Un modelo esferoide tridimensional para investigar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular

Los esferoides tumorales 3D han reemplazado la técnica monocapa 2D convencional como el estándar de oro para la investigación del cáncer in vitro. Estos modelos permiten el cocultivo de múltiples tipos celulares que reflejan la heterogeneidad del microambiente tumoral y permiten la explotación de las interacciones espaciales. Las ventajas de usar el método de gotas colgantes para generar esferoides 3D es la falta de interacción célula-plástico y la facilidad de estudiar la interacción entre las células tumorales y las células no tumorales.

Esta técnica también proporciona una forma reproducible y rentable de modelar la interacción tumor-estroma. Los tumoroides 3D son modelos preclínicos valiosos y a menudo se utilizan como una herramienta de detección de drogas. Este método se puede aplicar para estudiar los efectos farmacológicos de múltiples compuestos sobre el crecimiento tumoral y el microambiente circundante.

El proceso de formación de esferoides es fácil de usar y requiere equipos de laboratorio de cultivo celular convencionales. Los esferoides se pueden obtener imágenes utilizando cualquier microscopio de luz invertida de sobremesa, y el análisis del tamaño y la forma de los esferoides se puede realizar utilizando un software de análisis de imágenes en línea ampliamente disponible. Para comenzar, retire las líneas celulares tumorales Huh7 y Hep3B HCC y las líneas celulares de fibroblastos COS-7 y LX2 de su estante de almacenamiento en nitrógeno líquido y descongelarlas rápidamente.

Después de la descongelación, diluya las células descongeladas con dos mililitros de medio de cultivo fresco. Centrifugar las células. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de medio de cultivo caliente fresco.

Luego sembra las células en matraces de cultivo celular T75 y las incuba en una incubadora de cultivo celular hasta que las células alcancen de 60 a 70 y confluencia. Para la recolección celular, aspire los medios de cultivo y lave las células tres veces con PBS. Luego, para separar las células adherentes del fondo de los matraces, agregue dos mililitros de tripsina precalentada e incube a 37 grados centígrados.

Después de cuatro minutos, inactive la tripsina agregando cuatro mililitros de medio de cultivo completo y recoja la suspensión celular, luego centrífuga las células y deseche el sobrenadante antes de volver a suspender las células en un mililitro de medio de cultivo fresco. Finalmente, agregue tres mililitros adicionales de medio de cultivo fresco. Para contar las células, vórtice suavemente la suspensión celular.

Luego, usando una pipeta de 10 microlitros, mezcle 10 microlitros de la suspensión celular con 10 microlitros de azul tripano y pipetee suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo cuatro veces para garantizar la tinción completa de la superficie externa de la célula con el tinte. A continuación, coloque una cubierta sobre el área de conteo del hemocitómetro. A continuación, coloque la punta de la pipeta que contiene la mezcla de celdas junto al borde de la cubierta y expulse suavemente el contenido de la punta en la diapositiva de conteo.

Después de esperar unos minutos para que la suspensión se asiente, fije el hemocitómetro en la etapa del microscopio y cuente las células que se superponen a la parte superior o a la derecha, evitando las que se superponen a la parte inferior o a la izquierda. Finalmente, calcule el número total de celdas usando esta fórmula. Después de aspirar el medio de cultivo, lave las células LX2 tres veces con PBS.

Separe las células usando tripsina como se demostró anteriormente y centrívelas. Después de contar las células como se demostró anteriormente, sembra una vez 10 a la sexta célula LX2 en platos de 10 centímetros cúbicos e incuba a 37 grados centígrados. Después de 48 horas, recoja el medio acondicionado por fibroblastos y centrífuga para granular cualquier célula flotante.

El filtro esteriliza el medio acondicionado utilizando un filtro de 0,22 micras conectado a una jeringa de 20 mililitros. Luego, alícute los medios en dos tubos de mililitros para almacenarlos a menos 80 grados centígrados. Agregue 10 mililitros de PBS estéril al fondo de un plato de 10 centímetros cúbicos para proporcionar condiciones húmedas para los esferoides.

Luego suspenda 1, 500 células HCC HuH7 con 1, 500 células de fibroblastos de mamíferos COS-7 en gotas colgantes para formar esferas. Invierta la tapa del plato para permitir que el medio, incluida la suspensión celular, cuelgue sobre un ambiente húmedo. Después de tres días, para tomar imágenes de los esferoides, coloque el plato en el escenario de un microscopio invertido y ajuste el aumento a cinco veces.

A continuación, abra el software del microscopio en la computadora conectada y ajuste su enfoque para tener una imagen clara de cada esferoide. Luego use la herramienta de ajuste en el software del microscopio para adquirir las imágenes y guardar las imágenes adquiridas. Agregue 10 mililitros de PBS estéril al fondo de un plato de 10 centímetros cúbicos.

Luego suspenda 3, 000 células Hep3B HCC en las gotas colgantes para formar esferas e invierta la tapa del plato permitiendo que las gotas cuelguen sobre un ambiente húmedo durante tres días. A continuación, transfiera los esferoides Hep3B a 20 microlitros de medios de condición frescos de las células LX2 en gotas colgantes. Luego invierta la tapa del plato en el que se forman los esferoides y fije la tapa en el escenario de un microscopio de luz.

Ajuste el enfoque fino del microscopio para que cada esferoide sea visible como se demostró anteriormente. Después de presionar el botón del émbolo para vaciar cuidadosamente el aire de la micropipeta, inserte la punta de la pipeta en la gota que contiene el esferoide que se va a transferir. Acércate mucho al esferoide sin tocarlo con la punta.

A continuación, suelte suavemente la presión sobre el botón del émbolo para permitir la succión del esferoide en la punta de la micropipeta en dos microlitros de medios. Luego transfiera el esferoide a una nueva gota que cuelga de un nuevo plato de 10 centímetros cúbicos. Tome imágenes de los esferoides a cinco veces el aumento utilizando un microscopio invertido desde el día de la transferencia hasta el día siete del cultivo en el medio acondicionado LX2.

Para analizar las imágenes de los esferoides en crecimiento, abra cada imagen esferoide en un software de análisis de imágenes y use la herramienta de selección a mano alzada para delinear cada esferoide. Luego, en el botón desplegable de análisis, seleccione establecer medición, seguido de área y presione OK. A continuación, dibuje manualmente un círculo alrededor de cada esferoide y, una vez que la esfera esté rodeada, presione Control M para permitir que el programa calcule el área esferoide en píxeles. Luego convierta el área del esferoide en un volumen usando esta fórmula.

Finalmente, calcule el cambio en el volumen de esferoides en relación con su volumen en el primer día de captura de imagen. Durante la optimización de la densidad celular para la formación de esferoides, las densidades de siembra más altas de 12, 000 y 6, 000 células produjeron esferoides con una forma asimétrica, mientras que una densidad de siembra de 3, 000 células dio un esferoide 3D redondeado perfecto. Por lo tanto, 3.000 esferoides de densidad celular fueron adaptados para experimentos posteriores.

La evaluación longitudinal del impacto proliferativo de las líneas celulares tumorales y fibroblásticas de cocultivo mostró que a partir del cuarto día, los esferoides heterotípicos crecieron en una forma redonda ideal en comparación con los esferoides homotípicos. Los esferoides heterotípicos inicialmente mostraron una fase de crecimiento rápido a partir del día cuatro al día siete, seguida de una fase más lenta en el día ocho. El volumen esferoide luego disminuyó en los días nueve y 10, posiblemente reflejando el agotamiento de nutrientes o un núcleo hipóxico y la muerte celular.

En contraste, los esferoides homotípicos exhibieron una curva de crecimiento relativamente estática hasta el quinto día, seguida de un aumento gradual en sus curvas de crecimiento a partir del sexto día. La mayor tasa de crecimiento de los esferoides heterotípicos sugiere que el contacto directo entre el tumor y los fibroblastos aumenta el tamaño de los esferoides tumorales. Cuando los esferoides Homotípicos Hep3B de tres días de antigüedad se cultivaron en medios frescos, las células formaron esferoides perfectamente redondeados después de tres días y mostraron una proliferación continua hasta el día siete.

La tasa de crecimiento mejoró cuando los esferoides se mantuvieron en medios condicionados por LX2, lo que sugiere una proliferación de esferoides tumorales impulsada por fibroblastos. Es crucial asegurarse de que el BBS estéril se agregue a la parte inferior de los platos para mantener una condición húmeda adecuada para la formación de esferoides. Además, tenga cuidado al invertir la tapa para que los esferoides y las gotas no se interrumpan.

Los esferoides tumorales 3D se pueden fijar o congelar y almacenar para aplicaciones futuras como inmunoquímica o inmunofluorescencia, así como extracción de ARN para análisis transcriptómico. Los esferoides heterotípicos con células premarcadas se pueden obtener imágenes y rastrear para proporcionar información sobre las interacciones célula-célula dentro del microambiente tumoral.