Name: Producción de escamas libres de células y adición adyuvante a una proteína principal recombinante de membrana externa de Chlamydia muridarum para el desarrollo de vacunas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Aprende a producir proteínas de membrana en nanodiscos mediante expresión celular libre para desarrollo de vacunas subunidad. Este método escalable permite obtener antígenos con conformación nativa de Chlamydia muridarum.

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Este trabajo fue financiado por la subvención R21 AI20925 y U19 AI144184 del Servicio de Salud Pública del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. Este trabajo fue realizado bajo los auspicios del Departamento de Energía de los Estados Unidos por el Laboratorio Nacional Lawrence Livermore bajo el contrato DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.

La clamidia es la infección de transmisión sexual más común que afecta tanto a hombres como a mujeres. Aunque la investigación de la vacuna contra la clamidia abarca décadas, una vacuna segura y eficaz que pueda ampliarse a la producción masiva ha sido difícil de alcanzar13. La clamidia MOMP se considera el principal candidato como antígeno protector de la vacuna; sin embargo, el MOMP es altamente hidrofóbico y propenso a un plegado incorrecto14,15. Estudios posteriores han revelado que MOMP existe en estados oligoméricos que son esenciales para su inmunogenicidad11. Aquí se detalla un método validado de coexpresión libre de células que produce MOMP oligomérico formado dentro de la nanopartícula de tNLP como vacuna, con rendimientos de aproximadamente 1,5 mg de MOMP purificado por 3 ml de lisado. Este procedimiento totalmente cotejado puede ampliarse aún más para la producción industrial, lo que aumenta sus perspectivas como un enfoque útil para la generación de vacunas.
Hemos publicado previamente sobre el uso de la expresión libre de células para producir proteínas de membrana incrustadas en NLPs 3,16, así como la expresión en discos estabilizados con telodendrimer. Sin embargo, esta última técnica produjo partículas de proteína de membrana con mayor heterogeneidad y menor solubilidad. 4 Además, la inmunogenicidad de las partículas de MOMP-telodendrimer no está clara en comparación con las partículas de MOMP-tNLP6.
Este procedimiento se puede adaptar para ampliar la expresión de proteínas de membrana bacteriana que son candidatas prometedoras como antígenos para su uso en vacunas de subunidades. Este procedimiento no solo produce proteínas de membrana bacterianas solubilizadas, sino que la estructura general de nanopartículas es susceptible de modificaciones adicionales utilizando una variedad de adyuvantes de vacunas lipofílicas que incluyen, entre otros, CpG conjugado con una fracción de colesterol o FSL-1. La expresión de otros antígenos candidatos a partir de bacterias es factible, aunque puede ser necesario explorar parámetros como la temperatura de expresión, la elección de lípidos y el tipo de sistema de expresión para lograr rendimientos óptimos.
Además, la elección y la proporción de plásmidos son fundamentales en este proceso. Ambos plásmidos utilizados deben construirse a partir de la misma columna vertebral. Si los insertos tienen aproximadamente la misma longitud, las proporciones se pueden basar en la masa del plásmido agregado, como se describe aquí. Sin embargo, la proporción basada en moles dará resultados más reproducibles, especialmente al escalar las reacciones. Es posible que las proporciones que funcionan bien en reacciones a escala de pantalla (< 0,5 ml) no sean aplicables a reacciones más grandes y requieran una optimización adicional. Las proteínas que no son de membrana aún se pueden expresar utilizando kits libres de células, pero es posible que no requieran la nanopartícula lipídica (coexpresión) para producir un producto soluble. Además, si bien este protocolo describe el adyuvante con CpG y FSL-1, este sistema es susceptible de formulación con otros adyuvantes lipofílicos o mezcla con adyuvantes solubles según se desee.
Es esencial evitar la contaminación al configurar la reacción de expresión libre de células, ya que esto puede afectar los rendimientos. Cualquier aditivo para la reacción, incluidos los propios plásmidos, debe ser muy puro. Además, las proteínas expresadas solo deben estar en contacto con materiales y soluciones que estén libres de contaminación por endotoxinas. La contaminación por endotoxinas en las formulaciones candidatas puede dar lugar a resultados inconsistentes y espurios de los ensayos inmunológicos y puede ser perjudicial en cantidades suficientes. Si bien no se describe aquí, puede ser necesaria una purificación adicional después de la cromatografía de afinidad de níquel si se observan muchos contaminantes en los pasos de análisis posteriores, como a través de SDS-PAGE. Esto podría lograrse con SEC, aunque las condiciones pueden requerir una optimización formulación por formulación.

Los lisados procariotas o eucariotas para la expresión libre de células de proteínas están fácilmente disponibles como productos comerciales para sintetizar proteínas de interés (para una revisión completa, ver 1). Estos sistemas de expresión están disponibles a varias escalas y utilizan lisados de varios organismos, incluyendo E. coli, plantas de tabaco y cultivos de mamíferos. Los lisados libres de células ofrecen múltiples beneficios sobre los enfoques tradicionales de producción de proteínas recombinantes, incluida la facilidad de uso y la producción de proteínas robusta y rápida. Si bien estos enfoques se utilizan principalmente para producir proteínas solubles, este grupo ha sido pionero en un enfoque para su uso para expresar proteínas de membrana.
Este novedoso enfoque realiza modificaciones menores en los sistemas de expresión libre de células existentes mediante la inclusión de ADN que codifica dos productos proteicos para la expresión, una apolipoproteína y la proteína de membrana de interés. La apolipoproteína expresada (derivados de ApoA1 o ApoE4) interactúa con los lípidos añadidos al lisado libre de células para ensamblar espontáneamente (~20 nm) los NLP. Cuando se cotraducen con una proteína de membrana de interés, el NLP y la proteína de membrana forman un complejo de nanopartículas solubles en el que la proteína de membrana está incrustada dentro de la bicapa lipídica de NLP. Por lo tanto, la proteína de membrana es más accesible para aplicaciones posteriores, ya que está contenida en partículas solubles y discretas. Este enfoque puede producir complejos de proteínas oligoméricas funcionales dentro de la bicapa2 de NLP y puede producir el componente de antígeno de una vacuna de subunidad, que posteriormente se mezcla con adyuvantes lipofílicos para formar una vacuna de nanopartículas con antígeno colocalizado y adyuvante adecuado para la evaluación in vivo .
Este método actual es una modificación de un protocolo publicado anteriormente3. Las modificaciones clave se centran en el escalado de la reacción libre de células y la posterior purificación del complejo proteína-NLP. Una modificación adicional incluye la adición de un polímero anfifílico conocido como telodendrimer, que primero se mezcla con los lípidos antes de agregarlo a la reacción libre de células. La co-traducción de los plásmidos en presencia del telodendrimer y los lípidos produce un NLP de telodendrimer (tNLP). La adición del telodendrimer también ayuda a modular el tamaño y la monodispersidad de las nanopartículas de tNLPresultantes 4. Este protocolo está específicamente optimizado para estudios de vacunas a gran escala para producir una proteína antigénica de subunidad unida a la membrana, la clamidia MOMP 5,6. El método produce MOMP recombinante asociado con tNLP para formar un complejo MOMP-tNLP altamente soluble que retiene la oligomerización de MOMP. Una producción típica de escalado de 3 ml produce >1,5 mg de MOMP purificado. El MOMP-tNLP producido sin células es susceptible de adición adyuvante rápida para pruebas de inmunogenicidad in vivo.

<table><tbody><tr><td>1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) en polvo</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tubos de centrífuga libres de endotoxinas</td><td>Eppendorf</td><td>2600028</td><td></td></tr><tr><td>solución de clorhidrato de Trizma 1 M</td><td>Millipore Sigma</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial, reactivo ACS, &ge; 99.7%</td><td>Millipore Sigma 695092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparato Bio-Dot</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Amortiguador para XCell SureLock</td><td>Life Technologies</td><td>EI0012</td><td></td></tr><tr><td>C24 Agitador de incubadora</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Expresión Libre de Células: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit</td><td>BiotechRabbit</td><td>BR1400201</td><td></td></tr><tr><td>Resina de purificación cOmplete His-Tag</td><td>Roche Molecular Diagnostics</td><td>5893682001</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa completo sin EDTA</td><td>Roche Molecular Diagnostics</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>CpG-ODN1826</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-trehalosa dihidratada</td><td>Millipore Sigma</td><td>71509</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de diálisis Dializador D-Tube Maxi</td><td>Millipore Sigma</td><td>71508-3</td><td></td></tr><tr><td>Columnas desechables de polipropileno fritadas 10 mL de capacidad</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550EDU</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Electroforesis Fuente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de alimentación Endosafe PTS Cartucho Endosafe PTS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9594798</td><td></td></tr><tr><td>Endosafe-PTS Solución de</td> lavado Charles <td>River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel: 10% de metanol, 7% de ácido</td><td></td><td></td><td></td>acético</tr><tr><td>Soluciones de HCl y NaOH para Ajuste</td><td></td><td></td><td></td>del pH</tr><tr><td>HPLC con detector de matriz de diodos UV-vis</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone HyPure Agua de cultivo</td><td>VWR</td><td>82007-328</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Sistema de transferencia en seco</td><td></td> Life Technologies <td></td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2, PVDF</td><td>Life Technologies</td><td>IB24001</td><td></td></tr><tr><td>software Image Studio V2.0</td><td>Li-COR Biiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF Membrana</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Fc imager</td><td>Li-COR Biiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol (&ge; 99.9%)</td><td>Millipore Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horno</td><td></td><td></td><td></td>de microondas</tr><tr><td>NanoDrop One/OneC Microvolumen UV-Vis Espectrofotómetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 a 12%, Bis-Tris, 1,0 mm</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP000202</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Agente reductor de muestras (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer en TBS conteniendo 0.2% Tween 20</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td></td><td></td><td></td>orbital</tr><tr><td>PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEG5K-CA8 Telodendrimer (producto de síntesis personalizado)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vector pIVEX2.4d</td> Plásmido de Roche <td>Molecular Diagnostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario: MAb40 (anticuerpo monoclonal contra el dominio variable 1 (VD1) de C. muridarum MOMP, laboratorio de la Maza)4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario: MAbHIS, anticuerpo Penta-His</td><td>Sonda Qiagen</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>sonicador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorímetro Life</td><td>Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Ensayo de proteínas Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33212</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta Rainin: LTS 1000 y micro; L</td><td>Rainin</td><td>17002428</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Puntas de pipeta: LTS 20 y micro; L</td><td>Rainin</td><td>17002429</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Puntas de pipeta: LTS 200 y micro; L</td><td>Pipetas Rainin</td><td>17002426</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Anticuerpo</td> secundario de <td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: IRDye 800CW cabra (policlonal) anti-ratón IgG (pesado y ligero)</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Proteína preteñida Standard Life Technologies</td><td></td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico NaH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; S0751</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200, columna 5/150 GL</td><td>Cytiva</td><td>GE28-9909-45</td><td></td></tr><tr><td>Lipoproteína diacilada sintética-TLR2/6 FSL-1</td><td>Invivogen</td><td>&nbsp; tlrl-fsl</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Ruby Protein Gel</td><td>Stain Life Technologies</td><td>S12001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Fuente</td><td></td><td></td><td></td>de luz UV</tr><tr><td>Vacufuge Centrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR 15 mL cónicos (89039-666)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR cónicos de 50 ml (89039-656)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies)</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

producción de escamas libres de células y adición adyuvante a una proteína principal recombinante de membrana externa de chlamydia muridarum para el desarrollo de vacunas

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Las vacunas de subunidades ofrecen ventajas sobre las vacunas más tradicionales inactivadas o atenuadas derivadas de células enteras en cuanto a seguridad, estabilidad y fabricación estándar. Para lograr una vacuna eficaz de subunidades basadas en proteínas, el antígeno proteico a menudo necesita adoptar una conformación similar a la nativa. Esto es particularmente importante para los antígenos de superficie de patógenos que son proteínas unidas a la membrana. Los métodos libres de células se han utilizado con éxito para producir proteínas de membrana funcionales correctamente plegadas a través de la cotraducción de partículas de nanolipoproteínas (NLP), comúnmente conocidas como nanodiscos. 
Esta estrategia se puede utilizar para producir vacunas de subunidades que consisten en proteínas de membrana en un entorno unido a lípidos. Sin embargo, la producción de proteínas libres de células a menudo se limita a pequeña escala (<1 mL). La cantidad de proteína producida en las series de producción a pequeña escala suele ser suficiente para los estudios bioquímicos y biofísicos. Sin embargo, el proceso libre de células debe ampliarse, optimizarse y probarse cuidadosamente para obtener suficiente proteína para estudios de vacunas en modelos animales. Otros procesos implicados en la producción de vacunas, como la purificación, la adición de adyuvantes y la liofilización, deben optimizarse en paralelo. En este artículo se informa sobre el desarrollo de un protocolo ampliado para expresar, purificar y formular una vacuna de subunidades proteicas unidas a la membrana. 
Las reacciones libres de células a escala requieren la optimización de las concentraciones y proporciones de plásmidos cuando se utilizan múltiples vectores de expresión de plásmidos, la selección de lípidos y la adición de adyuvantes para la producción de alto nivel de partículas de nanolipoproteínas formuladas. El método se demuestra aquí con la expresión de una proteína principal de membrana externa (MOMP) de clamidia, pero puede aplicarse ampliamente a otros antígenos de proteínas de membrana. La eficacia del antígeno puede evaluarse in vivo a través de estudios de inmunización para medir la producción de anticuerpos, como se demuestra aquí.

En la Figura 1B se muestra el perfil SDS-PAGE de la purificación por afinidad de Ni de MOMP-tNLP a partir de una reacción libre de células de 1 mL. La reacción dio lugar a altos niveles de expresión tanto de la MOMP como de la proteína Δ49ApoA1. Los resultados anteriores mostraron que la expresión libre de células de Δ49ApoA1 en presencia de DMPC y telodendrimer dio lugar a la formación de partículas de nanolipoproteínas de telodendrimer (tNLPs)4. La coelución de MOMP con Δ49ApoA1 indicó que MOMP está asociada con tNLPs, ya que la etiqueta His solo está presente en el andamio de tNLP Δ49ApoA1 y no en MOMP. MOMP es una proteína altamente insoluble que solo puede eluirse a través de la formación de complejos con tNLPs, que se ha demostrado que facilitan la solubilización de proteínas de membrana.
Las fracciones de elución que contenían MOMP-tNLPs se agruparon y la concentración total de proteínas se determinó utilizando un dispositivo de cuantificación basado en fluorescencia, o un dispositivo que mide la concentración a través de la absorbancia a 280 nm, siguiendo las instrucciones del fabricante para la cuantificación de proteínas. Para permitir una dosificación precisa de la vacuna MOM, también es importante determinar la concentración de MOMP en los complejos purificados. Desarrollamos un método para cuantificar el MOMP basado en la densitometría en gel (Figura 2) en el que se utilizó como estándar un MOMP recombinante purificado con concentración conocida. Al establecer la curva estándar y compararla con la muestra MOMP-tNLP, la concentración de MOMP se puede cuantificar con precisión. La determinación de la concentración de MOMP en la muestra purificada permitió estimar el rendimiento de MOMP en reacciones libres de células a varias escalas, lo cual es importante para planificar la configuración de la reacción apropiada para los estudios posteriores (Tabla 3).
MOMP necesita formar oligómeros para provocar una respuesta inmunitaria robusta11. Para probar el estado oligomérico de MOMP, se analizó MOMP-tNLP en presencia y ausencia tanto de calor como del agente reductor ditiotreitol (DTT, 50 mM, Figura 3A). Los oligómeros de orden superior de MOMP se identificaron a través de SDS-PAGE cuando las muestras no se trataron con calor y DTT. En comparación, las muestras tratadas con calor en presencia de TDT mostraron principalmente dos bandas distintas en el gel, correspondientes a MOMP y Δ49ApoA1 (aproximadamente 40 kDa y 22 kDa, respectivamente). Estos resultados se asemejan mucho al patrón de bandas de gel atribuido a la formación de oligómeros de MOMP, que es fundamental para su eficacia.
Un análisis adicional de Western blot utilizando MAb40, un anticuerpo contra el epítopo lineal en el dominio variable de la proteína MOMP, mostró un patrón de bandas similar, confirmando la formación de oligómeros por la proteína MOMP en su estado no desnaturalizado (Figura 3B). Un factor importante que afecta a la formación de oligómeros MOMP es la relación entre el plásmido MOMP y el plásmido Δ49ApoA1 durante la configuración de la reacción libre de células. En la Tabla 4 se muestra la proporción de plásmidos y la tasa de inserción resultante de MOMP en tNLPs. Estudios previos indicaron que la clamidia MOMP y otras proteínas de la membrana externa pueden existir principalmente como trímeros12. Para maximizar la formación de trímeros en la reacción libre de células, es deseable tener una tasa de inserción cercana a tres proteínas MOMP por NLP, lo que corresponde a una relación de plásmido ~25:1 MOMP a Δ49ApoA1.
Se utilizó un ensayo de transferencia de puntos como un método más simplificado para detectar la presencia de MOMP y tNLP. Se utilizó el anticuerpo MAb40 para detectar MOMP total. Para evaluar la presencia de tNLP se utilizó el anticuerpo MAbHIS dirigido a la etiqueta His en el andamio Δ49ApoA1 de la pNLPt. La coseñalización de los anticuerpos MAb40 y MAbHIS indicó la formación de MOMP-tNLP. La reacción de control produjo tNLP vacío, que solo mostró una señal positiva de MAbHIS (Figura 3C). Para probar la inmunogenicidad de las MOMP-tNLP producidas en la reacción libre de células, adyuvamos MOMP-tNLP con CpG + FSL-1 e inyectamos por vía intramuscular (i.m.) en ratones en un régimen de cebado-refuerzo como se describió anteriormente. Se recogieron sueros de los ratones inmunizados y se midieron los anticuerpos IgG específicos de MOMP mediante un ensayo de Western blot (Figura 4). Los sueros de ratones inyectados con MOMP-tNLP adyuvado mostraron una fuerte unión a MOMP, lo que indica que MOMP-tNLP podría provocar una respuesta inmunitaria in vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig01.jpg"> Figura 1: Expresión y purificación de MOMP-tNLP. (A) Imagen de tubos que contienen pequeñas alícuotas de una reacción libre de células que expresa con éxito los controles de GFP que se iluminan bajo una fuente de luz UV (derecha) en comparación con los lisados sin plásmido de GFP (izquierda). (B) El gel de proteínas teñido con SYPRO Ruby después de SDS-PAGE muestra el perfil de purificación de MOMP-tNLP. MOMP migra a 40 kDa y el 49ApoA1 migra a 22 kDa. Abreviaturas: MOMP = proteína principal de la membrana externa de clamidia; tNLP = partícula de nanolipoproteína de telodendrimer; MOMP-tNLP = complejo MOMP-tNLP; GFP = plásmido fluorescente verde codificante de proteínas; MW = Marcador de peso molecular; T = lisado total de células libres; FT = flujo continuo; R1-R3 = alícuotas de reacción libre de células; W1, W6 = lavados 1 y 6; E1-E7 = Eluciones 1 a 7; Δ49ApoA1 = Derivada de ApoA1 de ratón marcado con His. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig02.jpg"> Figura 2: Cuantificación de MOMP en muestras de MOMP-tNLP. (A) Gel SDS-PAGE teñido con SYPRO Ruby para la cuantificación de MOMP. Se cargó MOMP recombinante con concentración conocida en el gel para obtener la curva estándar. Cada carril contenía 0,1 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg y 4,0 μg de MOMP. Las muestras de MOMP-tNLP que se estaban cuantificando se cargaron en el mismo gel. (B) La curva estándar de concentración MOMP se generó mediante densitometría. Se estableció una ecuación que relaciona la densidad de banda normalizada y la cantidad de MOM. La ecuación se utilizó para calcular el contenido de MOMP en las muestras desconocidas. Abreviaturas: MOMP = proteína principal de la membrana externa de clamidia; tNLP = partícula de nanolipoproteína de telodendrimer; MOMP-tNLP = complejo MOMP-tNLP; SDS-PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig03.jpg"> Figura 3: La MOMP-tNLP producida sin células permite que la MOMP forme estructuras de orden superior. (A) Gel SDS-PAGE de MOMP-tNLP con y sin tratamiento de calor y agente reductor DTT, teñido con SYPRO Ruby. Con el calor y la TDT, el MOMP apareció principalmente como una banda de monómero a ~40 kDa, ya que el calor y el agente reductor descompusieron la mayor parte de la estructura del MOMP de orden superior. En ausencia de calor y TDT, las bandas de orden superior estaban presentes, lo que indica la conformación del oligómero MOM. (B) Western blot de MOMP-tNLP y MOMP solo, sin tratar y tratado con calor y TDT. Después de la transferencia, la membrana se sondeó con MAb40 (dilución 1:1.000). Se observó un patrón de bandas similar al gel teñido con rubí SYPRO, lo que confirma que las bandas de mayor peso molecular eran de hecho oligómeros de MOMP. (C) Mancha de puntos de MOMP-tNLP y muestras vacías de tNLP (por duplicado) sondeadas con MAb40 y MAbHIS. Abreviaturas: MOMP = proteína principal de la membrana externa de clamidia; tNLP = partícula de nanolipoproteína de telodendrimer; MOMP-tNLP = complejo MOMP-tNLP; SDS-PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio; DTT = ditiotreitol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig04.jpg"> Figura 4: La MOMP-tNLP producida libremente es altamente inmunogénica. El suero de ratones inmunizados mostró una fuerte señal de IgG anti-MOM. Para inmunizar ratones se utilizó MOMP-tNLP adyuvado con CpG + FSL-1. Se recolectaron, agruparon y utilizaron sueros de seis ratones inmunizados para sondear MOMP-tNLP. El suero fue capaz de unirse a MOMP en un ensayo de Western blot y mostró una fuerte señal de IgG (izquierda). El western blot que utilizó MAb40 como anticuerpo primario (derecha) mostró bandas similares, lo que indica que el suero contenía IgG específica de MOMP. Abreviaturas: MOMP = proteína principal de la membrana externa de clamidia; tNLP = partícula de nanolipoproteína de telodendrimer; MOMP-tNLP = complejo MOMP-tNLP; CpG = adyuvante de CpG modificado con colesterol; FSL-1 = adyuvante lipofílico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre del búfer</td>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>Imidazol</td>
			<td>pH</td>
		</tr><tr><td>Búfer de enlace</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Tampón de lavado</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Tampón de elución 1</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>250 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Tampón de elución 2</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Lista de tampones necesarios para la purificación por afinidad de níquel detallando las concentraciones de cada componente y el pH.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Ejecución</td>
			<td>50 minutos</td>
		</tr><tr><td>Gasto</td>
			<td>6.0 mL/min</td>
		</tr><tr><td>Tipo de degradado</td>
			<td>Binario</td>
		</tr><tr><td>Búfer A</td>
			<td>10 mM TEAA en H20</td>
		</tr><tr><td>Búfer B</td>
			<td>MeCN</td>
		</tr><tr><td>Gradiente</td>
			<td>% de tampón B</td>
		</tr><tr><td>0 minutos</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>30 minutos</td>
			<td>60%</td>
		</tr><tr><td>30.5 minutos</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40 minutos</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40.5 minutos</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>50 minutos</td>
			<td>25%</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Condiciones para la purificación por HPLC en fase reversa de CpG modificado con colesterol. Abreviaturas: TEAA = acetato de trietilamonio; MeCN = acetonitrilo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lisado libre de células (mL)</td>
			<td>Lípidos DMPC (mg)</td>
			<td>Telodendrimer (mg)</td>
			<td>Plásmido MOMP (μg)</td>
			<td>Rendimiento de MOMP purificado (mg)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>0.4</td>
			<td>15</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>8</td>
			<td>0.8</td>
			<td>30</td>
			<td>1.1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>12</td>
			<td>1.2</td>
			<td>45</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>75</td>
			<td>2.7</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: La cantidad de lípidos, telodendrimeros y plásmidos utilizados para reacciones libres de células a diferentes escalas y los rendimientos correspondientes. Abreviaturas: MOMP = proteína principal de la membrana externa de clamidia; DMPC = 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Proporciones de entrada de plásmidos, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>1:1</td>
			<td>5:1</td>
			<td>10:1</td>
			<td>25:1</td>
			<td>50:1</td>
			<td>100:1</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Proporciones de la cantidad de proteína producida, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>0.02</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.64</td>
			<td>3.46</td>
			<td>6.55</td>
			<td>20.04</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Número estimado de inserciones de MOMP por tNLP</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.75</td>
			<td>4.04</td>
			<td>7.65</td>
			<td>23.39</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 4: Las proporciones de plásmidos en una reacción libre de células y las tasas de inserción de MOMP resultantes. Abreviaturas: MOMP = proteína principal de la membrana externa de clamidia; tNLP = partícula de nanolipoproteína de telodendrimer; Δ49ApoA1 = Derivada de ApoA1 de ratón marcado con His.

Este protocolo describe el uso de kits comerciales de expresión de proteínas libres de células para producir proteínas de membrana soportadas en nanodiscos que se pueden usar como antígenos en vacunas de subunidades.

Producción de escamas libres de células y adición adyuvante a una proteína principal recombinante de membrana externa de Chlamydia muridarum para el desarrollo de vacunas

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard ...

Muchos antígenos candidatos de la vacuna de subunidades son proteínas de membrana. Históricamente, estos han sido difíciles de producir y purificar en cantidades suficientes. Con esta técnica, podemos crear antígenos de interés incrustados dentro de una membrana lipídica para ayudar a garantizar una confirmación similar a la nativa.Este proceso también facilita la formulación con adyuvantes de interés. La expresión libre de células permite la producción rápida de proteínas de interés en su estructura nativa sin etiquetas. Esta técnica también es escalable y ya estamos trabajando con empresas comerciales para desarrollar formulaciones de vacunas utilizando este proceso.Aquí demostramos el proceso para un antígeno de clamidia, pero el proceso podría adaptarse fácilmente para producir antígenos de interés, independientemente de si son o no proteínas de membrana. Este proceso puede ser aplicable tanto al desarrollo de vacunas contra patógenos como contra el cáncer. Para empezar, prepare MOMP-tNLP empleando un método libre de células.Descongele el tampón de reconstitución del kit de expresión de proteínas libres de células dos horas antes de configurar la reacción y agregue un inhibidor de la proteasa libre de EDTA al tampón. Utilice un kit diseñado para ejecutar cinco reacciones de un mililitro. Por cada reacción de un mililitro, agregue 525 microlitros de tampón de reconstitución a la botella de lisado de E. coli y enróllela para que se disuelva.Añadir 250 microlitros del tampón de reconstitución al frasco de reacción que contiene el aditivo y disolver enrollando. A continuación, agregue 8,1 mililitros de tampón de reconstitución a la botella de alimentación de reacción y enróllela para que se disuelva. A un frasco de mezcla de aminoácidos, agregue tres mililitros de tampón de reconstitución para disolverlo.A otra botella de metionina, agregue 1,8 mililitros de tampón de reconstitución, disuélvalo y guárdelo en hielo. Agregue 225 microlitros de la mezcla reconstituida, 270 microlitros de la mezcla de aminoácidos reconstituidos sin metionina y 30 microlitros de metionina reconstituida a la botella de lisado de E. coli. Además, agregue 400 microlitros de la mezcla DMPC/telodendrimer, 15 microgramos de plásmido MOMP y 0,6 microgramos de delta-49ApoA1 a la mezcla y mézclela.Alícuota 20 microlitros de la solución total en un tubo de 1,5 mililitros Para una reacción de control que exprese GFP. Prepare una solución de alimentación añadiendo 2,65 mililitros de la mezcla de aminoácidos reconstituidos sin metionina y 300 microlitros de metionina reconstituida. Transfiera un mililitro de la solución de reacción a la cámara de reacción interna en el kit de reacción libre de células y séllelo.Llene la cámara exterior del recipiente de reacción con 10 mililitros de la solución de alimentación y ciérrela. Agregue 0,5 microlitros del plásmido de control GFP a las alícuotas de 20 microlitros de la mezcla de reacción. Coloque la reacción en un agitador a 300 rotaciones por minuto durante 18 horas a 30 grados centígrados.Controle la reacción bajo una luz ultravioleta después de 15 minutos para detectar fluorescencia debido a la síntesis de GFP. Purifique el complejo de nanopartículas MOMP-tNLP de la mezcla de reacción libre de células mediante cromatografía de afinidad de níquel inmovilizada utilizando la etiqueta HIS en la proteína delta-49ApoA1. Transfiera un mililitro de la suspensión al 50 % de la resina de purificación HIS-tag a una columna de cromatografía desechable de 10 mililitros y agregue tres mililitros de tampón aglutinante para equilibrar.Después, escurre el tampón y añade 250 microlitros de tampón aglutinante a la resina. Extraiga 20 microlitros de la mezcla de reacción libre de células para el análisis SDS-PAGE. Agregue la mezcla de reacción libre de células restante con la resina equilibrada e incube en un balancín de laboratorio durante una hora a cuatro grados centígrados.Retire la tapa de la columna y lávela con 500 microlitros de tampón aglutinante. Agregue el líquido de lavado a la columna y recoja el flujo para el análisis SDS-PAGE. Lavar la columna con un mililitro de tampón de lavado con 20 milimolares de imidazol seis veces y recoger las fracciones.Mientras lava por segunda vez, use una pipeta de un mililitro para agitar la resina. Eluir los MOMP-tNLPs en seis fracciones de 300 microlitros de tampón de elución I que contienen 250 milimolares de imidazol y una elución final con 300 microlitros de tampón de elución II que contiene 500 milimolares de imidazol. En la segunda elución, agite vigorosamente la resina pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de un mililitro.Utilice un generador de imágenes de gel para capturar las imágenes a 600 nanómetros. A continuación, cuantificar la cantidad de proteínas diferentes en las nanopartículas mediante el análisis SDS-PAGE utilizando un estándar de proteínas. Dibuje una curva estándar utilizando las densidades de las bandas MOMP.A continuación, determine el componente MOMP de las nanopartículas con el estándar. Resuelva las muestras con SDS-PAGE y transfiera las pilas de gel utilizando un sistema comercial de transferencia seca para el análisis de Western blot. Retire las manchas de la pila e incorpórelas durante la noche a cuatro grados centígrados en un tampón de bloqueo que contenga 0,2% TWEEN 20 y 0,5 microgramos por mililitro MAb40, o 0,2 microgramos por mililitro de anticuerpo antiHIS-tag MAbHIS dirigido contra la etiqueta HIS de la proteína delta-49ApoA1.Lave cada mancha con PBST tres veces durante cinco minutos por lavado. Incubar las transferencias durante una hora en un tampón de bloqueo que contenga un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo en una dilución de 1:10.000. Repita los lavados con PBST y capture la imagen con un generador de imágenes de fluorescencia después del lavado final.Usando un aparato de transferencia de puntos, seque tres microgramos de MOMP-tNLP y tNLP vacío. Revele y bloquee las manchas utilizando el mismo método para Western blot. Congele la solución mezclada en hielo seco y liofícela durante la noche con un liofilizador.Guarde las formulaciones secas a menos 20 grados centígrados. Cuando sea necesario, reconstituya los tNLP liofilizados con agua libre de endotoxinas y enróllelos para disolverlos y rehidratarlos. Diálisis la solución con PBS y elimine la trehalosa con una membrana de diálisis de corte de 3,5 kilodalton.Centrifugar la solución de nanopartículas en un concentrador de vacío antes de añadir el adyuvante. Controle el volumen de la muestra después de 20 a 30 minutos para evitar que se seque por completo. En una cabina de bioseguridad, agregue el adyuvante en condiciones estériles.Utilizando cromatografía analítica de exclusión por tamaño, analice la formulación para una incorporación exitosa. Almacene los MOMP-tNLP adyuvados y vacíe los tNLP a cuatro grados centígrados durante un máximo de 14 días. Analizar la estabilidad de la formulación de tNLP con cromatografía de exclusión por tamaño.El análisis SDS-PAGE de MOMP-tNLP se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad de níquel, lo que demostró que la mezcla de reacción libre de células tiene altos niveles de expresión tanto para la proteína MOMP como para la proteína delta-49ApoA1. Mediante el empleo de densitometría en gel, la concentración de MOMP se cuantificó utilizando un MOMP recombinante purificado con una concentración conocida como estándar. Para determinar la formación de oligómeros, SDS-PAGE MOMP y MOMP-tNLP fueron tratados con calor y DTT, que mostraron bandas distintas para MOMP y delta-49ApoA1.Se empleó el análisis de Western blot utilizando un anticuerpo MAb40 contra la proteína MOMP, que reveló un patrón de bandas que confirma la formación de oligómeros por la proteína MOMP en su estado no desnaturalizado. Se realizó un ensayo de transferencia de puntos en presencia de anticuerpos MAb40 y MAbHIS, que indicaron la formación de MOMP-tNLP. Sin embargo, la pNLP vacía mostró una señal positiva para MAbHIS.Los sueros de los ratones inmunizados inyectados con MOMP-tNLP adyuvante demostraron una fuerte unión a MOMP e indicaron que MOMP-tNLP podría provocar una respuesta inmunitaria. Dado que este protocolo genera proteínas a partir del ADN, es esencial evitar contaminar la reacción con la DNasa, la ARNasa, así como el ADN y el ARN extraños. Cualquier material o reactivo utilizado en las reacciones debe estar libre de este tipo de moléculas.Después de la expresión, purificación y adición de adyuvantes, estas vacunas candidatas pueden evaluarse en modelos animales apropiados para los patógenos de interés para evaluar los marcadores de activación inmunitaria o evaluar la protección durante un desafío. En el caso de la clamidia, la principal proteína de la membrana externa, o MOMP, se ha considerado un antígeno candidato líder para las vacunas de subunidades durante muchos años, pero ha sido difícil producirla a las escalas necesarias para la aplicación de la vacuna. La coexpresión libre de células de esta proteína de membrana es una forma viable de comenzar a mover esta proteína hacia la evaluación en modelos animales como ratones y, finalmente, hacia las pruebas en humanos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Gilmore, S. F., et al. Producción a escala libre de células y adición adyuvante a una proteína principal de membrana externa recombinante de Chlamydia muridarum para el desarrollo de vacunas. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra la síntesis libre de células de antígenos de proteínas de membrana estabilizados con nanodiscos utilizando un sistema de doble compartimento. El dispositivo mantiene las condiciones óptimas para una síntesis eficiente de proteínas, un plegamiento adecuado y...

Síntesis de antígenos proteicos de membrana estabilizados con nanodiscos mediante un sistema libre de células

Fuente: Gilmore, S. F. et al. Producción a escala libre de células y adición adyuvante a una proteína principal de membrana externa recombinante de Chlamydia muridarum para el desarrollo de vacunas. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra el uso de Western blot para evaluar la integridad estructural de la proteína principal de la membrana externa (MOMP) dentro de complejos de vacunas basados en nanopartículas. Describe los pasos clave involucrados en la transferencia de proteínas, el etiquetado...

Western Blot para evaluar la integridad estructural de un antígeno de vacuna bacteriana

Este video muestra una técnica de homogeneización eficiente para generar una emulsión adyuvante de antígeno para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en un modelo murino. La emulsión contiene un autoantígeno, la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG), en la fase acuosa, rodeada por una fase oleosa continua que comprende una bacteria patógena inactivada. La emulsión asegura una liberación sostenida de antígenos para una respuesta inmunitaria prolongada.

Preparación de una emulsión antigénica adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune

Este video muestra un método para generar vacunas de vesículas de membrana externa (OMV) de visualización multivalente. Las células de mamíferos se transfectan para expresar y secretar antígenos virales fusionados a un SpyTag y un tag de polihistidina. A continuación, estos antígenos se purifican utilizando una columna de afinidad de ácido níquel-nitritriacético (Ni-NTA). El antígeno purificado se mezcla con vesículas de membrana externa que expresan la proteína SpyCatcher (SC) unida a la...

Generación de una vacuna multivalente contra vesículas de membrana externa

A continuación, presentamos un protocolo para generar un adenovirus divalente tipo 5 (Ad5) vectores de prueba de principio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 mediante la utilización de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación. Este vector se demostró la aptitud para exhibir cualitativa, la capacidad de escapar de sueros Ad5-positivo in vitro, y la antigenicidad, así como la inmunogenicidad de los antígenos incorporados.

La utilización de la Estrategia de la cápside-Incorporación Antigen para el desarrollo de enfoques adenovirus serotipo 5-Vectored de vacunas

Hay una falta general de conocimiento sobre cómo funcionan las vacunas. Aquí proponemos el uso combinado de genética inversa y ratones quiméricos de médula ósea para obtener información sobre las respuestas inmunitarias tempranas del huésped a las vacunas, con un enfoque especial en las células dendríticas y la inmunidad de las células T.

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

A continuación, se presenta un protocolo para la síntesis de partículas similares a virus, ya sea utilizando baculovirus o sistemas de expresión de mamíferos, y la purificación ultracentrifugación. Este enfoque altamente adaptable se usa para identificar antígenos virales como objetivos de vacunas de una manera segura y flexible.

Expresión y purificación de partículas similares al virus para la Vacunación

Aquí se proporciona un método detallado que describe la purificación, el enjuimiento y la caracterización de nanopartículas de proteínas autoensamblables (SAPN) para su uso en el desarrollo de vacunas.

Producción de E. coli-expresada Nanopartículas de Proteína Auto-Ensamblaje para Vacunas Que Requieren Presentación de Epitope Trimérico

Para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple, los ratones son inmunizados con una emulsión de agua en aceite que contiene un autoantígeno y un adyuvante completo de Freund. Si bien existen varios protocolos para la preparación de estas emulsiones, aquí se presenta un protocolo de homogeneización rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones.

Un método de homogeneización rápido, simple y estandarizado para preparar emulsiones de antígeno/adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune experimental

Este protocolo detalla el enriquecimiento de vesículas extracelulares micobacterianas nativas (mEVs) de cultivos axénicos de Mycobacterium smegmatis (Msm) y cómo se pueden diseñar y enriquecer msmEVs recombinantes que contienen mCherry (un reportero fluorescente rojo). Por último, se verifica el novedoso enfoque con el enriquecimiento de MsmEVs que contienen la proteína EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

El presente protocolo prepara y evalúa las propiedades físicas, la respuesta inmune y el efecto protector in vivo de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión.

Evaluación de la respuesta inmune de una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra la infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM)

Aprende a producir proteínas de membrana en nanodiscos mediante expresión celular libre para desarrollo de vacunas subunidad. Este método escalable permite obtener antígenos con conformación nativa de Chlamydia muridarum.

Producción de escamas libres de células y adición adyuvante a una proteína principal recombinante de membrana externa de Chlamydia muridarum para el desarrollo de vacunas (Video) | JoVE Journal

Producción de escamas libres de células y adición adyuvante a una proteína principal recombinante de membrana externa de Chlamydia muridarum para el desarrollo de vacunas

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