Determinación analítica de la función mitocondrial de homogeneizados de tumores sólidos extirpados

Este protocolo describe un método simple y rápido para medir la función mitocondrial del tumor. El protocolo es ampliamente aplicable a la oncología traslacional clínica, y ayudará a mejorar la interpretación diagnóstica y mecanicista del papel de las mitocondrias en la aparición y progresión del cáncer. La principal ventaja de esta técnica es la aplicación de la homogeneización de tejidos para simplificar la preparación y maximizar el rendimiento de las mitocondrias al tiempo que mitiga las limitaciones de difusión.

Esta técnica ofrece aplicaciones potenciales en entornos clínicos y diagnósticos con una evaluación cuantitativa de la función mitocondrial del tumor utilizando tejido tumoral recién biopsiado o extirpado. Comience colocando un homogeneizador de vidrio que contenga un mililitro de medio de respiración mitocondrial, o MiR05, en un mortero de vidrio ajustado sobre hielo húmedo. Coloque el tejido en un mililitro de solución de preservación de biopsia, o BIOPS, en una placa de Petri helada.

Corte el tumor en trozos pequeños de aproximadamente 5 a 10 miligramos cada uno, y coloque los trozos de tumor restantes de nuevo en 10 mililitros de BIOPS mantenidos en hielo. Después de secar las secciones de pañuelos cuidadosamente en un papel de filtro, colóquelas en un pequeño bote de pesaje de plástico alquitranado y registre el peso húmedo inicial. Vuelva a colocar las piezas no utilizadas en el tubo cónico de 10 mililitros de BIOPS para su conservación continua.

Sumerja las secciones de tejido en un homogeneizador helado que contenga MiR05 y registre el peso restante en el bote de pesaje. Usando un mortero de vidrio con un rango de aclaramiento de 0.09 a 0.16 milímetros, interrumpa suavemente el tejido tumoral completando de cinco a siete golpes hacia abajo y hacia arriba. Para cada golpe, gire el mortero en el sentido de las agujas del reloj / en sentido contrario a las agujas del reloj tres veces mientras empuja el mortero hacia abajo, y tres veces adicionales mientras tira del mortero hacia arriba.

Permita que el tejido se asiente en la parte inferior del homogeneizador entre golpes, pero evite llevar el mortero completamente por encima del volumen de líquido para evitar la formación de espuma. Vierta el homogeneizado en un tubo cónico de 15 mililitros y colóquelo sobre hielo. Pipete de uno a tres mililitros de MiR05 fresco sobre el mortero y en el homogeneizador para lavar cualquier tejido restante homogeneizado.

Vierta el lavado MiR05 en el tubo cónico que contiene el homogeneizado. Repita este paso dos o tres veces para asegurar la transferencia completa del homogeneizado. Para calcular con precisión la concentración de homogeneizado tisular, inspeccione cuidadosamente el homogeneizador y el homogeneizado en busca de material no homogeneizado restante, que incluye tejido conectivo.

Para eliminar el material no homogeneizado del homogeneizador que no se puede alcanzar con pinzas, después de agregar MiR05 al homogeneizador, aspire el volumen, incluido el tejido, con una pipeta y mueva el contenido a una placa de Petri. Retire el material no homogeneizado asentado en trozos grandes en la parte inferior del tubo cónico del homogeneizado arrancándolos con una pipeta y colóquelos en la tapa del tubo cónico. Retire el tejido de la placa de Petri o la tapa del tubo cónico con pinzas y bloquéelo en papel de filtro.

Agregue el homogeneizado restante de la tapa del tubo cónico de nuevo en el tubo cónico. Tapa el tubo, luego invierte para mezclar. Vuelva a inspeccionar los homogeneizadores y homogeneice cualquier material adicional no homogeneizado, y repita los pasos para eliminar el material no homogeneizado si es necesario.

Pesar y registrar la masa del material no homogeneizado recuperado del homogeneizador. Inspeccione la preparación homogeneizada para detectar cualquier tejido groseramente intacto transferido, retire las piezas no homogeneizadas y pese según sea necesario. Reste el peso tisular recuperado del bote de pesaje, homogeneizador y homogeneice del peso húmedo inicial para calcular el peso final de la muestra.

Usando el peso final de la muestra, agregue MiR05 adicional para llevar el homogeneizado a la concentración deseada. Una vez pesado y preparado el homogeneizado, proceder al ensayo lo antes posible. Mantenga la muestra almacenada en hielo húmedo hasta que se transfiera al instrumento.

Una vez calibrado el instrumento y preparada la muestra, retira los tapones con un movimiento de torsión y aspira el MiR05 de las cámaras, evitando la membrana expuesta en el interior de la cámara. Mezcle bien el homogeneizado y agregue 2,25 mililitros del homogeneizado a la cámara. Supongamos que se agrega un homogeneizado a múltiples cámaras, pipetear un mililitro del homogeneizado a la vez en cada cámara mientras se mezcla el homogeneizado para garantizar una distribución equitativa del tejido.

Haga clic en F4 para nombrar y marcar la hora del evento, y luego haga clic en Aceptar. Llene una jeringa de 50 mililitros con oxígeno de un tanque de oxígeno con un regulador y un tubo de gas con una aguja roma de calibre 18. Inyecte el oxígeno directamente en las cámaras para hiperoxigenarlas a aproximadamente 500 micromolares de oxígeno.

Inserte libremente los tapones y espere a cerrar hasta que el oxígeno alcance aproximadamente 480 micromolares. Con un movimiento de torsión, cierre lentamente la cámara y permita que la respiración se equilibre durante aproximadamente 15 a 20 minutos. Llene el capilar central del tapón con MiR05 si es necesario.

Utilice microjeringes dedicadas para inyectar sustratos, desacopladores e inhibidores en cámaras completamente cerradas para nombrar y marcar la hora de los eventos de cada cámara en tiempo real. Seleccione F6 para ajustar la concentración de oxígeno y las escalas negativas de la pendiente de oxígeno según sea necesario. Después de cada inyección, lave la jeringa tres veces en agua para los compuestos solubles en agua y 70% de etanol para los compuestos disueltos con etanol.

Agregue cinco microlitros de malato 0.8 molar y proceda inmediatamente a la siguiente inyección. Lave la jeringa de inyección tres veces en agua. Agregue inmediatamente cinco microlitros de piruvato 1 molar y espere a que la respiración se estabilice.

Después de lavar la jeringa, agregue 10 microlitros de ADP de 0.5 molares y espere a que la respuesta de ADP se estabilice. Lave la jeringa y agregue cinco microlitros de glutamato 2 molares y espere a que la respiración se estabilice. Lave la jeringa, luego agregue cinco microlitros de citocromo-C 4 milimolar y espere a que la respiración se estabilice.

Después de lavar la jeringa, agregue 20 microlitros de succinato 1 molar y espere a que la respiración se estabilice. Valore incrementos de 0.5 a 1 microlitro de FCCP 1 milimolar y espere a que la respiración se estabilice después de cada inyección. Continúe hasta que no haya un aumento adicional en la respiración.

Lave la jeringa de inyección tres veces en etanol al 70%. Agregue dos microlitros de rotenona 150 micromolares y espere a que la respiración se estabilice. Agregue otro microlitro de rotenona para asegurarse de que no haya más inhibición.

Si hay una disminución en la respiración, continúe con inyecciones adicionales hasta que no haya disminución en la respiración, luego lave la jeringa de inyección tres veces en etanol al 70%. Agregue dos microlitros de antimicina A 125 micromolares y espere a que la respiración se estabilice. Agregue otro microlitro de antimicina A para asegurarse de que no haya más inhibición.

Si hay una disminución en la respiración, continúe con inyecciones adicionales hasta que no haya disminución en la respiración. Lave la jeringa tres veces con etanol al 70%. Compruebe la concentración de oxígeno de la cámara.

Si la concentración es inferior a 125 micromolares, reoxigenar al aire ambiente o hiperoxigenar ligeramente para asegurarse de que el oxígeno no limite el flujo respiratorio. Añadir cinco microlitros de ascorbato de 0,8 molares. Lave la jeringa tres veces en etanol al 70%.

Agregue inmediatamente 10 microlitros de TMPD de 0.2 molares y espere un aumento en la respiración. Después de lavar la jeringa con etanol, agregue 25 microlitros de azida de sodio 4 molares inmediatamente cuando el flujo respiratorio de ascorbato TMPD se estabilice. Termine haciendo clic en Archivo, Guardar y desconecte.

Se observó que 40 miligramos por mililitro de homogeneizado tisular resultaron en un rápido agotamiento del oxígeno. El consumo de oxígeno disminuyó sustancialmente con 30 y 20 miligramos por mililitro de homogeneizado tisular, pero aún así disminuyó rápidamente en poco tiempo en ausencia de sustratos o ADP. La concentración de 10 miligramos por mililitro de homogeneizado tisular dio como resultado la tasa óptima de consumo de oxígeno.

Se utilizó un protocolo SUIT para evaluar la fosforilación oxidativa ligada al NADH y al succinato y la transferencia de electrones, así como la actividad del Complejo IV. La liberación del citocromo C se evaluó en presencia de piruvato y malato, o succinato y rotenona, los cuales revelaron que la preparación homogeneizada no dañó las mitocondrias. También se encontró que la fosforilación oxidativa ligada a NADH fue insignificante en los tumores EO771.

La titulación de FCCP para impulsar el flujo máximo de electrones reveló que en los tumores EO771, la fosforilación, en lugar de la oxidación, se limitaba a la respiración. Los perfiles respiratorios homogeneizados del tumor fueron similares a los de las células EO771 no implantadas y permeabilizadas con digitonina, excepto por la disminución de la transferencia máxima de electrones soportada por sustratos ligados a N y S en el tumor. La cinética respiratoria del succinato se evaluó aún más mediante titulaciones graduales de ADP subsaturante hasta que se alcanzó la tasa máxima.

La concentración medio máxima de ADP en presencia de succinato y rotenona fue de 37,5 micromolares, mientras que la tasa máxima fue de aproximadamente 10,5 picomoles por segundo, por miligramo. Los instrumentos establecidos en el cuidado de rutina, así como el manejo de tejidos, son de importancia crítica para el éxito de estos experimentos. Siguiendo estos procedimientos, se pueden aplicar otros enfoques específicos de masa o marcador para la normalización de tasas sobre la base de la cuestión de interés.

Las medidas comunes incluyen la cuantificación total de proteínas y la actividad enzimática de la citrato sintasa, pero varían según el sistema modelo, el diseño estadístico y la pregunta de investigación.