Name: Un modelo de ratón eficaz de lesión unilateral por isquemia-reperfusión renal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprende a establecer un modelo de lesión por isquemia-reperfusión renal unilateral en ratones para estudiar cambios morfológicos secuenciales. Este método permite evaluar daño tubular y progresión de fibrosis con alta reproducibilidad.

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Una parte del trabajo que se muestra en este artículo fue fundada por el Centro de Investigación Integrativa de Mamíferos de la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad de Ross (RUSVM), San Cristóbal y Nieves. La ayuda financiera proporcionada por el Departamento de Ciencias Biomédicas Veterinarias de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Long Island es muy apreciada.

El siguiente protocolo describe una cirugía de supervivencia. Por lo tanto, se aplica la más alta práctica aséptica y quirúrgica. Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Para eliminar las diferencias basadas en el género y la cepa en los efectos del IRI, solo se utilizaron ratones machos C57BL6 en el estudio. Todos los animales fueron emparejados en edad y peso para producir resultados comparables.
1. Preparación
NOTA: En la Figura 1A se muestra una línea de tiempo de las diferentes fases e intervenciones experimentales.
<ol><li>Limpie y desinfecte la mesa quirúrgica antes de cada procedimiento. Prepare y coloque todos los materiales necesarios (instrumentos esterilizados e hisopos de algodón, gasas y cortinas estériles, anestésicos prediluidos, almohadilla térmica, abrazadera vascular esterilizada, solución salina estéril y antisépticos y suturas para la piel) en la mesa quirúrgica (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Anestesiar ratones machos C57BL6 (rango de edad 11-13 semanas) mediante inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (100 mg/kg y 20 mg/kg de peso corporal, respectivamente, previamente diluidos en solución salina estéril). NOTA: El manejo hábil de animales es esencial para minimizar el estrés para el animal, ya que las respuestas al estrés pueden afectar negativamente la acción de los anestésicos.</li>
	<li>Después de la administración de ketamina/xilazina, afeitarse el área quirúrgica en el flanco derecho con una cuchilla de afeitar y jabón. NOTA: Afeitarse la piel mejora la cicatrización de heridas, así como los resultados generales de las cirugías de supervivencia.</li>
	<li>Desinfecte la piel en el área quirúrgica con alcohol al 70% primero y luego con solución de povidona yodada con un hisopo de algodón.</li>
	<li>Después de la preparación de la piel, coloque el ratón en una mesa de calentamiento en posición de decúbito ventral y estabilice la temperatura corporal a 37 ° C (monitoreado a través de sondas de sensor rectal y de almohadilla). NOTA: Los riñones son de más fácil acceso y se exponen quirúrgicamente cuando se colocan en el decúbito ventral en lugar de lateral.</li>
	<li>Mientras la temperatura corporal se estabiliza, aplique ungüento para los ojos del ratón. NOTA: Los anestésicos disociativos, como la ketamina, hacen que los ojos del animal permanezcan abiertos mientras está anestesiado.</li>
</ol>2. Cirugía
<ol><li>Una vez que los reflejos de dolor están ausentes (pellizco del dedo del pie con pinzas), realice una incisión quirúrgica dorso-lateral de aproximadamente 1 cm en el flanco derecho utilizando una cuchilla de bisturí. Comience la incisión detrás de la última costilla y continúe caudalmente aproximadamente 1 cm paralelo a la línea media lumbar.</li>
	<li>Transecta la musculatura abdominal usando tijeras para visualizar el espacio retroperitoneal. Retire las pequeñas cantidades de sangre producidas durante la seccionamiento de los músculos utilizando hisopos de algodón estériles. NOTA: Debido a que se utiliza el abordaje dorso-lateral, se accede al retroperitoneo, y no a la cavidad peritoneal, con este procedimiento.</li>
	<li>Empuje el riñón derecho fuera de la cavidad abdominal. Use fórceps Graefe para exponer el riñón con cuidado. NOTA: Siempre mantenga los fórceps cerrados para evitar lesiones traumáticas en el riñón cuando se coloque en el abdomen y úselo solo para empujar y guiar cuidadosamente el riñón hacia la incisión quirúrgica y fuera de ella.</li>
	<li>Exponga lentamente el riñón derecho e identifique el pedículo renal. Retire con cuidado el tejido adiposo alrededor del pedículo.</li>
	<li>Para inducir isquemia, coloque la pinza vascular sobre la arteria renal y la vena presente en el pedículo renal, evitando el pinzamiento del uréter adyacente. Use un hemostático Halsted-Mosquito para manipular la pinza vascular. NOTA: La isquemia se confirma mediante la visualización de un cambio en el color del riñón de rojo-rosa a púrpura oscuro (Figura 1B).</li>
	<li>Cubra el riñón sujetado con una gasa estéril empapada en solución salina para evitar la desecación y déjelo durante 30 min.</li>
	<li>Controle la profundidad de la anestesia y la humedad de la gasa periódicamente durante este tiempo. NOTA: La dosis de inducción de la anestesia es suficiente para proporcionar analgesia hasta el final del evento isquémico; por lo tanto, no se requieren inyecciones anestésicas adicionales.</li>
	<li>Poco antes del final del período de isquemia, retire la gasa y descubra el riñón. Sostenga el hemostático Halsted-Mosquito, listo para la extracción de la abrazadera.</li>
	<li>En el minuto 30, abra la pinza vascular con el hemostático y retírela del pedículo renal para permitir la reperfusión del riñón. NOTA: La reperfusión se confirma mediante la visualización de un cambio en el color del riñón de púrpura oscuro a rojo-rosa (Figura 1C).</li>
	<li>Realice los mismos procedimientos descritos anteriormente para animales simulados sin pinzamiento del pedículo renal.</li>
	<li>Después de la verificación del cambio de color del riñón, devuelva el riñón a la cavidad abdominal. Cierre los músculos abdominales con sutura absorbible 5-0 usando un patrón cruzado. NOTA: Se puede requerir una segunda inyección de anestésicos para mantener la analgesia durante la sutura de los músculos y la piel. La mitad de la dosis inicial ha demostrado ser eficaz en la prestación de analgesia hasta la conclusión de la cirugía.</li>
	<li>Cierre la piel con sutura absorbible 5-0 utilizando un patrón de colchón horizontal. Limpie la herida con una solución de povidona yodada con un hisopo de algodón.</li>
</ol>3. Recuperación y postoperatorio
NOTA: Como el tiempo postquirúrgico es el tiempo de reperfusión real, la atención postquirúrgica adecuada es éticamente obligatoria y científicamente relevante. Los tiempos de reperfusión se pueden seleccionar según lo requiera el investigador. Se comparan tiempos de reperfusión de 4 h, 8 h, 16 h, 1 día, 2 días, 4 días y 7 días para obtener una visión general secuencial de los cambios patológicos inducidos por el IIR renal.
<ol><li>Mantenga el ratón en la almohadilla térmica hasta que comience a recuperarse de la anestesia. NOTA: Se recomienda esperar hasta que el ratón comience a mover sus patas e intente moverse. En los casos en que se requieren inyecciones anestésicas adicionales durante la cirugía, el tiempo de recuperación es más largo. El atipamezol, un antagonista del receptor alfa-2, se puede administrar a una dosis de 0,5 mg/kg de peso corporal por vía intraperitoneal para revertir los efectos de la xilazina y acortar la fase de recuperación. Para el manejo del dolor, la buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal, por vía intraperitoneal) se administra antes de la operación y cada 6 horas durante la fase de recuperación y postquirúrgica. Se desaconseja el uso de medicamentos antiinflamatorios no esteroideos ya que varios medicamentos de esta familia inducen nefrotoxicidad y, por lo tanto, pueden alterar los resultados.</li>
	<li>Después de la recuperación de la anestesia, coloque al ratón de nuevo en su jaula con acceso libre al agua y los alimentos. NOTA: El puré de alimentos se puede proporcionar en una placa de Petri, así como material para esconderse y jugar (por ejemplo, hojas de papel, tubos de toallas de papel).</li>
	<li>Monitoree al ratón diariamente para evaluar la cicatrización de heridas, la ingesta de alimentos y agua, el peso corporal y el comportamiento. NOTA: El estado de cicatrización de la herida se evaluó utilizando la siguiente escala: 1, seco; 2, mojado; 3, parcialmente abierto; 4, abierto. La cicatrización rápida de heridas se documentó en este estudio, con más del 90% de las heridas secas después del día 2.</li>
</ol>4. Eutanasia y recogida de muestras
<ol><li>Eutanasiar a los ratones con pentobarbital de sodio administrado por vía intraperitoneal a una dosis que es el doble de la dosis anestésica para ratones (100 mg/kg).</li>
	<li>Recolecte muestras de líquidos y tejidos según sea necesario. NOTA: Se recolectaron ambos riñones, sangre total (para el recuento de células sanguíneas), suero (para la bioquímica de la sangre), orina, el corazón y los pulmones. Se necesitan algunos microlitros de suero para el análisis de bioquímica sanguínea (nitrógeno ureico en sangre (BUN), creatinina, electrolitos). Si es necesario, 24 h antes de la eutanasia, los ratones pueden ser colocados en jaulas metabólicas para recoger un mayor volumen de orina que permita la determinación de los parámetros de la función renal.</li>
</ol>

<ol><li>Ray, S. C., Mason, J., O'Connor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+renal+injury%3A+can+renal+anatomy+and+associated+vascular+congestion+explain+why+the+medulla+and+not+the+cortex+is+where+the+trouble+starts%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Ischemic renal injury: can renal anatomy and associated vascular congestion explain why the medulla and not the cortex is where the trouble starts.</a> Seminars in Nephrology. 39 (6), 520-529 (2019).</li>
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<li>Ratliff, B. B., Abdulmahdi, W., Pawar, R., Wolin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidant+mechanisms+in+renal+injury+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Oxidant mechanisms in renal injury and disease.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 25 (3), 119-146 (2016).</li>
<li>Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%3A+definitions%2C+diagnosis%2C+pathogenesis%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure: definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114 (1), 5-14 (2004).</li>
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<li>Wei, Q., Dong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+ischemic+acute+kidney+injury%3A+technical+notes+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).</li>
<li>Gaut, J. P., Liapis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+pathology+and+pathophysiology%3A+a+retrospective+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Kidney+Journal%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury pathology and pathophysiology: a retrospective review.</a> Clinical Kidney Journal. 14 (2), 526-536 (2021).</li>
<li>Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+renal+ischemia-reperfusion+as+a+robust+model+for+acute+to+chronic+kidney+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice.</a> PLoS One. 11 (3), 0152153(2016).</li>
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<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (78), e50495(2013).</li>
<li>Hesketh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+ischaemia+reperfusion+injury%3A+a+mouse+model+of+injury+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51816(2014).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mouse+model+of+chronic+kidney+disease+transitioned+from+ischemic+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">New mouse model of chronic kidney disease transitioned from ischemic acute kidney injury.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 286-295 (2019).</li>
<li>Basile, D. P., Leonard, E. C., Tonade, D., Friedrich, J. L., Goenka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+effects+on+long-term+function+of+injured+and+contralateral+kidneys+following+unilateral+renal+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distinct effects on long-term function of injured and contralateral kidneys following unilateral renal ischemia-reperfusion.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 302 (5), 625-635 (2012).</li>
<li>Polichnowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+unilateral+ischemia-reperfusion+injury%3A+importance+of+renal+counterbalance+and+implications+for+the+AKI-CKD+transition%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of unilateral ischemia-reperfusion injury: importance of renal counterbalance and implications for the AKI-CKD transition.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (5), 1086-1099 (2020).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses con respecto a este artículo.

Los modelos de IRI renal de ratón son populares en la investigación biomédica debido a sus costos operativos relativamente bajos y la disponibilidad de diversos modelos transgénicos12. El modelo de IIR renal unilateral presentado aquí imita los cambios patológicos característicos observados en la IIR renal humana, como la dilatación tubular, la necrosis y la fibrosis13. Estos resultados se basan en tiempos de reperfusión variables.
Los pasos críticos de este protocolo incluyen el mantenimiento de la temperatura corporal constante y la colocación correcta de la pinza vascular en el pedículo renal. La temperatura corporal influye en el metabolismo del animal14, alterando los resultados experimentales tanto a nivel fisiológico como celular15. En este modelo, la temperatura corporal se estabilizó antes de la cirugía utilizando sondas de sensor rectal y de almohadilla. Además, es muy recomendable la monitorización continua de la temperatura corporal durante todo el procedimiento quirúrgico, especialmente antes de colocar la pinza vascular para inducir isquemia.
La exposición del riñón y la colocación adecuada de la pinza vascular también son fundamentales para el éxito del experimento. El daño a la cápsula renal por el manejo inadecuado de los fórceps durante la exposición del riñón a través de la incisión quirúrgica dará lugar a hemorragia perirreal e inflamación. La pinza vascular debe colocarse en el pedículo renal, ocluyendo la arteria renal y la vena renal sin afectar el uréter y las arterias suprarrenales. Fundamental para este paso es la disección cuidadosa del tejido adiposo que rodea el hilio renal14,16.
Este modelo es rentable y rentable. El consumo de anestésico por ratón fue de 156,47 ± 37,88 μL (media ± SD, n = 17) de un cóctel prediluido de ketamina/xilazina (1:10 ketamina, 1:50 xilazina, en solución salina; concentración de solución madre, 100 mg/ml ambos). La cirugía se puede realizar en un período relativamente corto. El tiempo total de cirugía por ratón fue de 53 ± 5,23 min (media ± DE, n = 17). Con personal capacitado, se pueden realizar varias cirugías al mismo tiempo. En nuestro grupo, un investigador experimentado realizó la cirugía hasta que la pinza fue liberada del pedículo renal, mientras que un segundo se hizo cargo del cierre de la herida hasta la recuperación del ratón. Con este enfoque, pudimos realizar un alto número de cirugías en un solo día. En este modelo, utilizamos el abordaje dorsolateral, que resulta en menos traumatismos y una reducción de la pérdida de líquidos y calor de la cavidad abdominal en comparación con el abordaje de la línea media16.
Protocolos publicados previamente han descrito la técnica de pinzamiento pedicular renal para inducir lesión renal aguda en ratones 17,18,19. Sin embargo, en esos estudios, se realizó una nefrectomía contralateral además del IIR unilateral con tiempos isquémicos que oscilaron entre 15 y 26 min. En este protocolo, inducimos isquemia unilateral durante 30 min preservando el riñón contralateral. Esto resultó en una tasa de supervivencia del 100%. Sin embargo, este modelo no es adecuado para inducir daño renal azotémico debido en parte al efecto compensatorio ejercido por el riñón contralateral no intervenido quirúrgicamente. Sin embargo, mantener un riñón no afectado en el mismo animal ofrece la ventaja de usar tiempos de isquemia más largos con una tasa de supervivencia más alta. Además de esto, el riñón contralateral se puede utilizar para evaluar los posibles efectos secundarios de los fármacos de prueba o tratamientos aplicados durante el procedimiento experimental y para estudiar los efectos de la diafonía riñón-riñón20,21. Por ejemplo, este modelo ha sido útil para mostrar alteraciones inducidas por especies reactivas de oxígeno a nivel celular tanto en el IRI como en el riñón contralateral, no intervenido quirúrgicamente11.
Este modelo tiene una aplicación potencial en estudios destinados a identificar y caracterizar marcadores de daño renal unilateral, efectos de diafonía renal, cambios hemodinámicos post-renales inducidos por IRI y posibles efectos nefrotóxicos de fármacos candidatos a ser utilizados en IRI renal. Esta descripción detallada de los principales cambios patológicos sirve como una valiosa herramienta para seleccionar el momento más adecuado para estudiar procesos celulares específicos, desde la inflamación y la necrosis (4 h a 2 días) hasta la regeneración (4 días) y la fibrosis (7 días y posteriores).

Los riñones se encuentran entre los órganos perfundidos más altos del cuerpo y son extremadamente susceptibles a los cambios en la perfusión sanguínea1. La lesión por isquemia-reperfusión renal (IIR) sigue siendo la principal causa de insuficiencia renal aguda 2,3 y se asocia con alta morbilidad y alta mortalidad en pacientes hospitalizados4. Con limitadas opciones terapéuticas disponibles4,5, el IIR renal es actualmente el foco de varios esfuerzos de investigación en biomedicina 6,7 con el objetivo de desarrollar nuevas dianas terapéuticas y la caracterización de marcadores tempranos y sensibles de lesión renal 8,9,10 . La identificación de un modelo animal fiable, eficaz en el tiempo y en función de los costos se considera esencial para satisfacer estas necesidades. Este artículo presenta un modelo de ratón simple y eficaz de IRI renal unilateral. La isquemia se induce por pinzamiento del pedículo renal derecho durante 30 min11,12. Una parte crucial de este modelo es elegir el tiempo de reperfusión más adecuado que reproduzca los eventos patológicos de interés, como la necrosis tubular, la infiltración de células inflamatorias polimorfonucleares o la fibrosis. Por lo tanto, los investigadores reciben esta visión general secuencial de los cambios patológicos representativos esperados en el riñón IRI.

<table><tbody><tr><td>Clorhidrato de atipamezol</td><td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, EE. UU.</td><td>PVS8700</td><td>5 mg/mL</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, EE. UU.</td><td>PRMBURPEN22</td><td>0,3 mg/mL</td></tr><tr><td>Solución comercial de eutanasia</td><td>varios proveedores</td><td>na</td><td>, por ejemplo, Euthasol Virbac (pentobarbital sódico 390 mg/mL + fenitoína sódica 50 mg/mL)</td></tr><tr><td>Pomada ocular Puralube</td><td>Dechra Productos veterinarios, KS, EE. UU</td><td>. na</td><td>3.5 g (1/8 oz)</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica RightTempJr</td><td>Kent Scientific, CT, EE. UU.</td> <td>&nbsp; RT-JR-20</td><td>Considere el que tiene dos sondas de temperatura</td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina</td><td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, EE. UU.</td><td>VED1220</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>S& T Pinza vascular</td><td>Fine Science Tools, Inc., Alemania</td><td>00398-02</td><td>Dimensiones de la mandíbula: 5,5 x 1,5 mm; longitud: 11 mm</td></tr><tr><td>Toalla desechable estéril Cortinas </td><td>Kent Scientific, CT, EE. UU</td>. <td>SURGI-5023-3 </td><td>Desechable, empaquetado individualmente </td></tr><tr><td>Instrumentos quirúrgicos (pinzas Graefe, hemostático Halsted-Mosquito, tijeras, etc)</td><td>Fine Science Tools, Inc., Alemania</td><td>Varios</td><td>Considere la tijera recta extra fina y la sutura de vicrilo de pinzas Graefe en ángulo</td></tr><tr><td></td><td>Ethicon US, LLC</td><td>J493G</td><td>Tamaño 5-0</td></tr><tr><td>Clorhidrato de xilacina</td><td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA</td><td>VAM4821</td><td>100 mg/mL</td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón eficaz de lesión unilateral por isquemia-reperfusión renal

An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

La lesión por isquemia-reperfusión (IIR) es la principal causa de insuficiencia renal aguda y contribuye significativamente al retraso de la función del injerto. Los modelos animales son los únicos recursos disponibles que imitan las complejidades del daño asociado al IRI encontrado in vivo. Este artículo describe un modelo de ratón eficaz de IRI renal unilateral que proporciona datos altamente reproducibles. La isquemia se induce ocluyendo el pedículo renal derecho durante 30 min seguido de reperfusión. Además del procedimiento quirúrgico, se proporcionará una visión general secuencial de los cambios fisiológicos e histopatológicos esperados después de la IIR renal comparando los datos de siete tiempos de reperfusión diferentes (4 h, 8 h, 16 h, 1 día, 2 días, 4 días y 7 días). Se compartirán datos críticos para planificar experimentos con anticipación, como el tiempo quirúrgico promedio, el consumo promedio de anestésicos y los cambios en el peso corporal a lo largo del tiempo. Este trabajo ayudará a los investigadores a implementar un modelo de IRI renal confiable y seleccionar el tiempo de reperfusión apropiado que se alinee con sus objetivos de investigación previstos.

Parámetros fisiológicos Los ratones se recuperaron de esta cirugía renal unilateral de IRI sin incidentes; parecía activo y alerta; y mostró una alimentación, bebida y comportamiento normales al día siguiente. Algunos ratones pueden tener pérdida de peso corporal post-IRI, aunque generalmente es inferior al 10% del peso corporal inicial (Figura 2). Una mayor pérdida de peso corporal (˃10%) puede ser perjudicial, y esos animales deben ser retirados del estudio. Los ratones operados simuladamente no mostraron cambios en el peso corporal después de la cirugía (medidos 24 h después de la cirugía). La mayoría de los ratones recuperaron su peso corporal inicial entre los días 4 y 7 después de la cirugía (ver grupo IRI de 7 días, Figura 2). La función renal se puede evaluar utilizando marcadores tradicionales como el nitrógeno ureico en sangre (BUN) y la creatinina. Además, en el análisis se incluyeron los niveles de electrolitos en suero (sodio, potasio y cloruro) y un hemograma diferencial automatizado.
Cambios histopatológicos La evaluación de los hallazgos histopatológicos se realizó utilizando secciones enteras del riñón del riñón fijadas en paraformaldehído al 4%, fijadas en parafina y incrustadas en parafina, teñidas con hematoxilina/eosina (HE), ácido schiff periódico y tinciones tricrómicas de Masson. Los cambios más evidentes producidos por este modelo de IRI renal unilateral se pueden observar en la unión cortico-medular, específicamente en los túbulos proximales, las extremidades ascendentes gruesas del asa de Henle y los túbulos contorneados distales, así como en el intersticio tubular (ver la leyenda de la Figura 3). Las imágenes microscópicas que muestran las lesiones más características después de la IRI en el riñón se pueden ver en la Figura 3. En la Tabla 1 se proporciona una lista de los hallazgos histopatológicos secuenciales.
Se desarrolló un sistema de puntuación de lesiones tubulares para categorizar el daño a lo largo del tiempo (Figura 4). En esto, cinco alteraciones definidas fueron evaluadas por tres evaluadores diferentes: 1) atenuación epitelial tubular; 2) pérdida del borde del cepillo; 3) necrosis tubular; 4) obstrucción luminal; y 5) presencia de yeso proteínico. Una asignación de "1" indica que la alteración está presente, "0" que está ausente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig01.jpg"> Figura 1: Modelo experimental de IRI renal en ratón. (A) Se muestran las fases de los experimentos e intervenciones (inducción de anestesia, isquemia y reperfusión). Tenga en cuenta los cambios en el color del riñón derecho a rojo oscuro durante la isquemia (B) a rosa durante la reperfusión (C). (D) Aspecto macroscópico del riñón derecho IRI (flecha roja) en comparación con el riñón contralateral no IRI del mismo animal 24 h después de la cirugía. La flecha roja en (B) muestra la posición de la abrazadera hemostática. Abreviatura: IRI = Lesión por isquemia-reperfusión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig02.jpg"> Figura 2: Peso corporal de ratones antes y después de la IRI renal. Se muestran datos individuales. Abreviaturas: IRI = Lesión por isquemia-reperfusión; h = horas; d = días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig03.jpg"> Figura 3: Lesiones microscópicas típicas observadas en la corteza y la unión cortico-medular de ratones operados por IR. Se muestran los tiempos de reperfusión simulados y diferentes (indicados encima de cada imagen). (A) Las estructuras intactas se muestran en simulación (aumento 40x; barra de escala = 20 μm). Las flechas en IRI 4 h indican la presencia de yeso proteínico en la luz tubular (aumento 40x; barra de escala = 20 μm). Las flechas en IRI 8 h muestran dilatación tubular (aumento 40x; barra de escala = 50 μm). La flecha negra en IRI 16 h muestra fundición tubular en segmentos medulares; las flechas blancas muestran áreas de necrosis celular (aumento 40x; barra de escala = 50 μm). Las flechas negras en IRI 1 d indican dilatación tubular (aumento 10x; barra de escala = 100 μm). La flecha negra en IRI 2 d muestra núcleos celulares agrandados; las puntas de flecha blancas muestran áreas de infiltración de linfocitos y macrófagos (aumento 40x; barra de escala = 50 μm). Las puntas de flecha blancas en IRI 4 d indican células tubulares mitóticas (aumento 40x; barra de escala = 50 μm). La flecha negra en IRI 7 d muestra un área de fibrosis focal; la punta de flecha blanca muestra un área de regeneración (aumento 20x; barra de escala = 100 μm). (B) Tinción PAS que muestra la corteza renal de ratones durante la reperfusión temprana (4 h, 8 h y 16 h). Observe la atenuación progresiva del borde del pincel (flechas). Aumentos 40x; barras de escamas = 50 μm (C) Tinción tricrómica de Masson de ratones simulados e IRI 7 d que muestran áreas de fibrosis intersticial (flechas blancas). Aumento 40x; barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: IRI = Lesión por isquemia-reperfusión; Glo = glomérulo; PCT = túbulo contorneado proximal; DCT = túbulo contorneado distal; CD = conducto colector; PAS = ácido periódico Schiff; d = día. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig04.jpg"> Figura 4: Puntuación de lesión tubular de ratones operados con simulación e IRI. Escala del sistema de puntuación de 1 a 5 para la atenuación epitelial tubular; pérdida del borde del cepillo; necrosis tubular; obstrucción luminal; y presencia de yeso proteínico. Una asignación de "1" indica que la alteración está presente, "0" que está ausente. Se muestran valores individuales. Las barras representan la media ± SD (n = 4). Abreviatura: IRI = Lesión por isquemia-reperfusión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tiempo después de IRI</td>
			<td>Cambios patológicos más significativos</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 horas</td>
			<td>Obstrucción tubular</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Proteína fundida en lúmenes</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 h</td>
			<td>Dilatación tubular</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Necrosis incipiente</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Atenuación del epitelio</td>
		</tr>
<tr>
<td>16 horas</td>
			<td>Necrosis celular</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Fundición tubular</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Infiltración de neutrófilos</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 día</td>
			<td>Necrosis</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Dilatación tubular</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Infiltración de neutrófilos</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 días</td>
			<td>Dilatación tubular</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Infiltración de linfocitos y macrófagos</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Núcleos celulares agrandados</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 días</td>
			<td>Actividad mitótica prominente en las células del túbulo</td>
		</tr>
<tr>
<td>7 días</td>
			<td>Fibrosis focal</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Áreas de regeneración</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Cambios patológicos más significativos a lo largo del tiempo. Diagnosticado en base al examen microscópico de 4-6 animales por grupo.

La lesión por isquemia-reperfusión renal se asocia con una alta morbilidad y mortalidad en pacientes hospitalizados. Aquí, presentamos un modelo de ratón simple y efectivo de lesión unilateral por isquemia-reperfusión renal y proporcionamos una visión general secuencial de los cambios patológicos representativos observados en el riñón.

Un modelo de ratón eficaz de lesión unilateral por isquemia-reperfusión renal

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...

La lesión por isquemia-reperfusión renal es la principal causa de insuficiencia renal aguda. Este modelo es muy útil para comprender los cambios fisiopatológicos que ocurren en el riñón después de un insulto isquémico. Este modelo es rentable y en tiempo y ofrece datos altamente reproducibles.Además de esto, este Modelo de Isquemia Renal Unilateral permite al investigador trabajar con tiempos isquémicos más largos mientras mantiene una alta tasa de supervivencia. Para empezar, coloque el ratón anestesiado sobre la mesa de operaciones. Después de esterilizar el área quirúrgica, use una cuchilla de bisturí para hacer una incisión quirúrgica lateral dorsal de aproximadamente un centímetro en el flanco derecho detrás de la costilla y continúe mimando aproximadamente un centímetro paralelo a la línea media lumbar.Transecta la musculatura abdominal usando tijeras para visualizar el espacio retroperitoneal. Use un hisopo de algodón estéril para eliminar las pequeñas cantidades de sangre producidas durante la seccionamiento de los músculos. A continuación, empuje el riñón derecho fuera de la cavidad abdominal.Exponga lenta y cuidadosamente el riñón con fórceps grises e identifique el pedículo renal. Luego retire cuidadosamente el tejido adiposo alrededor del pedículo. Use un hemostático de mosquitos Halsted para manipular la pinza vascular.Para inducir la isquemia, coloque la pinza vascular sobre la arteria renal y la vena presente en el pedículo renal evitando el pinzamiento del uréter adyacente. Cubra el riñón sujetado con una gasa estéril empapada en solución salina para evitar la desecación. Deje los riñones en la gasa durante 30 minutos y controle la profundidad de la anestesia y la humedad de la gasa periódicamente.Poco antes del final del período de isquemia, descubra el riñón y sostenga el hemostático del mosquito Halsted, listo para la eliminación de la pinza. Al final del período de isquemia, abra la pinza vascular con el hemostático y retire la pinza para permitir la perfusión del riñón. Para animales de control simulados, realice la cirugía demostrada sin pinzamiento del pedículo renal.Después de verificar el cambio de color del riñón, devuelva el riñón a la cavidad abdominal. Cierre los músculos abdominales en un patrón cruzado con sutura absorbible 5-0. Cierre la piel en un patrón de colchón horizontal con sutura absorbible 5-0.Limpie la herida con solución de povidona yodada. Después de la lesión por perfusión por isquemia, se observó una reducción del peso corporal en algunos ratones con menos del 10% del peso corporal inicial. Sin embargo, la mayoría de los ratones recuperaron su peso corporal inicial entre los días 4 y 7 después de la cirugía.Los ratones de control no mostraron ningún cambio en el peso corporal después de la cirugía. Se identificaron varios cambios en la morfología renal después de la cirugía utilizando hematoxilina-eosina, ácido-Schiff periódico y tinción tricrómica de Masson. La presencia de yeso proteínico en la luz tubular se observó después de cuatro horas.Se detectó dilatación tubular a las ocho horas y se notó yeso tubular, así como necrosis celular en los segmentos medulares a las 16 horas después de la cirugía IRI. Después de 24 horas de la cirugía, se observó dilatación tubular. Se detectó infiltración de linfocitos y macrófagos y núcleos celulares agrandados después de 48 horas.Para el día 4, se observaron células tubulares mitóticas y en el día 7 después de la cirugía IRI, se detectó fibrosis focal. La corteza renal de los ratones durante la reperfusión temprana se monitoreó mediante tinción PAS y se observó una atenuación progresiva del borde del cepillo. Las áreas de fibrosis intersticial en el día 7 después de la cirugía se visualizaron utilizando la tinción de tricoma de Masson.Se desarrolló un sistema de puntuación de lesiones tubulares para categorizar el daño a lo largo del tiempo. Las puntuaciones más altas de lesión tubular se obtuvieron entre 8 horas y 24 horas después de la IRI renal. Algunos de los pasos más críticos son la correcta colocación de la pinza vascular en el pedículo renal y el mantenimiento de una temperatura corporal constante durante la cirugía.

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