Name: Un modelo de roedor isquémico de pericardio intacto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Aprende a inducir infarto de miocardio en ratones preservando el pericardio intacto. Este método permite evaluar el papel de la cavidad pericárdica en la reparación cardíaca y desarrollar estrategias terapéuticas.

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Para estos experimentos se utilizaron ratones machos y hembras C57BL / 6J entre 8-14 semanas de edad. Este protocolo ha recibido la aprobación ética del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Calgary y sigue todas las pautas de cuidado de los animales.
1. Preparación y cirugía del ratón
<ol><li>Esterilice las herramientas quirúrgicas (a través del esterilizador de cuentas o autoclave).</li>
	<li>Pesar el peso prequirúrgico del ratón y la dosis analgésica.</li>
	<li>Coloque el ratón en una caja de inducción con 4% de isoflurano y 800 mL/min de oxígeno. Confirme el plano anestésico pellizcando los dedos de los pies y observando al animal por falta de reflejo.</li>
	<li>Inyecte analgésico por vía subcutánea (0,1 mg/kg de buprenorfina) (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica calentada durante la cirugía y mantenga la anestesia con isoflurano al 3% administrado a través del cono de la nariz. Aplique ungüento oftálmico para evitar la sequedad de los ojos en cada ojo.</li>
	<li>Afeite el cabello de las áreas quirúrgicas del pecho y el cuello.</li>
	<li>Sujete las patas del ratón y colóquelas en la mesa quirúrgica.</li>
	<li>Intubar al ratón insertando un catéter 23 G de punta lisa en la tráquea a través de la boca y la faringe.<ol><li>Ventile el ratón después de la intubación con isoflurano al 2% y oxígeno al 100% como gas portador utilizando un ventilador comercial (consulte la Tabla de materiales) ajustado a una velocidad de 110 respiraciones/min, un volumen corriente de 250 μL y una presión espiratoria final positiva (PEEP) de 4 mmHg.</li>
	</ol></li>
	<li>Haga rodar el ratón 30% sobre su lado derecho para colocar el lado izquierdo del pecho para la cirugía.</li>
	<li>Limpie el área quirúrgica con 3 exfoliantes alternos de etanol al 70% y betadina con movimientos circulares (verTabla de materiales). Coloque cortinas quirúrgicas estériles alrededor del área quirúrgica.</li>
	<li>Haga una incisión lateral de 2-3 cm en la piel del tórax para visualizar los músculos pectorales en el lado izquierdo. Corte el pectoral mayor y menor usando una incisión de 1 cm desde la línea media hacia afuera para visualizar los músculos intercostales entre la tercera y cuarta costilla. NOTA: Se debe tener cuidado para evitar el sangrado excesivo del músculo pectoral a través de la cauterización de los vasos sangrantes.</li>
	<li>Haga una incisión de 2 cm en el músculo intercostal izquierdo para introducir aire (por movimiento pasivo de aire) en la cavidad torácica para permitir que el corazón y los pulmones se desprendan de la incisión quirúrgica. Además, expanda la abertura con la ayuda de un dispositivo de cauterio (ver Tabla de materiales) para incidir el intercostal y prevenir el sangrado. NOTA: El ventilador debe detenerse temporalmente durante el período de cauterización para evitar reacciones explosivas con oxígeno. Se tiene cuidado de no dañar el saco pericárdico.</li>
	<li>Usando retractores, retraiga las costillas para exponer el corazón.</li>
	<li>Observe el pericardio y el corazón subyacente bajo un microscopio estereoscópico. NOTA: El pericardio del ratón es lo suficientemente delgado como para visualizar la vasculatura del corazón.</li>
	<li>Coloque suavemente fórceps en la superficie del pericardio para reducir su movimiento y el del corazón subyacente.</li>
	<li>Visualmente marca la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) al rastrear su emergencia desde debajo del apéndice izquierdo.</li>
	<li>Usando el controlador de microagujas, guíe una sutura apropiada (ver Tabla de materiales) a través del pericardio, debajo del LAD, con la sutura emergiendo en el otro lado de la LAD y el pericardio. Ate la sutura para restringir el flujo sanguíneo a través de la arteria coronaria y recorte el exceso de sutura con la ayuda de tijeras (Figura 1A). NOTA: Al restringir el flujo sanguíneo a la arteria coronaria, el escaldado de la porción anterior del ventrículo izquierdo debe ser visible. Este procedimiento representa un modelo de ligadura permanente. Sin embargo, también se podría aplicar un enfoque de ligadura transitoria con diferentes períodos de isquemia en esta etapa.</li>
	<li>Debajo del sitio de la incisión dentro del área estéril, introduzca un catéter de 24 G por vía percutánea en el tórax (retire la aguja guía después de ingresar a la cavidad torácica). Luego, cierre las costillas seguidas de las capas musculares y la piel con una sutura adecuada (una aguja cónica para el músculo, una aguja de corte convencional para la piel).</li>
	<li>Una vez cerrado el tórax, evacuar el aire restante de la cavidad torácica a través del catéter 24 G mediante una succión suave con una jeringa de 3 ml y compresiones torácicas. Una vez retirado el aire, retire el catéter 24 G.</li>
	<li>Reducir el isoflurano al 1%.</li>
	<li>Apague el isoflurano mientras mantiene la ventilación con oxígeno para permitir que el ratón se recupere de la anestesia. Una vez que el animal muestre signos de respiración independiente, retire el tubo traqueal de 23 G de la boca y coloque al ratón en una jaula de recuperación para ser monitoreado para la reanudación de la respiración normal.</li>
	<li>Permita que el ratón se recupere en la jaula con una parte de la jaula colocada en una almohadilla de calentamiento para proporcionar una fuente de calor externa.</li>
	<li>Proporcionar inyecciones de mantenimiento de analgésico (Buprenorfina 0,1 mg/kg, por vía subcutánea) cada 12 h durante 72 h después de la cirugía.</li>
	<li>Controle el estado de salud de los ratones diariamente durante 7 días, lo que incluye evaluar las incisiones y las molestias de los animales. NOTA: Debido a la invasividad de este procedimiento (toracotomía), puede ser necesaria la administración de antibióticos.</li>
</ol>2. Evaluación funcional de la función cardíaca mediante ecocardiografía (ECG)
<ol><li>Inducir y mantener al ratón bajo anestesia general con isoflurano al 1,5-2% y 800 mL/min de oxígeno.</li>
	<li>Coloque el ratón en posición supina en una plataforma de escenario calentada y fije las patas a los cables del ECG.</li>
	<li>Afeite el pecho del ratón.</li>
	<li>Adquiera imágenes de ecocardiografía utilizando una sonda de transductor lineal de 40 MHz y un gel de contacto y analícelas con el software apropiado (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Apague el isoflurano y permita que el ratón se recupere en la plataforma de calefacción antes de devolver la jaula a un estado activo. NOTA: La evaluación ecocardiográfica no es invasiva y, por lo tanto, se puede realizar longitudinalmente durante todo el experimento para determinar cambios antes y después de la ligadura coronaria.</li>
</ol>3. Recolección de tejido cardíaco para la tinción de fibrosis
<ol><li>Sacrificar los ratones con inhalación de 100% deCO2 y diseccionar cuidadosamente el corazón. NOTA: Usando tijeras y fórceps, esto se logra cortando a través de los grandes vasos que entran (vena cava, vena pulmonar) y salen (arteria pulmonar, aorta) del corazón para liberarlo del sistema circulatorio en la cavidad torácica.</li>
	<li>Fijar el corazón en formalina al 10% durante al menos 24 h.</li>
	<li>Cortar muestras con una cuchilla de afeitar recta a través del ventrículo derecho, el tabique interventricular y el ventrículo izquierdo, asegurándose de que la incisión pasara por el centro de la zona del infarto. Luego, las muestras se envían a la instalación central para la incrustación de parafina.</li>
	<li>Corte secciones de tejido de 5 μm de espesor con un micrótomo y colóquelas en portaobjetos de vidrio para teñir.</li>
	<li>Deparafinar usando xileno comercial y lavados con alcohol clasificados (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) con agua desionizada, luego rehidratar.</li>
	<li>Tinción con rojo Sirius al 0,1% en ácido pícrico durante 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave las secciones con ácido acético al 0,5% durante 3 min y enjuague con etanol al 70% durante 1 min.</li>
	<li>Deshidratar las secciones utilizando el orden inverso de los lavados descritos en 3.4, con concentraciones de etanol crecientes y graduadas y luego xileno.</li>
	<li>Monte secciones de tejido con una solución de montaje (consulte la Tabla de materiales) para su evaluación microscópica.</li>
</ol>4. Citometría de flujo del corazón y lavado de la cavidad pericárdica
<ol><li>Sacrificar los ratones con inhalación de 100% deCO2 para que surta efecto.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre su espalda y fije los brazos y las piernas a una tabla quirúrgica con cinta adhesiva.</li>
	<li>Abra cuidadosamente el lado izquierdo (lado derecho desde la vista del experimentador) de la cavidad torácica, comenzando cortando el diafragma hasta aproximadamente el punto medio y posteriormente cortando a través de las costillas externas hacia el esternón. NOTA: Evite cortar los vasos sanguíneos grandes, particularmente aquellos que corren paralelos al esternón.</li>
	<li>Retraiga las costillas usando un hemostático para exponer el corazón subyacente y el pericardio. NOTA: El pericardio es muy frágil, así que asegúrese de no atraparlo con tijeras durante el corte.</li>
	<li>Usando un tubo PE-10 (consulte la Tabla de materiales) insertado en el espacio pericárdico cerca de la unión de la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo, inyecte 100 μL de solución salina estéril en la cavidad pericárdica.<ol><li>Permita que la solución salina se acumule y se acumule desde el lado posterior del corazón, teniendo cuidado de no perforar o desgarrar el pericardio en el proceso. Repita este paso dos veces y coloque líquido de lavado en hielo mientras procesa el corazón.</li>
	</ol></li>
	<li>Extirpe el corazón cortando los vasos principales (aorta, arteria pulmonar, vena y vena cava) que entran y salen del corazón. Retire las aurículas derecha e izquierda y pese el tejido cardíaco ventricular.</li>
	<li>Picar el tejido en piezas pequeñas de 1 mm2 con tijeras y colocar en 10 ml de tampón de digestión que contenga 450 U/ml de colagenasa I, 125 U/ml de colagenasa XI, 60 U/ml de DNasa I y 60 U/ml de hialuronidasa en PBS durante 1 h a 37 °C en un agitador orbital.</li>
	<li>Pasar los homogeneizados del tejido cardíaco a través de un filtro celular de 70 μm (consulte la Tabla de materiales) y girar hacia abajo a 60 x g durante 5 minutos a 4 °C para eliminar las células del parénquima cardíaco.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante, pasar a través de un filtro de células de 40 μm (ver Tabla de materiales) para una suspensión de una sola celda, y girar hacia abajo a 400 x g durante 5 min a 4 °C para granular las células.</li>
	<li>Realizar el bloqueo del receptor cristalizable de fragmentos (Fc) y la tinción de marcadores celulares en células pericárdicas y cardíacas como se describió anteriormente8.</li>
	<li>Ejecute muestras en un citómetro de flujo.</li>
</ol>5. Etiquetado de macrófagos pericárdicos utilizando el método Intercostal Approach to the Pleural Space (ICAPS)9
<ol><li>Esterilice las herramientas quirúrgicas (a través de un esterilizador de cuentas o autoclave) y rocíe etanol al 70% antes de comenzar.</li>
	<li>Inducir y mantener al ratón bajo anestesia general con isoflurano al 1,5-2% y 800 mL/min de oxígeno. Confirme el plano anestésico pellizcando los dedos de los pies y observando al animal por falta de reflejo.</li>
	<li>Inyectar analgésico por vía subcutánea (Buprenorfina 0,1 mg/Kg).</li>
	<li>Coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica caliente durante la cirugía.</li>
	<li>Afeitar el área torácica anterolateral derecha.</li>
	<li>Limpie el área quirúrgica con etanol y betadina.</li>
	<li>Haga una incisión de 3 cm de largo en la piel y, con fórceps, exponga la caja torácica.</li>
	<li>Cargue 5 μL de perlas fluorescentes (microesferas fluorescentes disponibles comercialmente, 1 μm, consulte la Tabla de materiales) y 45 μL de solución salina en un catéter de jeringa de tubo PE-10 con una punta biselada.</li>
	<li>Guíe el catéter hacia el espacio intercostal como se describió anteriormente9, inyecte lentamente la solución de perlas y retire el catéter con un solo movimiento.</li>
	<li>Cierre la piel con grapas. NOTA: Se utilizan grapas en lugar de suturas para minimizar la posible reapertura de la incisión.</li>
	<li>Apague el isoflurano, coloque el ratón en la jaula de recuperación y controle las complicaciones durante las primeras 24 h.</li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141, 139(2020).</li>
<li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3 (6), eCollection 2018 (2018).</li>
<li>Bayat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+heart+failure+after+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Progressive heart failure after myocardial infarction in mice.</a> Basic Research in Cardiology. 97 (3), 206-213 (2002).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. 52, 2581(2011).</li>
<li>De Villiers, C., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+myocardial+infarction%3A+comparing+permanent+ligation+and+ischaemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion.</a> Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).</li>
<li>Borlaug, B. A., Reddy, Y. N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pericardium+in+heart+failure%3A+Implications+for+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">The role of the pericardium in heart failure: Implications for pathophysiology and treatment.</a> JACC Heart Failure. 7 (7), 574-585 (2019).</li>
<li>Pfaller, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+pericardium+for+cardiac+biomechanics%3A+from+physiology+to+computational+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+in+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">The importance of the pericardium for cardiac biomechanics: from physiology to computational modeling.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 18 (2), 503-529 (2019).</li>
<li>Deniset, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata6%28%2B%29+Pericardial+Cavity+Macrophages+Relocate+to+the+Injured+Heart+and+Prevent+Cardiac+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Gata6(+) Pericardial Cavity Macrophages Relocate to the Injured Heart and Prevent Cardiac Fibrosis.</a> Immunity. 51 (1), 131-140 (2019).</li>
<li>Weber, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+targeting+of+the+pleural+space+by+intercostal+approach%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune targeting of the pleural space by intercostal approach.</a> BMC Pulmonary Medicine. 15, 14(2015).</li>
<li>Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardium+of+rodents%3A+pores+connect+the+pericardial+and+pleural+cavities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities.</a> The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).</li>
<li>Tyberg, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+pericardial+pressure+and+right+atrial+pressure%3A+an+intraoperative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The relationship between pericardial pressure and right atrial pressure: an intraoperative study.</a> Circulation. 73, 428-432 (1986).</li>
<li>Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+left+and+right+pericardial+pressures+in+humans%3A+an+intraoperative+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).</li>
<li>Park, D. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pericardial+proteoglycan+4+%28lubricin%29%3A+Implications+for+postcardiotomy+intrathoracic+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human pericardial proteoglycan 4 (lubricin): Implications for postcardiotomy intrathoracic adhesion formation.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (4), 1598-1608 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Inducir un IM en un pericardio cerrado en roedores es único y puede tener aplicaciones potencialmente significativas. El procedimiento depende en gran medida de la familiaridad del cirujano con el modelo de roedor y la anatomía cardíaca del roedor. El éxito también depende de la atención brindada durante tres pasos críticos: incisión del músculo intercostal y retracción de las costillas (Pasos 1.11-1.13), creación del infarto (Paso 1.17) y recuperación animal (Pasos 1.22-1.24).
La toracotomía ...

Hasta el día de hoy, la enfermedad cardiovascular (ECV) es reconocida como la principal causa de muerte a nivel mundial, lo que resulta en una carga financiera significativa y una reducción en la calidad de vida del paciente1. La enfermedad arterial coronaria (EAC) es un subtipo de ECV y desempeña un papel esencial en el desarrollo del infarto de miocardio (IM), que es un contribuyente principal a la mortalidad. Por definición, el IM resulta de una lesión irreversible en el tejido miocárdico debido a condiciones prolongadas de isquemia e hipoxia. El tejido miocárdico carece de capacidad de regeneración, por lo que las lesiones son permanentes y resultan en el reemplazo del músculo cardíaco con una cicatriz fibrótica que puede ser inicialmente protectora, pero que finalmente contribuye a la remodelación cardíaca adversa y eventual insuficiencia cardíaca2.
Aunque el tratamiento de los pacientes con EAC ha mejorado drásticamente en las últimas décadas, la insuficiencia cardíaca crónica (ICC) secundaria a la isquemia afecta a muchos pacientes en todo el mundo. Para prevenir y manejar esta epidemia, es necesario comprender los mecanismos subyacentes más ampliamente y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. Además, los hallazgos anteriores destacan las limitaciones de la terapia sistémica y la necesidad de desarrollar alternativas precisas. Dado que la investigación de las secuelas moleculares del IM en humanos se ve afectada por la capacidad de acceder al tejido infartado, los modelos animales que recapitulan las características y el desarrollo del IM humano y la ICC relacionados con la ECV son indispensables.
Como los modelos animales ideales se parecen mucho a un trastorno humano por sus características estructurales y funcionales, la etiología de la enfermedad debe guiar su concepción. En la EAC, es la estenosis aterosclerótica crónica de las arterias coronarias u oclusión trombótica aguda. Se han desarrollado y aplicado diferentes métodos en varias especies de animales de laboratorio para inducir el estrechamiento u oclusión de la arteria coronaria. Tales estrategias se pueden clasificar ampliamente en dos grupos: (1) manipulación mecánica de una arteria coronaria para inducir un IM y (2) aterosclerosis acelerada para facilitar el estrechamiento coronario que conduce a un IM. La primera estrategia generalmente implica la ligadura de una arteria coronaria o la colocación de un stent dentro de la arteria. El segundo enfoque tiende a depender de la modificación de la dieta del animal para incluir alimentos altos en grasa / colesterol. Algunas de las limitaciones de este último enfoque incluyen la falta de control sobre el momento y el sitio de las oclusiones coronarias.
Por el contrario, la inducción quirúrgica de IM o isquemia en un modelo animal tiene varias ventajas, como la ubicación, el momento preciso y la extensión del evento coronario, lo que lleva a resultados más reproducibles. El método más utilizado es la ligadura quirúrgica de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD). Tales modelos recapitulan las respuestas humanas a la lesión isquémica aguda, así como la progresión a CHF3. Inicialmente desarrollada en animales más grandes, la cirugía LAD en animales pequeños como roedores se ha vuelto más factible con los avances en la tecnología4. Al establecer tales modelos, los ratones han sido favorecidos por varias razones, incluida su disponibilidad relativa, bajo costo en vivienda y su capacidad de manipulación genética.
Los modelos quirúrgicos contemporáneos de cardiopatía isquémica que utilizan la oclusión LAD requieren que el investigador abra el pericardio para ligar temporal o permanentemente la arteria5. Tales estrategias resultan en la interrupción del espacio pericárdico, que desempeña una función esencialmente mecánica y lubricante para garantizar una función cardíaca adecuada. Otra desventaja de abrir el pericardio es perder el líquido pericárdico nativo del animal con sus diversos componentes celulares y proteicos 6,7. En respuesta, desarrollamos un método para inducir IM mientras mantenemos intacto el pericardio. Además de minimizar la perturbación de este entorno homeostático, este enfoque permite etiquetar y rastrear células específicas después de causar un IM. Además, este enfoque representa mejor la lesión isquémica miocárdica en el entorno humano.

<table><tbody><tr><td>Esterilizador de perlas Steri-350</td><td>Inotech</td><td>NC9449759</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Filtro de celdas</td><td>VWR</td><td>CA21008-949</td><td>Falcon, 352340</td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro de células</td><td>VWR</td><td>CA21008-952</td><td>Falcon, 352350</td></tr><tr><td>ACK Tampón de lisis</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte-W Aguja de catéter 24 G x 3/4"</td><td>CDMV Inc</td><td>108778</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (solución tópica de povidona yodada al 10%)</td><td>CDMV Inc</td><td>Pinzas</td> romas 104826 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11000-12</td><td></td></tr><tr><td>BNP Ungüento oftálmico</td><td>CDMV Inc</td><td>17909</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Controlador de aguja</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa I</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCR103</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa XI</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 5-0 Sutura de polisorbí - CV-11 aguja cónica</td><td>Medtronic Canada</td><td>GL-890</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 5-0 Sutura Polysorb - PC-13 aguja de corte</td><td>Medtronic Canada</td><td>SL-1659</td><td></td></tr><tr><td>Pinza roma curva</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Dako Medio de montaje</td><td>Agilen</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 100%</td><td>Millipore Sigma</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon 8-0 Sutura Ethilon - BV-130-4 aguja cónica</td><td>Johnson & Johnson Inc.</td><td>2815G</td><td></td></tr><tr><td>Fibra óptica</td> ligera <td>Nikon</td><td>2208502</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>FST 11150-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite&reg; Microesferas de carboxilato YG 1.00 y micro; m</td><td>Policiencias, Inc.</td><td>15702</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de cauterización térmica Geiger</td><td>World Precision Instruments</td><td>501293</td><td>modelo 150-ST</td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4272</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador de isofluorano</td><td>Aparato Harvard</td><td>75-0951</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano USP, 250 mL</td><td>CDMV Inc</td><td>108737</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de retracción del fijador magnético</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>MX550D- Sonda de 40 MHz</td><td>Fujifilm- Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle Driver</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12002-12</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 Tubing</td><td>Braintree Scienctific, Inc.</td><td>PE10 50 FT</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Herramientas de Ciencia Fina FST</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>SMZ-1B Microscopio Estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ1-PS</td><td></td></tr><tr><td>VentElite Ventilador para Animales</td><td>Pequeños Harvard Apparatus</td><td>55-7040</td><td></td></tr><tr><td>Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorfina))</td><td>CDMV Inc 124918</td><td></td><td>medicamento controlado</td></tr><tr><td>Vevo 2100 Software</td><td>Fujifilm-Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de roedor isquémico de pericardio intacto

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

Este protocolo ha demostrado que el pericardio y su contenido juegan un papel antifibrótico esencial en el modelo de roedor isquémico (ligadura coronaria para inducir lesión miocárdica). La mayoría de los modelos preclínicos de infarto de miocardio requieren la interrupción de la integridad pericárdica con pérdida del medio celular homeostático. Sin embargo, recientemente hemos desarrollado una metodología para inducir el infarto de miocardio, que minimiza el daño pericárdico y retiene la población de células inmunes residentes del corazón. Se ha observado una mejor recuperación funcional cardíaca en ratones con un espacio pericárdico intacto después de la ligadura coronaria. Este método proporciona una oportunidad para estudiar las respuestas inflamatorias en el espacio pericárdico después del infarto de miocardio. El desarrollo adicional de las técnicas de etiquetado se puede combinar con este modelo para comprender el destino y la función de las células inmunes pericárdicas en la regulación de los mecanismos inflamatorios que impulsan la remodelación en el corazón, incluida la fibrosis.

Este modelo de ligadura coronaria modificado ha sido optimizado para lograr la reproducibilidad y la supervivencia animal. Sin embargo, debido a la lesión significativa inducida en el corazón, se asocia cierta mortalidad intraoperatoria y postoperatoria esperada con el procedimiento. La mortalidad estándar es típicamente mayor en hombres (~ 25-35%) que en mujeres (~ 10-15%).
La inducción exitosa de un IM con la ligadura coronaria modificada debe ser evidente por cambios en los parámetros funci...

Este protocolo describe los pasos para inducir el infarto de miocardio en ratones mientras se preserva el pericardio y su contenido.

Un modelo de roedor isquémico de pericardio intacto

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

Este método nos permitirá evaluar el papel de la cavidad pericárdica que rodea el corazón y su contenido en la reparación cardíaca tras un infarto de miocardio. En comparación con los métodos convencionales de ligadura coronaria para modelar el infarto de miocardio, nuestro método mantiene intacta la cavidad pericárdica, lo que permite la determinación del contenido y rastrea sus funciones después de una lesión isquémica cardíaca. Comprender la contribución de la cavidad pericárdica y la respuesta a la lesión del corazón proporcionará información importante sobre las estrategias terapéuticas que se dirigen al pericardio para mejorar la curación del corazón.Para comenzar con la anestesia posterior, sujete las patas del ratón y colóquelo en la mesa quirúrgica. Después de preparar al ratón para la cirugía como se describe en el manuscrito, ventile el ratón con 2% de isoflurano y 100% de oxígeno como gas portador utilizando un ventilador comercial. Luego establezca una velocidad de 110 respiraciones por minuto, un volumen corriente de 250 microlitros y una presión espiratoria final positiva de cuatro milímetros de mercurio.Haga rodar el ratón 30% sobre su lado derecho para colocar el lado izquierdo del pecho para la cirugía. Luego haga una incisión lateral de dos a tres centímetros en la piel del pecho para visualizar los músculos pectorales en el lado izquierdo. Haga una incisión de un centímetro desde la línea media hacia afuera para cortar el pectoral mayor y menor.Evite el sangrado excesivo durante la cauterización de los vasos sangrantes. Visualiza los músculos intercostales entre la tercera y cuarta costilla. Haga una incisión de dos centímetros en el músculo intercostal izquierdo para introducir aire en la cavidad torácica y permitir que el corazón y los pulmones se desprendan de la incisión.Para incidir el intercostal sin sangrado, detenga temporalmente el ventilador y expanda la abertura con un dispositivo de cauterio. Usando retractores, retraiga las costillas para exponer el corazón. Luego observe el pericardio y el corazón subyacente bajo un microscopio estéreo.Coloque suavemente los fórceps en la superficie del pericardio para reducir el pericardio y el movimiento subyacente del corazón. Visualmente hito de la arteria coronaria LAD mediante el seguimiento de su aparición debajo del apéndice izquierdo. Usando el controlador de microagujas, guíe una sutura apropiada a través del pericardio debajo del LAD.Observe la sutura que emerge en el otro lado de la LAD y el pericardio. Representando el modelo de ligadura permanente, ate la sutura para restringir el flujo sanguíneo a través de la arteria coronaria, haciendo visible el escaldado de la porción anterior del ventrículo izquierdo. Luego recorte el exceso de sutura con la ayuda de tijeras.Proporcionar inyecciones de mantenimiento de analgésico por vía subcutánea cada 12 horas durante 72 horas después de la cirugía. Después de reducir el isoflurano al 1%, apague el isoflurano mientras mantiene la ventilación con oxígeno. Una vez que el animal muestre signos de respiración, retire el tubo traqueal de calibre 23 de la boca y coloque al ratón en una jaula de recuperación para controlar la reanudación de la respiración.Permita que el ratón se recupere en la jaula con una parte de la jaula colocada en una almohadilla de calentamiento para proporcionar una fuente de calor externa. Controle el estado de salud del ratón diariamente durante siete días evaluando las incisiones y las molestias de los animales. Si es necesario, administre antibióticos para una recuperación exitosa después de la cirugía invasiva.Después de mantener al ratón bajo anestesia general con oxígeno, coloque el ratón en posición supina en una plataforma de escenario calentada y conecte las patas a los cables del ECG. Luego roza el pecho. Adquiera imágenes de ECG utilizando sonda de transductor y gel de contacto y analícelas con el software apropiado.Después de la evaluación no invasiva del ECG, apague el isoflurano y devuelva el ratón a la jaula. Fijar el corazón en formalina al 10% durante al menos 24 horas. Corte la muestra con una cuchilla de afeitar recta a través del ventrículo derecho, el tabique interventricular y el ventrículo izquierdo, asegurándose de que la incisión pase por el centro de la zona del infarto.Y luego la parafina incrusta las muestras de tejido. Las secciones cortadas se colocan en un casete de montaje para una mayor incrustación de parafina y la posterior sección en secciones de cinco micrómetros de espesor. Después de la colocación de secciones de tejido en portaobjetos, desparafinar usando tolueno y lavados con alcohol graduado con agua desionizada.Luego rehidratar. A continuación, tiñe la sección con 0,1% de rojo sirio en ácido pícrico durante dos horas a temperatura ambiente. Lave la sección con ácido acético al 0,5% durante tres minutos, seguido de enjuague con etanol al 70% durante un minuto.Deshidratar la sección utilizando el orden inverso de los lavados con concentraciones de etanol crecientes y graduadas antes de montarlas para una evaluación microscópica. La inducción exitosa del infarto de miocardio con la ligadura coronaria modificada se evaluó mediante el examen de los parámetros funcionales del corazón y las características estructurales. Para la función, la disminución de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo se evaluó mediante ecocardiografía dentro de las tres a cuatro semanas posteriores al infarto de miocardio.La tinción histológica demostró que los cambios funcionales se acompañaron de fibrosis significativa de la pared del ventrículo izquierdo, que se confirmaron aún más mediante la cuantificación de la fibrosis teñida de rojo picrosirius en las secciones transversales del corazón a las cuatro semanas después del infarto con los modelos de ligadura coronaria pericárdica interrumpida o intacta. La combinación del método de etiquetado de perlas fluorescentes con el análisis de citometría de flujo proporcionó un enfoque para rastrear los macrófagos pericárdicos positivos de Gata6 residentes. Es importante destacar que se detectó poco o ningún etiquetado en el corazón o la sangre.Después del infarto de miocardio, la reubicación de las células se puede rastrear mediante citometría de flujo e imágenes. Se muestra la cuantificación de las células mieloides pericárdicas marcadas con perlas fluorescentes con o sin infarto de miocardio. Se necesita cuidado para evitar interrumpir o desgarrar inadvertidamente el pericardio delgado durante el procedimiento.Este método se puede combinar con el rastreo del linaje celular o el bloqueo efector, lo que permitirá rastrear y determinar el impacto del componente pericárdico en la respuesta de curación en el corazón infartado. Hemos identificado que la cavidad pericárdica protege el corazón después de una lesión, que está parcialmente mediada por macrófagos pericárdicos residentes. Este enfoque abre una nueva área de investigación para la enfermedad cardiovascular.

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Investigación

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El modelo de rata con infarto agudo de miocardio (IAM) es útil para estudiar las consecuencias de un infarto de miocardio en la función cardíaca fisiopatológicos y fisiológicos.

Infarto agudo de miocardio en ratas

El trauma quirúrgico induce una respuesta inflamatoria. Las citocinas y los ligandos endógenos se sabe que modulan el tamaño del infarto de miocardio después de la isquemia y la reperfusión. Se presenta una versión modificada de tórax cerrado, el modelo murino de isquemia y reperfusión con pesas colgantes para minimizar los efectos de la toracotomía.

Un murino tórax cerrado modelo de isquemia y reperfusión miocárdica

El objetivo de este protocolo es evaluar el aturdimiento miocárdico tras un paro cardiopléjico isquémico en roedores.

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Los modelos de corazón de trabajo aislados se pueden utilizar para medir el efecto de las condiciones de carga, la frecuencia cardíaca y los medicamentos sobre el rendimiento miocárdico y el consumo de oxígeno. Describimos métodos para la preparación de un modelo de trabajo de corazón izquierdo en roedores que permite estudiar el rendimiento sistólico y diastólico y el consumo de oxígeno en diversas condiciones.

Roedor de Trabajo Modelo del corazón para el estudio sobre los resultados de miocardio y el consumo de oxígeno

Durante la cirugía de isquemia/reperfusión miocárdica murina, la colocación correcta de la ligadura oclusiva suele confirmarse mediante la observación visible de la palidez miocárdica. En este trabajo, se demuestra un método de confirmación electrocardiográfica de la isquemia y la reperfusión, para complementar la palidez miocárdica observada, en ratones machos C57Bl/6.

La confirmación de la isquemia miocárdica y reperfusión en ratones utilizando electrocardiografía de superficie del cojín

Aquí se describe un procedimiento quirúrgico que muestra cómo lograr la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente izquierda-anterior en ratones. Este modelo es de gran relevancia para investigar la fisiopatología del infarto de miocardio y los procesos biológicos concomitantes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Este artículo presenta un método eficiente para realizar isquemia miocárdica y posterior reperfusión crónica en ratas utilizando un enfoque mínimamente invasivo. Además, la función hemodinámica ventricular izquierda de las ratas se evalúa mediante ecocardiografía y métodos aislados del corazón de trabajo.

Método invasivo semiseminal para inducir el infarto de miocardio en ratas y la evaluación de la función cardíaca mediante un sistema cardíaco de trabajo aislado

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Modelo mejorado de roedores de isquemia miocárdica y lesión por reperfusión

El presente estudio demuestra un modelo animal altamente reproducible de isquemia miocárdica regional aguda y lesión por reperfusión en conejos utilizando una minitoracotomía izquierda para los casos de supervivencia o una esternotomía de línea media para los casos de no supervivencia.

Modelo de lesión por isquemia y reperfusión en conejos

Un método de transferencia génica para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca isquémica se describe usando un modelo porcino de infarto de miocardio. Nuestro método simple y reproducible que nos permite evaluar fácilmente la eficacia de la transferencia de genes diferentes con una forma muy sencilla y reproducible.

Transferencia génica para la insuficiencia cardiaca isquémica en un modelo preclínico

Aprende a inducir infarto de miocardio en ratones preservando el pericardio intacto. Este método permite evaluar el papel de la cavidad pericárdica en la reparación cardíaca y desarrollar estrategias terapéuticas.

Un modelo de roedor isquémico de pericardio intacto

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