	<li>Lise el polvo agregando 500 μL de reactivo de extracción de ARN para proceder con el aislamiento de ARN o 500 μL de tampón RIPA (contiene 1x inhibidores de la proteasa) para proceder con la lisis de proteínas.</li>
	<li>Almacene las muestras a -80 °C hasta el aislamiento adicional de ARN, la medición de BCA y el western blot.</li>
</ol>6. Determinación de la viabilidad
<ol><li>Después de la preparación del vibratomo, coloque dos rodajas de pulmón en una placa de cultivo de 24 pozos con 450 μL de medios DMEM y 50 μL de reactivo de viabilidad celular (asegúrese de que el tejido esté sumergido por completo).</li>
	<li>Vuelva a colocar las muestras en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante la noche con una exposición mínima a la luz.</li>
	<li>Por la mañana, observe la solución para el cambio de color. La solución azul se vuelve rosa cuando el tejido es viable.</li>
</ol>7. Conservación del etiquetado celular
<ol><li>Tratar un Cdh5-CreERT2 transgénico cruzado con ratón Ai14 tdTomato con una inyección IP de Tamoxifeno (2 mg/día) durante un total de 5 días (dosis total 10 mg Tamoxifeno) para inducir tdTomato etiqueta células Cre positivas.</li>
	<li>Una semana después de la inyección, prepare los pulmones usando los pasos anteriores 1 a 3.</li>
	<li>Después de la preparación de la rodaja de pulmón cortada con precisión, coloque el tejido en un portaobjetos de microscopio y coloque una funda en la parte superior del tejido.</li>
	<li>Utilice un microscopio confocal para detectar la tinción de tdTomato (utilizando la longitud de onda de excitación de 555 nm).</li>
</ol>

<ol><li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Gerontology+%26+Geriatrics%22%5BJournal%5D)">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li>
<li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+%283D-LTCs%29+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437(2019).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480(2020).</li>
<li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li>
<li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lung+slices%3A+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li>
<li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li>
<li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li>
<li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Xenobiotica%22%5BJournal%5D)">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li>
<li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li>
<li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902(2019).</li>
<li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698(2011).</li>
<li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT%2C+ACH%2C+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li>
<li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128(2014).</li>
<li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventitial+dissection%3A+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Interactive+Cardiovascular+and+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li>
<li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), Bethesda, Md. 1119-1124 (2005).</li>
<li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li>
<li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis & Rheumatology. 72 (3), Hoboken, N.J. 477-487 (2020).</li>
<li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+Ca2%2B+sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+function+and+endothelin-1%3A+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), Bethesda, Md. 354-360 (2017).</li>
<li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li>
<li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2%2B+from+intracellular+stores%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, Dallas, Tex. 222-227 (1997).</li>
<li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

En este manuscrito se describe un método mejorado para producir imágenes de alta resolución del tejido pulmonar murino que preserva la estructura vascular y optimiza la flexibilidad experimental, utilizando específicamente la aplicación de PCLS para obtener microslices de tejido pulmonar que se pueden ver en tres dimensiones con contractilidad preservada de la vasculatura. Utilizando el reactivo de viabilidad, el protocolo demuestra que las rodajas cuidadosamente preparadas y conservadas pueden conservar la viabilidad du...

Los avances en la preparación e imagen del tejido pulmonar que preserva los componentes celulares sin sacrificar la estructura anatómica proporcionan una comprensión detallada de las enfermedades pulmonares. La capacidad de identificar proteínas, ARN y otros compuestos biológicos mientras se mantiene la estructura fisiológica ofrece información vital sobre la disposición espacial de las células que puede ampliar la comprensión de la fisiopatología en numerosas enfermedades pulmonares. Estas imágenes detalladas pueden conducir a una mejor comprensión de las enfermedades vasculares pulmonares, como la hipertensión arterial pulmonar, cuando se aplican a modelos animales, lo que potencialmente conduce a mejores estrategias terapéuticas.
A pesar de los avances en la tecnología, la obtención de imágenes de alta calidad del tejido pulmonar murino sigue siendo un desafío. El ciclo respiratorio es impulsado por una presión intratorácica negativa generada durante la inhalación1. Cuando tradicionalmente se obtienen biopsias y se preparan muestras de pulmón para la obtención de imágenes, el gradiente de presión negativa se pierde, lo que resulta en el colapso de la vía aérea y la vasculatura, que ya no se representa en su estado actual. Para lograr imágenes realistas que reflejen las condiciones actuales, las vías respiratorias pulmonares deben volver a inflarse y la vasculatura perfundirse, cambiando el pulmón dinámico en un accesorio estático. La aplicación de estas técnicas distintas permite la preservación de la integridad estructural, la vasculatura pulmonar y los componentes celulares, incluidas las células inmunes como los macrófagos, lo que permite que el tejido pulmonar se vea lo más cerca posible de su estado fisiológico.
El corte pulmonar de precisión (PCLS) es una herramienta ideal para estudiar la anatomía y fisiología de la vasculatura pulmonar2. PCLS proporciona imágenes detalladas del tejido pulmonar en tres dimensiones al tiempo que preserva los componentes estructurales y celulares. PCLS se ha utilizado en modelos animales y humanos para permitir imágenes vivas y de alta resolución de las funciones celulares en tres dimensiones, lo que lo convierte en una herramienta ideal para estudiar posibles objetivos terapéuticos, medir la contracción de las vías respiratorias pequeñas y estudiar la fisiopatología de enfermedades pulmonares crónicas como la EPOC, la EPI y el cáncer de pulmón3. Utilizando técnicas similares, la exposición de muestras de PCLS a vasoconstrictores puede preservar la estructura pulmonar y la contractilidad de los vasos, replicando las condiciones in vitro. Además de preservar la contractilidad, las muestras preparadas pueden someterse a análisis adicionales, como la secuenciación de ARN, Western blot y citometría de flujo cuando se preparan correctamente. Finalmente, las células marcadas con tdTomato marcadas con fluorescencia de tdTomato después de la cosecha pulmonar pueden preservar el etiquetado después de preparar microslices, lo que lo hace ideal para estudios de seguimiento celular. La integración de estas técnicas proporciona un modelo sofisticado que preserva la disposición espacial de las células y la contractilidad de los vasos que puede conducir a una comprensión más detallada de las cascadas de señalización y las posibles opciones terapéuticas en la enfermedad de la vasculatura pulmonar.
En este manuscrito, el tejido pulmonar murino PCLS se expone a vasoconstrictores, lo que demuestra la integridad estructural preservada y la contractilidad de los vasos. El estudio demuestra que el tejido preparado y manipulado adecuadamente puede permanecer viable durante 10 días. El estudio también demuestra la preservación de células con fluorescencia endógena (tdTomato), lo que permite a las muestras proporcionar imágenes de alta resolución de la vasculatura pulmonar y la arquitectura. Finalmente, se han descrito formas de manejar y preparar rodajas de tejido para la medición de ARN y Western blot para investigar los mecanismos subyacentes.

<table><tbody><tr><td>0,5 cc de heparina fraccionada en jeringa</td><td>BD</td><td>100 unidades USP por mL</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de punta roma de calibre 20 1/2 pulgadas para canulación de tráquea</td><td>Cml Supply</td><td>90120050D</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 30cc</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Anti Anti solución</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo de cuchilla vibratoria automatizada</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de viabilidad celular (alamarBlue)</td><td>Thermofisher</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Confocal</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium y GLutaMAX, suplementados con 10% FBS, 1% Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Endothelina-1</td><td>Sigma</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Mortero</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RIPA tampón de lisis y extracción</td><td>Thermoscientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Sutura quirúrgica 6/0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reactivo</td><td>Invitrogen, Thermofisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Juego de extracción de sangre con alas (aguja de mariposa) 25-30G</td><td>BD</td><td>25-30G</td><td></td></tr></tbody></table>

cortes pulmonares de corte de precisión como herramienta eficiente para estudios ex vivo de estructura de vasos pulmonares y contractilidad

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

La visualización del tejido pulmonar murino proporciona información estructural y celular valiosa sobre la vía aérea subyacente y la vasculatura. Sin embargo, la preservación de los vasos pulmonares que realmente representa las condiciones fisiológicas todavía presenta desafíos. Además, la delicada configuración de los pulmones murinos resulta en desafíos técnicos al preparar muestras para imágenes de alta calidad que preservan tanto la composición celular como la arquitectura. Del mismo modo, se pueden realizar ensayos de contractilidad celular para estudiar el potencial de las células para responder a los vasoconstrictores in vitro,pero estos ensayos no reproducen el entorno complejo del pulmón intacto. En contraste con estos problemas técnicos, el método de corte pulmonar cortado con precisión (PCLS) se puede aplicar como una alternativa eficiente para visualizar el tejido pulmonar en tres dimensiones sin sesgo regional y servir como un modelo de contractilidad sustituto vivo durante hasta 10 días. El tejido preparado mediante PCLS ha conservado la estructura y la orientación espacial, por lo que es ideal para estudiar los procesos de la enfermedad ex vivo. La ubicación de las células endógenas tdTomato-labeladas en PCLS cosechadas de un modelo murino inducible tdTomato reporter se puede visualizar con éxito mediante microscopía confocal. Después de la exposición a vasoconstrictores, PCLS demuestra la preservación tanto de la contractilidad de los vasos como de la estructura pulmonar, que puede ser capturada por un módulo de lapso de tiempo. En combinación con los otros procedimientos, como el análisis de western blot y ARN, PCLS puede contribuir a la comprensión integral de las cascadas de señalización que subyacen a una amplia variedad de trastornos y conducir a una mejor comprensión de la fisiopatología en las enfermedades vasculares pulmonares.

Cuando se agrega a las células o tejidos, el reactivo de viabilidad se modifica por el entorno reductor del tejido viable y se vuelve rosa / rojo, volviéndose altamente fluorescente. Los cambios de color representativos detectados desde el día 0-1 y el día 9-10 se demuestran en la Figura 3. Como se señaló, la solución comenzó de color azul y se volvió rosa durante la noche, demostrando viabilidad. El cambio de color generalmente ocurre dentro de 1-4 h; sin embargo, puede ser necesario un tie...

Aquí se presenta un protocolo para preservar la contractilidad vascular del tejido pulmonar murino PCLS, lo que resulta en una imagen tridimensional sofisticada de la vasculatura pulmonar y las vías respiratorias, que se puede preservar hasta por 10 días que es susceptible a numerosos procedimientos.

Cortes pulmonares de corte de precisión como herramienta eficiente para estudios ex vivo de estructura de vasos pulmonares y contractilidad

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

El método de corte pulmonar de precisión preservará la estructura y las orientaciones espaciales en tres dimensiones sin sesgo regional y puede servir como un modelo sustituto vivo para las mediciones de contractilidad de los vasos y las vías respiratorias. En combinación con imágenes de lapso de tiempo, Western blot y análisis de ARN, las rodajas pulmonares cortadas con precisión contribuyen a la comprensión integral de las cascadas de señalización que subyacen a una amplia variedad de trastornos y conducen a una mejor comprensión de la fisiopatología en las enfermedades vasculares pulmonares. Para comenzar, coloque el ratón adulto sacrificado en posición supina y asegúrelo en su lugar pegando las patas y la nariz a la mesa con cinta adhesiva.Rocíe la superficie ventral del ratón con 70% de etanol. Use forrceps para levantar la piel abdominal del ratón en la ubicación de la vejiga y tijeras quirúrgicas para cortar en la línea media, moviéndose superiormente a la región cervical para exponer la tráquea. Luego use pinzas para levantar la capa de fascia subyacente y use tijeras quirúrgicas para exponer los órganos viscerales y el compartimiento mediastínico, nuevamente cortando de manera inferior a superior.Corte el esternón en la línea media para exponer el corazón y el pulmón. Diseccionar el diafragma cuidadosamente desde el hígado y el compartimiento abdominal. Localice la vena cava inferior debajo de los intestinos y córtela.Después de localizar el ventrículo derecho, use una aguja de mariposa de calibre 25 a 30 para inyectar 0.5 mililitros de heparina fraccionada al 1% en el ventrículo derecho y enjuáguelo lenta pero constantemente con 10 a 15 milímetros de PBS. Después de localizar la laringe, use pinzas de punta roma para diseccionar la fascia y el tejido circundantes, luego coloque la sutura quirúrgica debajo de la tráquea y ate libremente un nudo quirúrgico. Coloque un pequeño orificio en la tráquea superior a la cuerda y cannulate con una aguja roma de calibre 20.Apriete la sutura alrededor de la aguja y la tráquea con un nudo quirúrgico. Luego inyecte de 2.5 a 4 mililitros de agarosa en la tráquea y controle la inflación del pulmón. Después de la inyección de agarosa, vierta PBS frío sobre el pulmón para solidificar la agarosa.Luego corte la tráquea superior a la sutura quirúrgica y diseccione el pulmón y el corazón del mediastino eliminando cualquier adherencia y fascia. Después de la solidificación, coloque el tejido en DMEM en una placa de Petri sobre hielo e inmediatamente proceda a cortar un lóbulo con una máquina de vibratomo. Para preparar las rodajas pulmonares, conecte la muestra a la plataforma con superpegamento, manteniendo el lado medial hacia arriba.A continuación, llene el recipiente de muestra con PBS. Llene el recipiente con hielo para mantener el PBS circundante y la muestra fría. Encienda el vibratomo.Ajuste el grosor a 300 micrómetros, la frecuencia a 100 hercios, la amplitud a 0,6 milímetros y la velocidad a cinco micrómetros por segundo. Con una llave Allen, gire el soporte de la cuchilla en la posición segura y abra las mandíbulas para insertar una cuchilla. Luego apriete las mandíbulas con una llave Allen.Coloque la muestra en la caja, asegurándose de que esté sumergida en PBS. Deslice la caja hacia arriba en la posición correcta y asegúrese de que sea segura. Gire el soporte de la cuchilla en la posición adecuada para cortar.Lleve la cuchilla del vibratomo hasta el borde del bloque y baje manualmente la cuchilla hasta que esté uniforme con la parte superior de la muestra. Confirme la configuración y ejecute el vibratome. Después de cortar las rodajas frescas, retire las muestras del PBS y colóquelas en una placa de Petri estéril con 10 mililitros de DMEM que contengan un antibiótico antimicótico de una sola vez.Después de colocar todas las rodajas en una placa de Petri, retraiga la cuchilla por completo y use la llave Allen para elevar la cuchilla a una posición segura. Almacene las muestras en DMEM a 37 grados centígrados. Y coloque una rebanada de vibratomo en un portaobjetos de microscopio.Use una toallita de limpieza para eliminar el exceso de medio. Coloque la muestra en la microscopía de contraste de fase y use un aumento de 10 a 20X para identificar un vaso. Luego agregue 500 microlitros de vasoconstrictores, como cloruro de potasio 60 milimolar o una endotelina-1 micromolar para sumergir completamente el portaobjetos.Observe y capture el video grabando durante 30 a 60 segundos. Antes de comenzar el experimento, llene una pequeña caja de espuma de poliestireno con un litro de nitrógeno líquido y coloque dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros en el recipiente con nitrógeno líquido. Coloque de cuatro a cinco rodajas frescas de vibratomo en un tazón de mortero.Vierta de 5 a 10 mililitros de nitrógeno líquido sobre las rodajas y use rápidamente el mortero para moler las rodajas en polvo antes de que el nitrógeno líquido se evapore. Use una cuchara de laboratorio de acero preenfriada para recoger el polvo en los dos tubos de microcentrífuga refrigerados y lisar el polvo agregando 500 microlitros de reactivo de extracción de ARN para el aislamiento de ARN o 500 microlitros de tampón RIPA para la lisis de proteínas. En el experimento de viabilidad representativa, se detectó el cambio de color de las rodajas PCLS del día cero al uno y del día nueve al 10.La solución fue inicialmente azul y se volvió rosa de la noche a la mañana, demostrando viabilidad. El cambio de color generalmente ocurre dentro de una a cuatro horas, pero puede ser necesario un tiempo más largo. La diferencia diaria entre la absorbancia a longitudes de onda de 562 y 613 nanómetros para el tejido preparado con vibratomo se muestra aquí.La constricción de la vasculatura en un tejido pulmonar preparado con vibratomo utilizando endotelina-1 y cloruro de potasio se puede visualizar aquí. La preservación del etiquetado de tdTomato en las células una semana después de la inyección de tamoxifeno se demuestra en estas rodajas pulmonares. Es muy importante realizar bien el paso de limpieza e inflado pulmonar para eliminar toda la sangre de la circulación antes de experimentos adicionales e imágenes.Además de las enfermedades vasculares, el PCLS se puede aplicar para estudiar la fisobiología de las enfermedades relacionadas con las vías respiratorias, y se puede probar más a fondo en tejidos pulmonares humanos en escenarios clínicamente relevantes.

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Cultivo de explantes de tejido tumoral de pulmón: un procedimiento para generar y cultivar cortes de tumores de pulmón cortados con precisión

En este video, describimos un procedimiento para inflar pulmones humanos aislados con agarosa y preparar cortes de pulmón humanos cortados con precisión. Los cortes de pulmón ex vivo preparados se pueden utilizar para otros experimentos inmunológicos.

Preparación a base de agarosa de cortes de pulmón humanos cortados con precisión

La vasoconstricción pulmonar hipóxica (HPV) es un fenómeno fisiológico importante por el cual en la perfusión alveolar del pulmón de la hipoxia es emparejada a la ventilación. El segmento vascular principal que contribuye al HPV es la arteria intra-acinar. Aquí, describimos nuestro protocolo para el análisis del VPH de vasos pulmonares murinos con diámetros de 20-100 μm.

Análisis Videomorfométrico De La Vasoconstricción Pulmonar Hipóxica De Las Arterias Intrapulmonares Usando Cortes Murinos De Precisión Pulmonar Slices

Se describe un método para generar la precisión de corte de pulmón rebanadas (PCLS) y la inmunotinción ellos para visualizar la localización de diversos tipos de células inmunes en el pulmón. Nuestro protocolo se puede extender a visualizar la ubicación y la función de muchos tipos celulares diferentes bajo una variedad de condiciones.

Precisión de corte pulmón de ratón Rebanadas para visualizar las células en vivo pulmonar dendríticas

Teniendo en cuenta el principio 3R, están evolucionando los modelos respiratorios como alternativas a los estudios en animales. Especialmente para la evaluación del riesgo de las sustancias respiratorias, existe una falta de ensayos adecuados. Aquí, describimos el uso de cortes de pulmón humano de precisión de corte para la evaluación de sustancias aerotransportadas.

Evaluación de la citotóxica y efectos inmunomoduladores de sustancias en lonchas de pulmón humano de precisión de corte

Este protocolo proporciona un método simple y confiable para la producción de rodajas de hígado de piedra de precisión viables de ratones. Las muestras de tejido ex vivo se pueden mantener bajo condiciones de cultivo de tejido de laboratorio durante varios días, proporcionando un modelo flexible para examinar la patobiología hepática.

Rebanadas de hígado cortadas con precisión de la murino como modelo Ex Vivo de biología hepática

Este protocolo describe un método para generar tejidos pulmonares reproducibles y diseñados a pequeña escala, mediante la repoblación de rodajas pulmonares descelularizadas cortadas con precisión con células epiteliales alveolares tipo 2, fibroblastos y células endoteliales.

Tejidos pulmonares diseñados preparados a partir de rodajas pulmonares descelularizadas

El presente protocolo describe la preparación y utilización de cortes pulmonares cortados con precisión en ratones para evaluar la contractilidad del músculo liso arterial intrapulmonar y de las vías respiratorias en un entorno casi in vivo .

Utilizando la rebanada pulmonar cortada con precisión para estudiar la regulación contráctil de las vías respiratorias y el músculo liso arterial intrapulmonar

Hemos desarrollado una técnica de procesamiento tisular que utiliza un vibratomo y tejido pulmonar incluido en agarosa para generar secciones pulmonares, lo que permite la adquisición de imágenes de alta resolución de la arquitectura pulmonar. Empleamos la tinción de inmunofluorescencia para observar la expresión espacial de proteínas utilizando marcadores estructurales pulmonares específicos.

Seccionamiento automatizado de vibratomo de tejido pulmonar incluido en agarosa para obtener imágenes de fluorescencia multiplex

Aquí, describimos un protocolo simple y económico para realizar una cuantificación no sesgada de la densidad microvascular pulmonar para tejido pulmonar de ratones enteros utilizando la tinción única de Isolectin B4.

Cuantificación de la densidad microvascular pulmonar en ratones a través de los lóbulos

Aprende a preparar cortes pulmonares de precisión en modelo murino para estudiar la estructura vascular y la contractilidad en tiempo real. Este método ex vivo permite análisis de imagen, ensayos funcionales y extracción de ARN y proteínas.

Cortes pulmonares de corte de precisión como herramienta eficiente para estudios ex vivo de estructura de vasos pulmonares y contractilidad (Video) | JoVE Journal

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