Preparación de muestras para la visualización tridimensional basada en tomografía computarizada de vasos murinos de las extremidades posteriores
7 de octubre de 2021
Aquí, describimos un método de visualización y cuantificación para los vasos murinos de las extremidades posteriores utilizando tomografía computarizada de micro-rayos X.
Es posible tomar imágenes por TC de los vasos sanguíneos en las extremidades inferiores y los órganos abdominales utilizando el protocolo de pasos. El método permite la evaluación de todos los vasos sanguíneos de manera integral. Además, es posible evaluar solo arterias o, al mismo tiempo, arterias y venas.
Es muy importante prevenir coágulos de sangre, fugas o sangre bien, y evitar las burbujas de aire. Antes de la operación, inyecte 1 unidad/gramo de heparina en PBS en la cavidad intraperitoneal del ratón. Después de 30 minutos, haga una incisión en la línea media en el esternón del ratón sacrificado y fije el tórax abierto con alfileres.
Corte la aorta ascendente antes de extirpar el corazón y luego retire el pulmón para exponer la aorta descendente. Corte la aorta descendente en diagonal para revelar la sección transversal del vaso. A continuación, inserte un catéter de calibre 22 en la aorta descendente mientras ejecuta el tampón de vasodilatación.
Fije la raíz del catéter y haga un nudo para evitar fugas debido al reflujo. Una vez hecho esto, iniciar la perfusión con una solución vasodilatadora calentada a una presión fija entre 13 a 15 kilopascales. Después de tres minutos, perfundir una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 3 min.
Detenga la perfusión y llene el tubo de extensión conectado al catéter con 2 ml del medio de contraste recién preparado diluido en la proporción 1: 1 a perfusión a un fijo entre 13 y 15 kilopascales. Para visualizar las arterias, revise la uña del pie de la boca para confirmar que el medio de contraste ha llegado a la arteria. De la misma manera, verifique la vena cava inferior del diafragma para confirmar la circulación completa del medio de contraste y visualizar todos los vasos.
Si la circulación del medio de contraste es completa, cierre la llave de paso de tres vías y retire el tubo. Incubar la muestra durante la noche a 4 grados centígrados. En este protocolo, se visualizaron todos los vasos en las extremidades inferiores del ratón.
Los resultados de un modelo de isquemia de las extremidades posteriores confirmaron que la arteria femoral no ligada corría paralela a la vena femoral. Además, la interrupción en el medio de contraste facilitó la visualización de una arteria femoral ligada y el desarrollo de vasos colaterales. Se podían ver algunos recipientes llenos del medio de contraste.
Por otro lado, también se notó la interrupción en los medios de contraste debido a la mezcla de medios no contraste, o perfusión insuficiente. Era imposible ver las arterias en la superficie del cuerpo mediante la observación microscópica o estereomicroscópica del medio de contraste, lo que facilitó la evaluación de defectos en la vasculatura. Es muy importante evitar las burbujas de aire al insertar el catéter.
Dado que sus órganos abdominales también están relajados, es posible sacar de los órganos y tomar una tomografía computarizada. Mediante el uso de este método, pudimos identificar un nuevo trimestre de saturación.
Visión general
Este artículo describe un método para visualizar y cuantificar los vasos de las extremidades posteriores de los murinos mediante tomografía computarizada micro-RX. La técnica permite una evaluación integral de los vasos sanguíneos en las extremidades inferiores y los órganos abdominales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Vascular
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- La tomografía computarizada micro-RX es una poderosa herramienta de imagen.
- Comprender la estructura de los vasos sanguíneos es crucial para varios estudios biológicos.
- Los métodos anteriores pueden no proporcionar una visualización integral.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar las técnicas de visualización para modelos murinos.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método confiable para visualizar los vasos de las extremidades posteriores.
- Permitir la cuantificación de estructuras vasculares en modelos murinos.
- Evaluar el impacto de las intervenciones en la salud vascular.
Métodos utilizados
- Inyección de heparina para prevenir coágulos sanguíneos.
- Perfusión de medio de contraste para visualizar los vasos sanguíneos.
- Imágenes de TC para capturar estructuras vasculares detalladas.
- Evaluación de arterias y venas en las extremidades posteriores.
Principales resultados
- Visualización exitosa de todos los vasos en las extremidades inferiores.
- Identificación de vasos colaterales en un modelo de isquemia de extremidad posterior.
- Desafíos notados con burbujas de aire y perfusión incompleta.
- El método permitió evaluar los defectos vasculares.
Conclusiones
- El método proporciona un enfoque integral para la imagen vascular.
- Puede mejorar la comprensión de las condiciones vasculares en modelos murinos.
- Las aplicaciones futuras pueden incluir estudios sobre la salud y las enfermedades vasculares.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables comprehensive 3D visualization of murine vascular networks, supporting preclinical assessment of angiogenic responses and vascular pathology. By providing quantitative structural data from hind-limb and abdominal organ vasculature, it enhances target validation in vascular biology and ischemic disease models. The technique improves predictive confidence in lead identification by reducing reliance on 2D sectioning and enabling direct observation of vascular architecture and collateral formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to angiogenesis and vascular remodeling in ischemic models.
- Operational Value: Provides functional validation of vascular targets through direct 3D imaging of perfusion defects and collateral development.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying vascular responses to pharmacological or genetic interventions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized biological systems for downstream compound screening by establishing baseline vascular morphology.
- Quantitative Output: Delivers measurable vascular parameters such as vessel density, branching patterns, and perfusion completeness for assay standardization.
- Scalability: Compatible with micro-CT platforms, enabling reproducible imaging across laboratories and study sites.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological and pathological angiogenesis in hind-limb ischemia, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery findings with preclinical validation by enabling longitudinal vascular assessment.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by visualizing vascular defects and compensatory mechanisms that influence drug efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, particularly in target validation and lead optimization stages where vascular phenotypes are critical readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic pathways and vascular integrity in disease models.
- Screening: Enables assay-ready vascular models with reproducible, quantitative imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides structural and perfusion-based readouts that allow comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to vascular outcomes in preclinical models, supporting biomarker-linked efficacy assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for vascular phenotyping across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in vascular responses.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized perfusion and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular liabilities and reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative vascular morphology and perfusion data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical vascular perfusion and contrast agent handling.
- Dependent on micro-CT imaging infrastructure and contrast medium preparation capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of perfusion pressure, timing, and contrast dilution for reproducible results.
- Adaptation across model systems may require adjustments in cannulation technique and perfusion parameters.
- Practical limitations include sensitivity to air bubbles, incomplete perfusion, and contrast mixing, which can impair visualization quality.
