Perlas cargando proteínas y ácidos nucleicos en células humanas adherentes

La carga de perlas es un ensayo económico para cargar partículas impermeables de membrana en células adherentes vivas. Este protocolo ha demostrado ser extremadamente útil para cargar sondas para experimentos de microscopía de una sola célula o una sola molécula o de fluorescencia. La carga de perlas permite a los investigadores cargar rápidamente todo tipo de moléculas, incluidas proteínas, ADN, ARN, partículas sintéticas o una combinación de estas simultáneamente en células individuales.

Al realizar por primera vez la carga de perlas, es importante probar la fuerza de golpeteo. Las líneas celulares responden de manera diferente a la carga de cuentas. Y así, el número y la fuerza de los grifos se pueden modificar para una carga celular óptima al tiempo que se minimiza el pelado de la celda.

Para demostrar el procedimiento, Matthew Saxton y yo nos acompañaremos nuestros colegas, la Dra. Amanda Cook y Gabriel Galindo. Comience midiendo aproximadamente cinco mililitros de cuentas de vidrio en un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue 25 mililitros de hidróxido de sodio molar al tubo y mezcle suavemente durante dos horas con un agitador o un rotor.

Gire el tubo de cuentas brevemente en una centrífuga si las cuentas están en suspensión, luego decante el hidróxido de sodio mientras retiene tantas cuentas como sea posible. Lave bien las perlas con agua de grado de cultivo celular hasta que el pH sea neutro y decante el agua cada vez. Use la tira reactiva de pH en el efluente para confirmar un pH neutro, luego lave bien las perlas con etanol al 100%, dos o tres veces.

Decantando el etanol cada vez. Seque las cuentas y espolvoree para formar una capa delgada dentro de un recipiente estéril. Luego deje el recipiente abierto dentro de un gabinete de bioseguridad para secar al aire las cuentas durante la noche.

Golpee o agite suavemente el recipiente y verifique que las cuentas tengan una textura arenosa sin aglutinarse ni descamarse para asegurarse de que las cuentas estén completamente secas. Agregue las perlas al aparato y cubra toda la abertura de la cámara de retención de cuentas utilizando una malla de polipropileno o material equivalente con aberturas de 105 micrómetros para permitir el paso de las perlas. Sujete la malla entre los extremos masculino y femenino de una cámara de imágenes reutilizable de metal, luego séllela herméticamente con la película cerosa y esterilice el aparato por UV durante 15 minutos.

El aparato cargador de cuentas ahora se puede utilizar para realizar cientos de ensayos de carga. Guarde el aparato en un recipiente seco desecado por gel de sílice u otro medio desecante y selle. Si las perlas se vierten completamente secas y esterilizan el cargador de cuentas y reemplácelo con perlas frescas, como se demostró anteriormente.

Retire el medio de las celdas y aspire suavemente todo el medio alrededor de los bordes de la cámara. Luego incline la cámara en un ángulo de aproximadamente 45 grados y retire la gota restante de medios en el micro pozo central. Pipete la solución de carga de perlas suavemente sobre el micro pozo de vidrio presente en el centro de la cámara.

Use el aparato de carga de cuentas para dispersar suavemente una monocapa de cuentas de vidrio en la parte superior de las celdas. Asegúrese de que las cuentas cubran las celdas por completo. Pellizque la cámara con dos dedos, levántela alrededor de dos pulgadas y llévala hacia abajo firmemente usando una fuerza aproximadamente equivalente a dejar caer el plato desde esa altura, agregue suavemente el medio de nuevo a la cámara mediante pipeteos lentamente en el lado de plástico de la cámara.

Aspire cualquier perla flotante sin perturbar las celdas, todo el procedimiento de carga de cuentas debe realizarse con relativa rapidez. Así que las células no se secan cuando están sin medio. Luego incube las células de 4.5 a dos horas en la incubadora.

Antes de obtener imágenes, lave las células tres veces con el medio para eliminar las perlas y el exceso de componentes de carga en la solución de carga. Imagine las celdas inmediatamente o cuando lo requiera el experimento utilizando las instrucciones en el manuscrito de texto. Las células que se cargaron con éxito, casi siempre tenían Cy3-Pa57 y A488-H3K11ac etiquetadas las proteínas juntas.

Un microgramo de ADN plásmido y GFP codificante y 0,5 microgramos de proteína etiquetada con Cy3 también se introdujeron en las células a través de la carga de perlas expresada y visualizada. El 40% de las células estaban cargadas con proteína fab y el 21% de las células cargadas con perlas expresan el plásmido cargado con núcleo. Las células cargadas de perlas expresaron diferentes niveles de plásmido.

El resultado de esa prueba de relación de Fisher mostró que aunque las proteínas uno y dos tenían distribuciones de intensidad similares, cada proteína tenía una distribución significativamente menor que el plásmido. Los niveles de proteínas cargadas de perlas tenían poca varianza de célula a célula y los niveles de dos proteínas cargadas simultáneamente estaban altamente correlacionados entre sí. La carga adecuada de perlas casi no tuvo un efecto notable en el número de células humanas U2OS o su morfología cuando se toman imágenes directamente antes, directamente después y 24 horas después de la carga de cuentas.

La mala carga de cuentas con cuentas excesivas y fuerza de golpeteo causó pérdida celular, morfología celular deficiente y grupos de cuentas que permanecieron en el vidrio de la cubierta. a pesar de que se cree que las células sufren daños mecánicos durante la carga de perlas, las células crecieron y proliferaron en la cámara correctamente cargada de cuentas. También se observó que las células cargadas de perlas, se someten a división celular.

RPE1 y una línea celular HeLa fueron cargadas con fab para demostrar la versatilidad de la técnica de carga de perlas. Las células U2OS también se cargaron con un Cy5-RNA 9-mer y Cy3-DNA 28-mer juntos. Al intentar este protocolo, asegúrese de agregar solo una monocapa de cuentas a las células, ya que demasiadas cuentas hacen que las células se desprendan.

Por lo tanto, después de una breve recuperación de 30 minutos, las células de carga de perlas están listas para la obtención de imágenes, ya sea inmediatamente u horas o días después, si el procedimiento requiere pasos adicionales, como la tinción, que también se pueden hacer después del período de recuperación.