Preparación de muestras para la visualización tridimensional basada en tomografía computarizada de vasos murinos de las extremidades posteriores

Aquí, describimos un método de visualización y cuantificación para los vasos murinos de las extremidades posteriores utilizando tomografía computarizada de micro-rayos X.

Es posible tomar imágenes por TC de los vasos sanguíneos en las extremidades inferiores y los órganos abdominales utilizando el protocolo de pasos. El método permite la evaluación de todos los vasos sanguíneos de manera integral. Además, es posible evaluar solo arterias o, al mismo tiempo, arterias y venas.

Es muy importante prevenir coágulos de sangre, fugas o sangre bien, y evitar las burbujas de aire. Antes de la operación, inyecte 1 unidad/gramo de heparina en PBS en la cavidad intraperitoneal del ratón. Después de 30 minutos, haga una incisión en la línea media en el esternón del ratón sacrificado y fije el tórax abierto con alfileres.

Corte la aorta ascendente antes de extirpar el corazón y luego retire el pulmón para exponer la aorta descendente. Corte la aorta descendente en diagonal para revelar la sección transversal del vaso. A continuación, inserte un catéter de calibre 22 en la aorta descendente mientras ejecuta el tampón de vasodilatación.

Fije la raíz del catéter y haga un nudo para evitar fugas debido al reflujo. Una vez hecho esto, iniciar la perfusión con una solución vasodilatadora calentada a una presión fija entre 13 a 15 kilopascales. Después de tres minutos, perfundir una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 3 min.

Detenga la perfusión y llene el tubo de extensión conectado al catéter con 2 ml del medio de contraste recién preparado diluido en la proporción 1: 1 a perfusión a un fijo entre 13 y 15 kilopascales. Para visualizar las arterias, revise la uña del pie de la boca para confirmar que el medio de contraste ha llegado a la arteria. De la misma manera, verifique la vena cava inferior del diafragma para confirmar la circulación completa del medio de contraste y visualizar todos los vasos.

Si la circulación del medio de contraste es completa, cierre la llave de paso de tres vías y retire el tubo. Incubar la muestra durante la noche a 4 grados centígrados. En este protocolo, se visualizaron todos los vasos en las extremidades inferiores del ratón.

Los resultados de un modelo de isquemia de las extremidades posteriores confirmaron que la arteria femoral no ligada corría paralela a la vena femoral. Además, la interrupción en el medio de contraste facilitó la visualización de una arteria femoral ligada y el desarrollo de vasos colaterales. Se podían ver algunos recipientes llenos del medio de contraste.

Por otro lado, también se notó la interrupción en los medios de contraste debido a la mezcla de medios no contraste, o perfusión insuficiente. Era imposible ver las arterias en la superficie del cuerpo mediante la observación microscópica o estereomicroscópica del medio de contraste, lo que facilitó la evaluación de defectos en la vasculatura. Es muy importante evitar las burbujas de aire al insertar el catéter.

Dado que sus órganos abdominales también están relajados, es posible sacar de los órganos y tomar una tomografía computarizada. Mediante el uso de este método, pudimos identificar un nuevo trimestre de saturación.