Name: Evaluación de la actividad antitumoral in vivo de nanopartículas de polianhídrido IL-1α (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a evaluar la actividad antitumoral de IL-1α en un modelo sinigénico de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. Este protocolo permite estudiar eficacia y toxicidad en oncología e inmunología.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el Premio de Revisión al Mérito #I01BX004829 de los Estados Unidos (EE. Departamento de Asuntos de Veteranos, Servicio de Investigación y Desarrollo de Laboratorios Biomédicos y apoyado por el Programa de Premios Mezhir a través del Centro Integral de Cáncer Holden de la Universidad de Iowa.

Todos los procedimientos in vivo utilizados en este estudio fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la Universidad de Iowa.
1. Preparación y mantenimiento de la línea celular HNSCC
NOTA: En este estudio, se utilizará la línea celular epitelial orofaríngea murina transformada de manera estable con VPH E6 y E7 junto con hRas y luciferasa (mEERL). Esta línea celular se desarrolló a partir de la cepa de ratón C57BL / 6J y fue un regalo de la Dra. Paola D. Vermeer (Departamento de Cirugía, Facultad de Medicina Sanford de la Universidad de Dakota del Sur, Dakota del Sur, EE.
<ol><li>Descongele un vial congelado de células mEERL en un baño de agua precalentado (37 °C) y luego transfiéralo a un tubo cónico de 15 ml que contenga medios de cultivo calientes (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] suplementado con 40.5% 1: 1 DMEM / Hams F12, 10% de suero fetal bovino [FBS], 0.1% de gentamicina, 0.005% de hidrocortisona, 0.05% de transferrina, 0.05% de insulina, 0.0014% de triyodotironina y 0.005% de factor de crecimiento epidérmico).</li>
	<li>Centrifugar el tubo cónico a 277 x g durante 5 min a 25 °C para extraer el medio. A continuación, resuspender el pellet celular en medios frescos de 3-5 ml y transferirlo a un matraz de cultivo celular T-25. Para una recuperación óptima del almacenamiento congelado, células en placa a alta densidad. NOTA: Los matraces T-25 se utilizaron debido a su tamaño más pequeño, lo que resulta en tiempos de recuperación más rápidos del almacenamiento congelado cuando las celdas están muy cerca en comparación con los matraces T-75.</li>
	<li>Deje que las células crezcan en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% deCO2, expanda a matraces más grandes (es decir, T-75 o T-150) y pase cada 3 días. Cuando haya suficientes células para la implantación deseada en todos los ratones, retire los frascos, deseche el medio y enjuague suavemente las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación, añadir 4 ml (si se utilizan matraces T150) de tripsina-EDTA al 0,25% e incubar a 37 °C durante 2 min. Aumente o disminuya la cantidad de tripsina según el tamaño del plato/matraz que se utilice. NOTA: El tipo de línea celular y el grado de confluencia pueden afectar los tiempos de tripsinización. Los largos períodos de tripsinización pueden dañar las células, lo que resulta en una baja viabilidad. Utilice la cantidad mínima de tiempo necesaria para la tripsinización.</li>
	<li>Bajo el microscopio, las células separadas en la tripsinización se mueven libremente. Si algunas células todavía están unidas, golpee muy suavemente el matraz para movilizar las células adherentes restantes. Agregue medios nuevos (escala la cantidad de medios según lo desee) para detener la reacción de tripsina y recoja la suspensión celular en tubos cónicos de 50 ml. Centrifugar a 277 x g durante 5 min a 25 °C para extraer el medio.</li>
	<li>Resuspenda las células en medios frescos y cuente las células. Centrifugar una vez más (como se describió anteriormente), y luego agregar PBS frío a las células para obtener una concentración final de 10 × 106 células / ml. Mantenga la(s) suspensión(es) celular(es) en hielo antes de inyectarla en ratones.</li>
</ol>2. Implantación del tumor, tratamiento farmacológico y medición
NOTA: Los animales experimentales se mantuvieron en el Centro de Cuidado de Animales de la Universidad de Iowa y siguieron los procedimientos asépticos apropiados para manejarlos.
<ol><li>Anestesiar ratones C57Bl/6J con ketamina (80 mg/kg) y xylazina (10 mg/kg) mezcla. Afeite cuidadosamente el área del flanco o el sitio de inyección deseado con una máquina de afeitar eléctrica. NOTA: Recuerde documentar el uso de sustancias controladas según lo requerido por las reglas y regulaciones institucionales (u otras).</li>
	<li>Desinfecte el área del flanco con una almohadilla de etanol e inyecte lentamente 100 μL (que contiene 1 x 106 células) de la suspensión celular por vía subcutánea utilizando una jeringa de 25-28 G. Anestesiar a los ratones antes de la inyección para evitar movimientos bruscos y pérdida de células. Antes de cada inyección, mezcle suavemente la suspensión celular para evitar que las células se depositen en el fondo del vial o tubo cónico.</li>
	<li>Después de tomar la suspensión celular en la jeringa, retire todas las burbujas y el espacio muerto de la parte superior. Inyecte la suspensión celular de manera lenta y constante. No use la misma aguja en varios ratones. Siempre haga suspensiones celulares adicionales para tener en cuenta la pérdida accidental.</li>
	<li>Coloque al animal en sus respectivas jaulas y monitoréelo hasta que se recupere de la anestesia. Durante la anestesia, los animales están en riesgo de hipotermia; Por lo tanto, proporcione calor suplementario o coloque a los ratones cerca uno del otro para mantenerse calientes (si están alojados en la misma jaula).</li>
	<li>Cuando los tumores alcancen los 3 mm en cualquier dirección, aleatorice a los ratones (por tamaño y/o peso del tumor) en los grupos de tratamiento y luego comience el tratamiento farmacológico. Inyectar los ratones por vía intraperitoneal (i.p.) con NPs15 que contienen 3,75 μg de rIL-1α/ratón en los días 4 y 9. Mida y registre el volumen del tumor ((largo x ancho 2) /2) y el peso del ratón diariamente o cada dos días hasta que el tamaño del tumor o los ratones alcancen los criterios de eutanasia. NOTA: Incluso con un investigador experimentado, es difícil implantar el tumor del mismo tamaño en todos los ratones. Aleatorizar a los animales en grupos experimentales según el tamaño del tumor y el peso del ratón.</li>
</ol>3. Extracción de sangre y separación del suero
NOTA: La recolección de sangre de una vena submandibular es una técnica fácil y efectiva que permite la recolección de sangre de animales conscientes o bajo anestesia. Para este estudio, se recolectó sangre de los animales cuando estaban bajo anestesia.
<ol><li>Anestesiar a los ratones con una inyección de mezcla de ketamina / xilazina como se mencionó anteriormente.</li>
	<li>Agarre la piel suelta sobre el hombro con la mano no dominante y perfore la vena submandibular con una aguja o lanceta de 18 G, ligeramente detrás de la mandíbula (una mancha blanca en esa área).</li>
	<li>Perfore la vena para asegurar el flujo sanguíneo inmediatamente. Recoja 200-300 μL de sangre (dependiendo del peso del ratón) en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml o en un tubo separador de suero. Después de la recolección de sangre, aplique una presión suave en el sitio de punción hasta que el sangrado se haya detenido. Devuelva a los ratones a sus respectivas jaulas y observe hasta que se recuperen de la anestesia. NOTA: No recoja más del 1% del peso corporal del ratón en una colección o durante un período de 24 horas.</li>
	<li>Deje que la sangre recolectada coagule a temperatura ambiente durante 20-30 min. Coloque los tubos sobre hielo hasta que estén listos para centrifugarse.</li>
	<li>Centrifugar la sangre coagulada a 1540 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Recoja la capa superior (suero) sin alterar los glóbulos rojos. Conservar a -80 °C hasta su uso.</li>
</ol>4. Multiplexación del suero recogido
<ol><li>Descongele las muestras de suero o plasma mientras las mantiene en hielo.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 1540 x g durante 5 min a 4 °C para sedimentar cualquier residuo celular y recoger cuidadosamente la capa de suero de la parte superior.</li>
	<li>Saca el kit multiplex a temperatura ambiente. NOTA: Hay varios kits multiplex disponibles comercialmente que están diseñados para citocinas, quimiocinas o factores de crecimiento específicos. Además, es posible personalizar el kit en función de la proteína de interés.</li>
	<li>Realice el ensayo según el protocolo del fabricante para detectar citoquinas. NOTA: La mayoría de los kits multiplex utilizan perlas magnéticas para unir el anticuerpo capturado. Por lo tanto, es esencial utilizar una lavadora magnética automatizada o de mano durante el lavado. De lo contrario, las cuentas magnéticas se lavarán de la placa y uno no tendrá suficientes eventos para tomar la lectura.</li>
</ol>5. Recolección del tumor y ganglio linfático inguinal y preparación de la suspensión unicelular
<ol><li>Anestesiar a los ratones con una mezcla de ketamina/xilazina. Para asegurar una sedación completa, use reflejo del pedal (pellizco firme del dedo del pie). Si los ratones no responden, eutanasia a los ratones por dislocación cervical.</li>
	<li>Coloque cada ratón sobre su espalda y rocíe etanol al 70% sobre la piel del área abdominal. Use fórceps y tijeras para cortar el tumor del lado izquierdo de los ratones y el ganglio linfático del lado derecho. Si el tumor es grande, córtelo en trozos pequeños y tome 500-600 mg del tejido. Para el ganglio linfático, recoja todo el órgano. NOTA: Hay dos ganglios linfáticos a ambos lados de la región inguinal. Dependiendo de los objetivos experimentales, el ganglio linfático y el tumor se pueden aislar del mismo lado. Sin embargo, si el tumor se vuelve muy grande, no será fácil recolectar el ganglio linfático del mismo lado.</li>
	<li>Coloque los tejidos en los tubos disociadores respectivos que contienen 3-5 ml de medios RPMI. Homogeneizar el tejido utilizando un disociador automatizado. NOTA: Se pueden utilizar otros homogeneizadores automáticos o portátiles.</li>
	<li>Después de la homogeneización, transfiera la suspensión celular a través de un filtro de 70 μm a un tubo cónico de 50 ml. Centrifugar a 277 x g durante 5 min a 25 °C para extraer el medio. Lave y resuspenda las células en 1-2 ml de PBS frío.</li>
</ol>6. Tinción FACS de suspensión unicelular
<ol><li>Use tinción de azul de tripano al 0.4% para contar las células viables en un hemocitómetro. Calcule el volumen requerido para obtener 2-3 millones de células y transfiéralas al tubo FACS respectivo.</li>
	<li>Use un tinte de viabilidad para bloquear las células vivas; De lo contrario, puede ocurrir una unión inespecífica del anticuerpo con células muertas que puede producir un resultado falso positivo. NOTA: El tinte zombie se utilizó para la tinción de células vivas y muertas en este experimento. Varios colorantes reparables y no reparables (por ejemplo, yoduro de propidio) están disponibles comercialmente.</li>
	<li>Centrifugar (277 x g durante 5 min a 25 °C) las celdas contadas. Decantar el sobrenadante y resuspender las células en 300 μL de PBS. Agregue 0.5-1 μL de tinte / tubo zombie. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Centrifugar (277 x g durante 5 min a 25 °C) y lavar las células con 1-2 ml de tampón FACS y resuspenderlas en 200 μL de tampón FACS.</li>
	<li>Agregue un bloqueador del receptor Fc (2 μL por 200 μL o según el protocolo del fabricante) e incube las células durante 10 min.</li>
	<li>Centrifugar (277 x g durante 5 min a 25 °C) y lavar las celdas con 1-2 ml de tampón FACS. Añadir el cóctel de anticuerpos e incubar durante 30 min a 4 °C en la oscuridad.</li>
	<li>Después de la incubación, centrifugar (277 x g durante 5 min a 25 °C) y lavar las células con 1-2 ml de tampón FACS. Añadir 300-400 μL de solución de paraformaldehído al 2% y resuspender para fijación. Almacenar las células en este paso durante un par de días a 4 °C o analizar inmediatamente con citómetro de flujo multicolor.</li>
</ol>

<ol><li>Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+inflammation+by+blocking+interleukin-1+in+a+broad+spectrum+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).</li>
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<li>Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+polyanhydrides+as+localized+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release+%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Role of polyanhydrides as localized drug carriers.</a> Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).</li>
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<li>Goldman, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+human+cell+engraftment+in+mice+deficient+in+RAG2+and+the+common+cytokine+receptor+gamma+chain%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain.</a> British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).</li>
<li>Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspective+on+in+vivo+molecular+imaging+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells.</a> Molecules. 22 (6), (2017).</li>
<li>Espinosa-Cotton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+alpha+increases+antitumor+efficacy+of+cetuximab+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79(2019).</li>
<li>Veltri, S., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+1+trials+in+cancer+patients%3A+A+review+of+the+toxicity%2C+antitumor+and+hematopoietic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Oncologist%22%5BJournal%5D)">Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects.</a> The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo permitirá a cualquier investigador estudiar la actividad antitumoral y algunos de los mecanismos subyacentes de los fármacos inmunomoduladores en un sistema modelo de ratón tumoral in vivo . Aquí, se utilizó un modelo de tumor subcutáneo singénico, que tiene varias ventajas sobre los modelos ortotópicos, incluido su protocolo técnicamente sencillo, fácil monitoreo del crecimiento tumoral, menos morbilidad animal y mayor producibilidad. Los modelos de tumores subcutáneos también se pueden modificar...

Una de las áreas emergentes de la inmunoterapia contra el cáncer es el uso de citoquinas inflamatorias para activar el sistema inmunológico de los pacientes contra sus células tumorales. Varias citocinas proinflamatorias (es decir, interferón-alfa (IFNα), interleucina-2 (IL-2) e interleucina-1 (IL-1)) pueden aumentar una inmunidad antitumoral significativa, lo que ha generado interés en explorar las propiedades antitumorales, así como la seguridad de los fármacos basados en citoquinas. La interleucina-1 alfa (IL-1α) en particular, es una citoquina proinflamatoria conocida como la citoquina maestra de la inflamación1. Desde el descubrimiento de esta citoquina a finales de la década de 1970, se ha investigado como un agente anticancerígeno, así como un fármaco hematopoyético para tratar los efectos negativos de la quimioterapia2. A finales de la década de 1980, se realizaron varios estudios preclínicos y clínicos para determinar los efectos anticancerígenos de IL-1α 3,4,5,6. Estos estudios encontraron una actividad antitumoral prometedora de IL-1α recombinante (rIL-1α) contra el melanoma, el carcinoma de células renales y el carcinoma de ovario. Sin embargo, se observaron con frecuencia toxicidades, como fiebre, náuseas, vómitos, síntomas similares a los de la gripe y, más gravemente, hipotensión limitante de la dosis. Desafortunadamente, estas toxicidades relacionadas con la dosis disminuyeron el entusiasmo por un mayor uso clínico de rIL-1α.
Para intentar abordar el problema crítico de las toxicidades mediadas por IL-1α, se investigarán formulaciones de nanopartículas de polianhídrido (NP) que permitan la liberación controlada de IL-1α por cinética de erosión superficial. Estas formulaciones NP están destinadas a cosechar los beneficios de las propiedades antitumorales de IL-1α al tiempo que reducen los efectos secundarios limitantes de la dosis7. Los polianhídridos son polímeros aprobados por la FDA que se degradan a través de la erosión superficial, lo que resulta en una liberación de orden casi cero de agentes encapsulados 8,9,10,11,12. Se ha informado que los copolímeros de polianhídrido anfifílico que contienen 1,8-bis-(p-carboxifenoxi)-3,6-dioxaoctano (CPTEG) y 1,6-bis-(p-carboxifenoxi) hexano (CPH) son excelentes sistemas de administración para diversas cargas útiles en oncología e investigación basada en inmunología 8,12. En el siguiente protocolo 20:80 CPTEG:CPH NPs cargados con 1,5% en peso de rIL-1α (IL-1α-NPs) se utilizarán para estudiar la actividad antitumoral y la toxicidad de esta citoquina en un modelo de ratón de HNSCC.
El objetivo general de los siguientes procedimientos es evaluar la actividad antitumoral de IL-1α-NP en los HNSCC. Los procedimientos descritos, incluida la evaluación del crecimiento y la supervivencia del tumor, se pueden aplicar a cualquier agente inmunomodulador de interés. Estos procedimientos deben realizarse en un modelo de ratón singénico con un sistema inmuneintacto 13 para maximizar la relevancia clínica. La toxicidad de IL-1α-NP también se evaluará midiendo los cambios en los niveles circulantes de citoquinas proinflamatorias y el peso animal. Existen muchos métodos para determinar la toxicidad in vivo de los fármacos; Sin embargo, los métodos más utilizados implican la medición de las enzimas séricas para la toxicidad de los órganos y los cambios histológicos en esos órganos. Sin embargo, para realizar análisis histológicos, el animal necesita ser sacrificado, lo que afectará las curvas de supervivencia del experimento. Por lo tanto, este protocolo incluirá un protocolo para la recolección de sangre de ratones vivos para la medición de citoquinas en muestras de suero. El suero recolectado se puede utilizar para la medición de cualquier analito sérico deseado para la toxicidad de los órganos. La citometría de flujo multicolor se utilizará para comprender los cambios en la población de células inmunitarias en el microambiente tumoral y la migración de células inmunitarias al ganglio linfático. Se pueden utilizar otros métodos para identificar células inmunes, incluyendo inmunohistoquímica y/o inmunofluorescencia de secciones preservadas14. Sin embargo, estas técnicas pueden llevar mucho tiempo y ser tediosas de realizar en un gran número de animales. En general, los siguientes métodos permitirán a los investigadores estudiar la respuesta inmune antitumoral y los posibles mecanismos de los agentes inmunoestimulantes para el tratamiento del cáncer.

<table><tbody><tr><td>Bio-Plex 200 Systems</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>El sistema fue proporcionado por el Centro de Citometría de Flujo, Universidad de IOWA Health Care</td></tr>, <tr><td>Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay,</td><td>Bio-Rad</td><td>M60009RDPD</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Ratones Jakson Labs</td><td>664</td>, DMEM de <td>4 a 6 semanas de edad</td></tr><tr><td>(Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Millipore Sigma</td><td>SRP3196-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Millipore Sigma</td><td>12103C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución de sulfato de gentamicina</td><td>IBI Scientific IB02030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Disociator</td><td>Miltenyi </td> Lavadora de placas magnéticas de mano Biotec <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EPX-55555-000</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Millipore Sigma</td><td>H6909-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Millipore Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina/xilacina</td><td></td><td></td><td>Anestesia inyectable</td></tr><tr><td>Línea</td><td></td><td></td> <td>celular MEERLCélulas epiteliales orofaríngeas murinas que expresan de manera estable HPV16 E6/E7 junto con células hRAS y luciferasa (mEERL)</td></tr><tr><td>Balanzas portátiles</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scienceware&nbsp; Digi-Max&nbsp; pinza deslizante</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z503576-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla de preparación con alcohol estéril (70% de alcohol isopropílico)</td><td>Cardinal</td><td>COV5110. PMP</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina Humana</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8158-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Tri-yodotironina</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5516-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la actividad antitumoral in vivo de nanopartículas de polianhídrido il-1α

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

La terapia con citoquinas es una estrategia inmunoterapéutica prometedora que puede producir respuestas inmunitarias antitumorales robustas en pacientes con cáncer. La citoquina proinflamatoria interleucina-1 alfa (IL-1α) se ha evaluado como agente anticancerígeno en varios estudios preclínicos y clínicos. Sin embargo, las toxicidades limitantes de la dosis, incluidos los síntomas similares a la gripe y la hipotensión, han disminuido el entusiasmo por esta estrategia terapéutica. La administración de IL-1α basada en nanopartículas de polianhídrido (NP) representaría un enfoque efectivo en este contexto, ya que esto puede permitir una liberación lenta y controlada de IL-1α sistémicamente al tiempo que reduce los efectos secundarios tóxicos. Aquí se describe un análisis de la actividad antitumoral de NPs de polianhídrido cargados con IL-1α en un modelo de ratón singénico de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC). Las células epiteliales orofaríngeas murinas que expresan de manera estable HPV16 E6 / E7 junto con células hRAS y luciferasa (mEERL) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL / 6J. Una vez que los tumores alcanzaron 3-4 mm en cualquier dirección, se administró una formulación de nanopartículas (IL-1α-NP) cargadas con 1,80% de IL-1a (p-carboxifenoxi)-3,6-dioxaoctano:1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano (CPTEG: CPH) cargadas con 1,5% de IL-1a (CPTEG: CPH) a ratones por vía intraperitoneal. El tamaño del tumor y el peso corporal se midieron continuamente hasta que el tamaño del tumor o la pérdida de peso alcanzaron los criterios de eutanasia. Se tomaron muestras de sangre para evaluar las respuestas inmunes antitumorales mediante venopunción submandibular, y se midieron citocinas inflamatorias mediante ensayos multiplex de citoquinas. Los ganglios linfáticos tumorales e inguinales se resecaron y homogeneizaron en una suspensión unicelular para analizar varias células inmunes a través de citometría de flujo multicolor. Estos métodos estándar permitirán a los investigadores estudiar la respuesta inmune antitumoral y el mecanismo potencial de las NP inmunoestimulantes y otros agentes de inmunoterapia para el tratamiento del cáncer.

En este estudio, se investigó la actividad antitumoral del polianhídrido IL-1α en un modelo singénico de ratón de HNSCC. La IL-1α recombinante (rIL-1α) ralentizó significativamente el crecimiento tumoral de mEERL (Figura 1A), aunque se observó pérdida de peso en los ratones tratados, que se restableció después de la retirada del tratamiento (Figura 1B). Las IL-1α-NP no indujeron un efecto antitumoral significativo en comparación con las NP salinas o en blanco (F...

Se describe un protocolo estándar para estudiar la actividad antitumoral y la toxicidad asociada de IL-1α en un modelo singénico de ratón de HNSCC.

Evaluación de la actividad antitumoral in vivo de nanopartículas de polianhídrido IL-1α

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Estos protocolos proporcionan una forma eficaz de estudiar la actividad antitumoral de los ataques de inmunomoduladores. Además, el análisis de las posibilidades asociadas en las citoquinas circulantes y las poblaciones de células inmunitarias se puede realizar utilizando estos métodos propuestos. La principal ventaja de este protocolo es que es una forma fácil y directa de implantar un tumor y controlar su crecimiento. La implicación directa de esta técnica es evaluar la eficacia de ciertas terapias o desafíos en la investigación contra el cáncer. Además, algunos aspectos de estas técnicas son adecuados para estudios de toxicidad. Para comenzar, descongele un vial congelado de células murinas de EERL en un baño de agua precalentado a 37 grados Celsius y transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga medios de cultivo calientes. Centrifugar el tubo cónico a 277 veces G durante cinco minutos a 25 grados centígrados para eliminar el medio. A continuación, vuelva a suspender el paladar celular en medios frescos de tres a cinco mililitros y transfiérelo a un matraz de cultivo celular T25. Deje que las células crezcan en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, expanda a matraces más grandes y pase cada tres días. Cuando haya suficientes células para la implantación deseada en todos los ratones, retire los frascos, deseche el medio y enjuague suavemente las células PBS. A continuación, añade cuatro mililitros de EDTA al 0,25% de tripsina e incuba a 37 grados centígrados durante dos minutos. Agregue medios nuevos para detener la reacción de tripsina y recoja la suspensión celular en tubos cónicos de 50 mililitros. Vuelva a suspender las células en medios nuevos y cuente las células. Centrifugar una vez más, luego agregar PBS frío a las células para obtener una concentración final de 10 millones de células por mililitro. Mantenga la suspensión celular en hielo antes de la inyección. Desinfecte el área del flanco con una almohadilla de etanol. Para inyectar suspensión celular en ratones, aspire 100 microlitros de suspensión celular en la jeringa y elimine todas las burbujas y el espacio muerto de la parte superior. A continuación, inyecte la suspensión celular por vía subcutánea de forma lenta y constante en ratones anestesiados. Coloque a los animales en sus respectivas jaulas y vigílelos hasta que se recuperen de la anestesia. Para recolectar sangre, agarre la piel suelta por encima del hombro con la mano no dominante y perfore la vena submandibular con una aguja o lanceta de calibre 18. Recoja de 200 a 300 microlitros de sangre en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitros o en un tubo separador de suero. Después de la extracción de sangre, aplique una presión suave en el sitio de punción hasta que el sangrado se haya detenido. Regrese a los ratones a sus respectivas jaulas y observe hasta que se recuperen de la anestesia. Deje que la sangre recolectada se coagule a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Luego coloque los tubos en hielo hasta que estén listos para ser centrifugados. Centrifugar la sangre coagulada a 1.540 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y recoger con cuidado la capa de suero de la parte superior. Descongele las muestras de suero o plasma mientras las mantiene en hielo. A continuación, centrifugar las muestras a 1.540 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, para sedimentar cualquier residuo celular y recoger cuidadosamente la capa de suero de la parte superior. Coloque el kit multiplex a temperatura ambiente y realice el ensayo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Coloque cada ratón boca arriba y rocíe etanol al 70% sobre la piel del área abdominal. Use fórceps y tijeras para cortar el ganglio linfático del lado derecho de los ratones y el tumor del lado izquierdo. Si el tumor es grande, córtelo en trozos pequeños y extraiga entre 500 y 600 miligramos del tejido. Coloque los tejidos en los respectivos tubos disociadores que contengan de tres a cinco mililitros de medios RPMI. Homogeneizar el tejido mediante un disociador automatizado. Después de la homogeneización, filtre la suspensión celular a través de un filtro de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar a 277 veces G durante cinco minutos a 25 grados centígrados para eliminar el medio. Lave y vuelva a suspender las células en uno o dos mililitros de PBS frío. Utilice una tinción con azul de tripsina al 0,4 % para contar las células viables en un hemocitómetro.Calcule el volumen necesario para obtener de dos a tres millones de celdas y transfiéralas al tubo de fax respectivo. La centrífuga contó las células a 277 veces G durante cinco minutos a 25 grados Celsius.Decantar el sobrenadante y volver a suspender las células en 300 microlitros de PBS. Añade de 0,5 a un microlitro de tinte zombi por tubo e incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad. Centrifugar las células: Lávelas con uno o dos mililitros de tampón de fax y vuelva a suspenderlas en 200 microlitros de tampón de fax. Agregue el bloqueador del receptor FC de acuerdo con el protocolo del fabricante e incube las células durante 10 minutos. Vuelva a centrifugar en los ajustes descritos anteriormente y lave las celdas con uno o dos mililitros de tampón de fax. Agregue el cóctel de anticuerpos e incube durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Después de la incubación, centrifugar y lavar las células con un tampón de fax de uno a dos mililitros. Agregue de 300 a 400 microlitros de solución de paraformaldehído al 2% y vuelva a suspender para su fijación. Almacene las celdas durante un par de días a cuatro grados centígrados o analícelas inmediatamente con un citómetro de flujo multicolor. En este estudio, se evaluó la actividad antitumoral del polianhídrido IL-1

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Evaluación de la actividad antitumoral in vivo de nanopartículas de polianhídrido IL-1α

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