Name: Captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprende a identificar y cuantificar residuos de cisteína oxidada en proteínas mediante captura asistida por resina, etiquetado isobárico y espectrometría de masas. Este método proporciona datos específicos de sitio para estudiar biología redox.

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Partes del trabajo fueron apoyadas por las subvenciones de los NIH R01 DK122160, R01 HL139335 y U24 DK112349

Todos los procedimientos descritos en el protocolo relacionados con muestras/tejidos animales o humanos fueron aprobados y siguieron las directrices institucionales del comité de ética de investigación humana y animal.
1. Homogeneización/lisis de la muestra
<ol><li>Muestras de tejido congelado<ol><li>Picar tejido congelado (~ 30 mg) en un portaobjetos de microscopio de vidrio sobre hielo seco con una cuchilla de afeitar preenfriada y pinzas. Transfiera el tejido picado a un tubo de poliestireno de fondo redondo preenfriado de 5 ml que contenga 700 μL de tampón A (ver Tabla 1) e incube en hielo durante 30 minutos, protegido de la luz.</li>
		<li>Interrumpir el tejido durante 30 s o hasta que esté completamente homogeneizado con un homogeneizador de tejido de mano. Coloque las muestras en hielo y deje que la espuma disminuya durante otros 10 minutos. NOTA: Una bandeja para hornear de aluminio colocada sobre hielo seco proporciona una superficie de trabajo estable y una plataforma para el procesamiento / picado inicial del tejido.</li>
	</ol></li>
	<li>Alternativamente, utilice cultivos celulares adherentes en placas de cultivo de 100 mm como material de partida.<ol><li>Mantenga las células en hielo y use una pipeta serológica para enjuagar las células dos veces con 10 ml de PBS helado que contiene 100 mM NEM.</li>
		<li>Lise las células agregando 1 ml de tampón de homogeneización/lisis en frío y raspando vigorosamente con un raspador celular rígido. Transfiera el lisado a un tubo de centrífuga de 2 ml utilizando una micropipeta. NOTA: El tampón de enjuague y el tampón de lisis se pueden escalar en consecuencia a recipientes de cultivo de diferentes tamaños. Por lo general, se requieren de 2 a 5 millones de células; Sin embargo, esto varía dependiendo de la eficiencia de lisis y el rendimiento de proteínas para tipos de células específicas. El tampón de homogeneización puede prepararse sin NEM para las muestras que se analizan para detectar tioles totales.</li>
	</ol></li>
	<li>Transvasar el homogeneizado resultante (paso 1.1.2 o 1.2.2) a un tubo centrífugo de 2 ml utilizando una micropipeta y centrifugar a toda velocidad (≥16.000 × g) a 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante (~700 μL o ~1 ml para cultivo celular) utilizando una micropipeta a un tubo de microcentrífuga cónica de 5 ml e incube durante 30 min a 55 °C en la oscuridad con agitación a 850 rpm.</li>
	<li>Usando una pipeta serológica de vidrio, añadir 4 ml de acetona helada a las muestras e incubar a -20 °C durante la noche para la precipitación de proteínas y la eliminación del exceso de N-etilmaleimida.</li>
</ol>2. Captura asistida por resina
<ol><li>Lavar los gránulos de proteína precipitada dos veces con acetona centrifugando a 20.500 × g a 4 °C durante 10 min, decantando la acetona, eliminando cualquier resto de acetona con una micropipeta y añadiendo 3 ml de acetona fresca helada con una pipeta serológica de vidrio. Invertir varias veces para mezclar. Después del segundo lavado, deje que los gránulos se sequen al aire durante 1-2 minutos, teniendo cuidado de no secarse demasiado, ya que la resuspensión puede ser difícil.</li>
	<li>Usando una micropipeta, agregue 1 ml de tampón B (ver Tabla 1) y solubilice la proteína usando sonicación repetida durante 15-30 s a la vez usando un sonicador de baño con una salida de 250 W y vórtice breve. Mida la concentración de proteína utilizando el ensayo de ácido bicinchonínico (BCA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Para estandarizar las concentraciones de proteínas en las muestras para su posterior procesamiento y garantizar la eliminación completa de NEM, transfiera 500 μg de proteína a un filtro centrífugo de 0,5 ml de 10 kDa utilizando una micropipeta y ajuste a un volumen final de 500 μL con tampón de resuspensión.</li>
	<li>Centrifugar a 14.000 × g a temperatura ambiente hasta que el volumen en el filtro centrífugo sea inferior a 100 μL. Recoja las muestras invirtiendo el filtro en un tubo de recolección. Centrifugar a 1.000 × g durante 2 min y ajustar a un volumen final de 500 μL utilizando el tampón C (ver Tabla 1).</li>
	<li>Reducir los tioles proteicos añadiendo 20 μL de 500 mM de ditiotritol (DTT) utilizando una micropipeta hasta una concentración final de 20 mM e incubando las muestras durante 30 min a 37 °C mientras agitamos a 850 rpm.</li>
	<li>Después de la reducción, transferir las muestras con una micropipeta a filtros centrífugos de 0,5 ml de 10 kDa y centrifugar durante 15 min a 14.000 × g a temperatura ambiente o hasta que el volumen en el filtro centrífugo sea inferior a 100 μL. Añadir el tampón D (véase el cuadro 1) para que el volumen del filtro centrífugo sea inferior a 500 μL.<ol><li>Repita la centrifugación y la adición a 500 μL en el paso 2.6 tres veces, y después de la cuarta centrifugación, recoja las muestras invirtiendo el filtro en un tubo de recolección y centrifugando a 1.000 × g durante 2 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Mida la concentración de proteína utilizando el ensayo BCA de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Durante este intercambio tampón, prepare la resina de afinidad tiol pesando la cantidad adecuada de resina (30 mg/muestra) utilizando una microbalanza y transfiriéndola a un tubo centrífugo de 50 ml. A continuación, utilizando una pipeta serológica, añadir agua para una concentración final de 30 mg/ml de resina e incubar a temperatura ambiente durante 1 h con agitación para una correcta hidratación de la resina. NOTA: La resina de tiol-afinidad mencionada anteriormente ha sido descontinuada por el fabricante. Un posible reemplazo para esta resina de tiol-afinidad está disponible comercialmente. Sin embargo, este reemplazo tiene una capacidad de unión casi 5 veces menor (consulte la Información complementaria). Alternativamente, la resina de afinidad por el tiol se puede sintetizar utilizando clorhidrato de etilamina 2-(piridilditio) y resina activada por N-hidroxisuccinimida (consulte la Información complementaria).<ol><li>Después de la hidratación de la resina, coloque las columnas de centrifugado en un colector de vacío y transfiera 500 μL de la suspensión de resina utilizando una micropipeta a cada columna. Aplicar vacío para la eliminación de agua; Repita este paso una vez para obtener un total de 30 mg de resina por columna. Alternativamente, centrifugar a 1.000 × g durante 2 minutos en lugar de utilizar el colector de vacío para este y todos los pasos de lavado y elución de resina. NOTA: Cortar el extremo de una punta de pipeta de 1000 μL para aumentar el tamaño del orificio ayuda con la transferencia de la resina. Es importante triturar entre pipeteos para garantizar que la resina permanezca suspendida y se transfieran cantidades homogéneas e iguales de resina a cada columna.</li>
		<li>Lave la resina añadiendo 500 μL de agua ultrapura con una micropipeta y aplicando vacío para eliminar el agua; Repita esto 5 veces. Luego, lave la resina 5 veces con 500 μL de tampón E (ver Tabla 1). NOTA: Alternativamente, se puede utilizar la centrifugación a 1.000 x g durante 2 minutos en lugar de un colector de vacío para todos los pasos de lavado posteriores. Todos los pasos de lavado se realizan con un volumen de 500 μL. Al agregar tampones de lavado a la columna, agregue cuidadosamente con suficiente fuerza para resuspender completamente la resina evitando salpicaduras y pérdida de resina; Esto permite un lavado completo y eficiente de la resina.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizando una micropipeta, transferir 150 μg de proteína de cada muestra reducida a un nuevo tubo y ajustar a un volumen final de 120 μL de tampón C (ver Tabla 1). Transfiera la solución de proteína usando una micropipeta a una columna de centrifugado tapada que contenga la resina, coloque la tapa en la columna e incube durante 2 h a temperatura ambiente agitando a 850 rpm.</li>
	<li>Lave la resina cinco veces con 25 mM HEPES, pH 7.0; 8 M de urea; seguido de cinco veces con 2 M NaCl; seguido de cinco veces con acetonitrilo al 80% (ACN) con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%; y finalmente cinco veces con 25 mM HEPES, pH 7.7, como se describe en el paso 2.8.2 y reemplace el enchufe. NOTA: Las muestras pueden ser eluyidas aquí para su análisis a nivel de proteína (p. ej., electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE), WESTERN BLOT) como se describe en el paso 4.1.</li>
</ol>3. Digestión tríptica sobre resina y etiquetado TMT
<ol><li>Preparar suficiente solución de tripsina modificada de grado secuencial para 6-8 μg por muestra solubilizándola a una concentración de 0,5 μg/μL en tampón C (ver Tabla 1) de modo que el volumen final permita al menos 120 μL por muestra. Con ayuda de una micropipeta, añadir 120 μL de esta solución de tripsina a las muestras e incubar durante la noche a 37 °C agitando a 850 rpm. NOTA: Para aumentar la eficiencia de la digestión, se puede incluir un paso de digestión adicional al día siguiente retirando la solución de tripsina y reemplazándola con una solución fresca, y continuar la digestión durante 2 h.</li>
	<li>Lave la resina cinco veces con 25 mM HEPES, pH 7.0; seguido de cinco veces 2 M NaCl; seguido de cinco veces con 80% ACN con 0.1% TFA; seguido de tres veces con 25 mM HEPES, pH 7.7. Finalmente, lave la resina dos veces con tampón de bicarbonato de trietilo amonio (TEAB) de 50 mM y reemplace el tapón.</li>
	<li>Prepare los reactivos de etiquetado TMT dejándolos calentar primero a temperatura ambiente antes de girar brevemente usando una centrífuga a 16,000 × g. Añadir 150 μL de ACN anhidra a cada vial de reactivo de marcado TMT utilizando una micropipeta. Incubar los viales a temperatura ambiente en un termomezclador ajustado a 850 rpm durante 5 min para solubilizar completamente el reactivo. Vórtice brevemente y gire hacia abajo a 16,000 × g para recolectar el reactivo.</li>
	<li>Con una micropipeta, añadir 40 μL de TEAB de 100 mM a la resina lavada, añadir a continuación 70 μL del reactivo TMT disuelto e incubar durante 1 h a temperatura ambiente con agitación a 850 rpm. Conservar cualquier reactivo TMT restante a -80 °C. NOTA: Tome nota de las etiquetas TMT individuales asignadas a cada muestra biológica (Figura 1).</li>
	<li>Lave la resina cinco veces con 80% de ACN con 0.1% de TFA, tres veces con tampón de bicarbonato de amonio (ABC) de 100 mM, pH 8.0 y dos veces con agua como se describió anteriormente y reemplace el tapón.</li>
</ol>4. Elución peptídica
<ol><li>Eluya los péptidos marcados añadiendo 100 μL de 20 mM de TDT en 100 mM ABC, pH 8,0, a cada columna con una micropipeta e incubar a temperatura ambiente durante 30 min en un termomezclador ajustado a 850 rpm. NOTA: Después de la adición de TDT, la resina se agrupará. La resina se puede interrumpir con una punta de pipeta para romper los grupos y garantizar la elución completa de los péptidos.</li>
	<li>Después de esta incubación, coloque la columna en un colector de vacío destinado a la extracción en fase sólida (SPE), aplique vacío y eluya las muestras en un tubo de microcentrífuga de 5 ml. Repita este paso una vez.</li>
	<li>Finalmente, agregue 100 μL de 80% de ACN con 0.1% de TFA, incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y eluir en el mismo tubo de centrífuga de 5 ml. Recoja todas las fracciones en el mismo tubo de microcentrífuga de 5 ml. NOTA: Para evitar la pérdida de muestra, se deben usar tubos de baja unión para la elución, y los volúmenes deben mantenerse en o por debajo de un volumen de 4.0 ml para un solo tubo de 5 ml.</li>
	<li>Coloque las muestras eluyidas en un concentrador de vacío hasta que estén secas. Conservar los péptidos secos a -80 °C y resuspenderlos posteriormente. NOTA: Las muestras también pueden ser eluyidas por separado, y una alícuota puede ser removida y analizada por SDS-PAGE para su análisis a nivel de péptido antes de combinar las muestras.</li>
</ol>5. Alquilación peptídica y desalinización/limpieza
<ol><li>Resuspender los péptidos secos añadiendo un pequeño volumen de tampón ABC de 100 mM, pH 8,0 (no superior a 500 μL), utilizando una micropipeta. Use sonicación repetida durante 15-30 s a la vez usando un sonicador de baño con una salida de 250 W y vórtice para solubilizar y transferir a un tubo de 2 ml. NOTA: El volumen de 100 mM ABC, pH 8.0 que se agregará se basa en el volumen necesario para resuspender la TDT a una molaridad de 150 mM. Los usuarios deberán determinar la cantidad de TDT presente en su muestra en función de lo que se agregó originalmente en el paso 4.1.</li>
	<li>Añadir suficiente solución madre concentrada (600 mM) de yodoacetamida (IAA) disuelta en ABC utilizando una micropipeta para lograr una relación molar 1:4 de DTT:IAA e incubar las muestras a RT durante 1 h con agitación a 850 rpm.</li>
	<li>Acidificar las muestras a pH < 3 añadiendo TFA concentrado (10%) utilizando una micropipeta y realizar la desalinización de la muestra mediante limpieza de fase inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Coloque los péptidos limpios en un concentrador de vacío hasta que estén secos. Conservar los péptidos secos a -80 °C hasta su posterior análisis.</li>
</ol>6. Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem
<ol><li>Resuspender los péptidos secos mediante sonicación repetida durante 15-30 s a la vez utilizando un sonicador de baño con una salida de 250 W y vórtice en 20-40 μL de agua que contiene 3% de ACN. Determine la concentración de péptidos realizando un ensayo de BCA de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Separar las muestras por fase inversa LC y MS/MS como se describió anteriormente6 y registrar los espectros MS1 en el rango m/z de 400-2000. Asegúrese de que la disociación colisional de alta energía (HCD) se utiliza para obtener información de intensidad de iones reporteros para el análisis de péptidos marcados isobáricamente. Consulte las secciones de métodos de informes anteriores para obtener más detalles sobre las condiciones de funcionamiento del instrumento 27,30 y el análisis de los datos de EM27,31. NOTA: Se pueden utilizar diferentes sistemas o configuraciones LC-MS/MS para analizar las muestras de péptidos. La cobertura y la sensibilidad de la identificación de péptidos dependerán del sistema particular y la configuración utilizada.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses, financieros o de otro tipo.

La captura asistida por resina se ha utilizado en una variedad de tipos de muestras y sistemas biológicos para la investigación de modificaciones oxidativas de residuos de cisteína25,29,30. Este método permite la evaluación de muestras en múltiples niveles y lecturas, incluyendo proteínas y péptidos utilizando SDS-PAGE y análisis de Western blot, así como sitios individuales de cisteína utilizando espectrometría de masas. Indepe...

En condiciones homeostáticas, las células generan especies reactivas de oxígeno, nitrógeno o azufre que ayudan a facilitar procesos, como el metabolismo y la señalización 1,2,3, extendiéndose tanto a procariotas como a eucariotas. Los niveles fisiológicos de estas especies reactivas son necesarios para la función celular adecuada, también conocida como "eustrés"1,4. Por el contrario, un aumento de oxidantes que conduce a un desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes puede causar estrés oxidativo, o "angustia"1, que conduce al daño celular. Los oxidantes transducen señales a las vías biológicas modificando diferentes biomoléculas, incluyendo proteínas, ADN, ARN y lípidos. En particular, los residuos de cisteína de las proteínas son sitios altamente reactivos propensos a la oxidación debido al grupo tiol en la cisteína, que es reactivo hacia diferentes tipos de oxidantes5. Esto da lugar a una amplia gama de modificaciones postraduccionales reversibles basadas en redox (PTM) para cisteína, incluyendo nitrosilación (SNO), glutationilación (SSG), sulfenilación (SOH), persulfuración (SSH), polisulfuración (SSnH), acilación y disulfuros. Las formas irreversibles de oxidación de cisteína incluyen sulfinilación (SO2H) y sulfonilación (SO3H).
Las modificaciones oxidativas reversibles de los residuos de cisteína pueden desempeñar funciones protectoras que impiden una mayor oxidación irreversible o servir como moléculas de señalización para las vías celulares aguas abajo 6,7. La reversibilidad de algunos PTM redox de tiol permite que los sitios de cisteína funcionen como "interruptores redox"8,9, en los que los cambios en el estado redox de estos sitios alteran la función de las proteínas para regular su papel en los procesos transitorios. Los efectos moduladores de los PTMs redox 10 se han observado en muchos aspectos de la función proteica11, incluyendo catálisis12, interacciones proteína-proteína 13, cambio de conformación 14, coordinación de iones metálicos 15 o unión de inhibidores farmacológicos 16. Además, los PTM redox están involucrados en sitios de cisteína de proteínas que regulan vías como la transcripción17, la traducción 18 o el metabolismo19. Dado el impacto que los PTM redox tienen en la función de las proteínas y los procesos biológicos, es importante cuantificar el grado de oxidación que sufre un sitio de cisteína en respuesta a una perturbación del estado redox.
La identificación de sitios de cisteína con estados redox alterados se centra en la comparación del estado de oxidación a nivel específico del sitio entre condiciones normales y perturbadas. Las mediciones de cambio de pliegue a menudo se utilizan para determinar qué sitios están alterados significativamente, ya que esto ayuda a los usuarios a interpretar qué sitios de cisteína pueden ser fisiológicamente significativos para el estudio. Alternativamente, las mediciones estequiométricas de la oxidación reversible del tiol a través de un tipo de muestra específico dan una imagen general del estado fisiológico con respecto a la oxidación celular, una medida importante que a menudo se pasa por alto y se infrautiliza. La estequiometría de modificación se basa en cuantificar el porcentaje de tiol modificado como relación con la proteína tiol total (modificada y no modificada)20,21. Como resultado, las mediciones estequiométricas ofrecen una medición más precisa que el cambio de pliegue, especialmente cuando se utiliza espectrometría de masas. La importancia del aumento en la oxidación se puede determinar más fácilmente mediante el uso de estequiometría para determinar la ocupación de PTM de un sitio particular de cisteína. Por ejemplo, un aumento de 3 veces en la oxidación del tiol podría resultar de una transición de tan solo 1% a 3% o tan grande como 30% a 90%. Un aumento de 3 veces en la oxidación para un sitio que está solo al 1% de ocupación puede tener poco impacto en la función de una proteína; Sin embargo, un aumento de 3 veces para un sitio con una ocupación del 30% en estado de reposo puede verse afectado de manera más sustancial. Las mediciones estequiométricas, cuando se realizan entre tioles oxidados totales y modificaciones oxidativas específicas, incluida la glutationilación de proteínas (SSG) y la nitrosilación (SNO), pueden revelar proporciones e información cuantitativa con respecto a tipos de modificación específicos.
Debido a que la oxidación reversible del tiol es típicamente una modificación postraduccional de baja abundancia, se han desarrollado múltiples enfoques para el enriquecimiento de proteínas que contienen estas modificaciones a partir de muestras biológicas. Un enfoque temprano ideado por Jaffrey y otros, llamado la técnica de cambio de biotina (BST)22, implica múltiples pasos en los que los tioles no modificados se bloquean a través de alquilación, los tioles modificados reversiblemente se reducen a tioles libres nacientes, los tioles libres nacientes se marcan con biotina y las proteínas marcadas se enriquecen con la tirada de afinidad de estreptavidina. Esta técnica se ha utilizado para perfilar SNO y SSG en muchos estudios y se puede adaptar para sondear otras formas de oxidación reversible de tiol23,24. Si bien BST se ha utilizado para investigar diferentes formas de oxidación reversible de tiol, una preocupación con este enfoque es que el enriquecimiento se ve afectado por la unión no específica de proteínas no biotiniladas a la estreptavidina. Un enfoque alternativo desarrollado en nuestro laboratorio, llamado captura asistida por resina (RAC)25,26 (Figura 1), evita el problema del enriquecimiento de grupos tiol a través del sistema biotina-estreptavidina.
Tras la reducción de los tioles oxidados reversiblemente, las proteínas con tioles libres nacientes se enriquecen con la resina de afinidad tiol, que captura covalentemente los grupos tiol libres, lo que permite un enriquecimiento más específico de proteínas que contienen cisteína que el BST. El acoplamiento de RAC con el poder de multiplexación de los recientes avances en el etiquetado isobárico y la espectrometría de masas crea un flujo de trabajo robusto y sensible para el enriquecimiento, identificación y cuantificación de residuos de cisteína oxidados reversiblemente a nivel de proteoma en todo el proteoma. Los avances recientes en espectrometría de masas han permitido un perfil mucho más profundo del proteoma redox de tiol, aumentando la comprensión tanto de la causa como del efecto de la oxidación de la proteína tiol27. La información obtenida de datos cuantitativos específicos del sitio permite estudios adicionales de los impactos mecanicistas y los efectos posteriores de las modificaciones oxidativas reversibles28. La utilización de este flujo de trabajo ha proporcionado información sobre los impactos fisiológicos de la oxidación reversible de cisteína con respecto a los eventos fisiológicos normales, como el envejecimiento, en los que los niveles de SSG diferían con respecto a la edad. Los efectos del envejecimiento sobre la SSG se revirtieron parcialmente utilizando SS-31 (elamipretide), un nuevo péptido que mejora la función mitocondrial y reduce los niveles de SSG en ratones envejecidos, lo que hace que tengan un perfil de SSG más similar al de los ratones jóvenes29.
Se ha demostrado que las condiciones fisiopatológicas atribuidas a la exposición a nanopartículas involucran SSG en un modelo de macrófagos de ratón. Usando RAC junto con espectrometría de masas, los autores mostraron que los niveles de SSG estaban directamente correlacionados con el grado de estrés oxidativo y el deterioro de la función fagocítica de los macrófagos. Los datos también revelaron diferencias específicas de la vía en respuesta a diferentes nanomateriales diseñados que inducen diferentes grados de estrés oxidativo30. El método también ha demostrado su utilidad en especies procariotas, donde se aplicó para estudiar los efectos de los ciclos diurnos en cianobacterias fotosintéticas con respecto a la oxidación del tiol. Se observaron amplios cambios en la oxidación del tiol en varios procesos biológicos clave, incluido el transporte de electrones, la fijación de carbono y la glucólisis. Además, a través de la validación ortogonal, se confirmó la modificación de varios sitios funcionales clave, lo que sugiere roles reguladores de estas modificaciones oxidativas6.
Aquí, describimos los detalles de un flujo de trabajo estandarizado (Figura 1), demostrando la utilidad del enfoque RAC para el enriquecimiento de tioles de cisteína oxidada total de proteínas y su posterior etiquetado y cuantificación estequiométrica. Este flujo de trabajo se ha implementado en estudios del estado redox en diferentes tipos de muestras, incluyendo cultivos celulares27,30 y tejidos enteros (por ejemplo, músculo esquelético, corazón, pulmón)29,31,32,33. Aunque no se incluye aquí, el protocolo RAC también se adapta fácilmente para la investigación de formas específicas de modificaciones redox reversibles, incluyendo SSG, SNO y S-acilación, como se mencionó anteriormente25,29,34.

<table><tbody><tr><td>Clorhidrato de 2-(piridilitio)etilamina</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-101794</td><td>Reactivo para la síntesis interna de resinas</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga LoBind de 2,0 mL Tubos de centrífuga LoBind</td> de <td>22431048</td><td></td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>de 5,0 mL</td> Tubos de fondo redondo <td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5,0 mL Acetona</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>A949-1</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>tiol activado; Sepharose&nbsp; 4B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8512</td><td>Posible sustituto de la resina de afinidad</td></tr><tr><td>tiol Amicon Ultra Filtro centrífugo de 0,5 ml</td><td>Millipore Sigma UFC5010BK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bicincónico (BCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Centrífuga de reactivos para ensayo de proteínas</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20291</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>BioSpec Productos</td><td>985370</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetimida (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td><td>Cytiva</td><td>17-0906-01</td><td>Reactivo para la síntesis interna de resinas</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus colector de vacío</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>1510R-MT</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de centrifugado</td><td>Thermo Scientific</td><td>69705</td><td></td></tr><tr><td>Strata C18-E Columnas de fase inversa</td><td>Phenomenex</td><td>8B-S001-DAK</td><td>Desalinizador de péptidos</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5355</td><td></td></tr><tr><td>Thiopropyl Sepharose 6B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0420-01</td><td>resina de afinidad con tiol; *El fabricante ha interrumpido la producción de resina de tiopropil sepharose 6B (consulte el protocolo para obtener más detalles).</td></tr><tr><td>Marcadores isobáricos TMT (16 plex)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A44522</td><td>Reactivo de marcado de péptidos; disponible en múltiples formatos Tampón de</td></tr><tr><td>bicarbonato de trietilamonio (TEAB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Promega</td><td>V5820</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus speedvac</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>concentrador</td></tr> de <tr><td>vacío Mezclador de vórtice Scientific</td><td>Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Las modificaciones oxidativas reversibles en los tioles proteicos han surgido recientemente como mediadores importantes de la función celular. Aquí describimos el procedimiento detallado de un método cuantitativo de proteómica redox que utiliza la captura asistida por resina (RAC) en combinación con el etiquetado isobárico de etiqueta de masa en tándem (TMT) y la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS) para permitir la cuantificación estoquiométrica multiplexada de tioles de proteínas oxidadas a nivel de proteoma. La información cuantitativa específica del sitio sobre residuos de cisteína oxidada proporciona información adicional sobre los impactos funcionales de tales modificaciones. 
El flujo de trabajo es adaptable a través de muchos tipos de muestras, incluidas las células cultivadas (por ejemplo, mamíferos, procariotas) y tejidos enteros (por ejemplo, corazón, pulmón, músculo), que inicialmente se lisan / homogeneizan y con tioles libres alquilados para evitar la oxidación artificial. Los tioles de proteínas oxidadas se reducen y capturan mediante una resina de afinidad por tiol, que agiliza y simplifica los pasos del flujo de trabajo al permitir que los procedimientos de digestión, etiquetado y lavado se realicen sin transferencia adicional de proteínas / péptidos. Finalmente, los péptidos marcados son eluyidos y analizados por LC-MS / MS para revelar cambios estequiométricos completos relacionados con la oxidación del tiol en todo el proteoma. Este método mejora en gran medida la comprensión del papel de la regulación dependiente de redox en estados fisiológicos y fisiopatológicos relacionados con la oxidación de proteínas tiol.

La finalización del protocolo resultará en un enriquecimiento altamente específico de péptidos que contienen cisteína previamente oxidados, a menudo con una especificidad del &gt;95% 27,35,36. Sin embargo, varios pasos clave del protocolo requieren atención especial, por ejemplo, el bloqueo inicial de tioles libres antes de la lisis/homogeneización de la muestra, que prohíbe la oxidación artificial y el enriquecimiento no especí...

La oxidación de la proteína tiol tiene implicaciones significativas en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas normales. Describimos los detalles de un método cuantitativo de proteómica redox, que utiliza captura asistida por resina, etiquetado isobárico y espectrometría de masas, lo que permite la identificación y cuantificación de proteínas de cisteína oxidadas reversibles.

Captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Este protocolo describe un método que permite la identificación específica del sitio de residuos de cistina oxidada de proteínas. El método permite generar datos cuantitativos y específicos del sitio de residuos de cistina oxidada a partir de varios tipos de muestras. Para comenzar el procedimiento de captura asistida, lave los gránulos de proteína precipitada dos veces con acetona centrifugando a 20, 500 G, en cuatro grados centígrados durante 10 minutos.A continuación, decantar la acetona y retirar la acetona restante con una micropipeta. Usando una pipeta serológica de vidrio, agregue tres mililitros de acetona fresca helada al tubo y mezcle bien invirtiendo el tubo varias veces. Después del segundo lavado, deje que los gránulos se sequen al aire durante uno o dos minutos sin dejar que se sequen demasiado.Agregue un mililitro de tampón B al pellet de proteína seca. Para solubilizar la proteína, sonicar el pellet repetidamente en un sonicador de baño con una salida de 250 vatios durante 15 a 30 segundos a la vez, junto con un breve vórtice. Realice el ensayo de ácido bicinchonínico o BCA para medir la concentración de proteína.Para estandarizar las concentraciones de proteína, transfiera 500 microgramos de muestra de proteína a un filtro centrífugo de 0,5 mililitros y 10 kilodaltons, y aumente el volumen de la muestra a 500 microlitros con tampón de resuspensión. Centrifugar la mezcla tampón de proteínas a 14, 000 G a temperatura ambiente, hasta que el volumen en el filtro centrífugo sea inferior a 100 microlitros. Recoja la muestra invirtiendo el filtro en un tubo de recolección.Centrifugar la muestra a 1000 G durante dos minutos y añadir tampón C para obtener un volumen final de 500 microlitros. Para reducir la proteína tioles, añadir 20 microlitros de 500 milimolares de ditiothreitol o DTT, a la muestra para obtener una concentración final de 20 milimolar, e incubar las muestras durante 30 minutos a 37 grados centígrados con agitación a 850 RPM. Después de la reducción, centrifugar a las muestras en filtros centrífugos de 0,5 mililitros y 10 kilodalton a 14, 000 G a temperatura ambiente, hasta que el volumen en el filtro centrífugo sea inferior a 100 microlitros.Agregue el tampón D para completar el volumen a 500 microlitros y repita la centrifugación. Después de la cuarta centrifugación, recoger las muestras invirtiendo el filtro en un tubo de recogida para centrifugar a 1000 G durante dos minutos. Luego mida la concentración de proteína usando el ensayo BCA.A continuación, coloque las columnas de centrifugado en un colector de vacío y, utilizando una micropipeta, transfiera 500 microlitros de la suspensión de resina de afinidad tiol recién preparada a cada columna. Aplicar vacío para la eliminación de agua. Repita el procedimiento una vez para obtener 30 miligramos de resina por columna.Lave la resina cinco veces con 500 microlitros de agua ultrapura, aplicando un vacío para eliminar el agua y luego cinco veces con 500 microlitros de tampón E.In un nuevo tubo, agregue tampón C a 150 microgramos de la muestra de proteína reducida hasta que el volumen final sea de 120 microlitros. Transfiera la solución de proteína a una columna de centrifugado tapada que contenga la resina. Coloque la tapa en la columna e incube durante dos horas a temperatura ambiente agitando a 850 rpm.Lave la resina como se describe en el manuscrito. Vuelva a colocar el enchufe. Para realizar la digestión tríptica sobre resina, agregue 120 microlitros de solución de tripsina recién preparada a las muestras e incube la columna durante la noche a 37 grados centígrados, con agitación a 850 RPM.Al día siguiente, lave la resina varias veces como se describe en el manuscrito y reemplace el tapón. Usando una micropipeta, agregue 40 microlitros de tampón de bicarbonato de trietilamonio 100 milimolar a la resina lavada. Luego agregue 70 microlitros de la etiqueta de masa en tándem disuelta o el reactivo de etiquetado TMT, e incube durante una hora a temperatura ambiente con agitación a 850 RPM.Guarde cualquier reactivo TMT restante a menos 80 grados centígrados. Lave la resina y vuelva a colocar el tapón. Eluya los péptidos marcados con TMT agregando 100 microlitros de tampón de bicarbonato de amonio de 100 milimolares a pH 8.0, que contiene 20 milimolares DTT, a la columna, e incubando la columna en un mezclador térmico a temperatura ambiente durante 30 minutos a 850 RPM.Después de la incubación, realice la elución colocando la columna en un colector de vacío, aplicando el vacío y eluyendo las muestras en un tubo de microcentrífuga de cinco mililitros. Repita el paso una vez, luego agregue 100 microlitros de 80% de acetonitrilo con 0.1% de ácido trifluoroacético a la columna. Después de incubar la columna durante 10 minutos a temperatura ambiente, eluya la muestra en el mismo tubo de centrífuga de cinco mililitros.Coloque las muestras eluyidas en un concentrador de vacío hasta que estén secas. Luego guarde los péptidos secos a menos 80 grados centígrados hasta que se sigan usando. El análisis cualitativo de muestras de péptidos de células RAW 264.7 se llevó a cabo con SDS-PAGE, donde las muestras se compararon determinando diferentes niveles de oxidación debido a los tratamientos.Las proteínas separadas fueron posteriormente probadas por Western blot para investigar más a fondo los niveles de oxidación de proteínas individuales. Las intensidades iónicas reportadas de péptidos que contienen cistina se analizaron mediante cromatografía líquida espectrometría de masas en tándem. Se cuantificó la estequiometría de oxidación de tiol de iTRAQ, péptidos marcados enriquecidos y oxidados a niveles individuales del sitio de cistina.Retire con cuidado la acetona sin alterar el pellet de proteína. Asegúrese de que el pellet de proteína esté completamente solubilizado y cuantificado con precisión, y que la resina se asigne con precisión a las columnas de centrifugado. Asegúrese de resuspender la resina durante los pasos de lavado.Se puede realizar una evaluación adicional de proteínas y péptidos enriquecidos mediante SDS-PAGE y tinción, western blot y espectrometría de masas.

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Investigación

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Bioquímica

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Captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol (Video) | JoVE Journal

Captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol

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