Recopilación, expansión y diferenciación de modelos primarios de células epiteliales nasales humanas para la cuantificación de la frecuencia de latido de los cilios

Describimos la colección de células madre de las vías respiratorias de la mucosa nasal. Estas células se expanden y diferencian en un epitelio pseudoestratificado en el laboratorio. Esto es expansión y diferenciación in vitro, que es similar a nuestras vías respiratorias in vivo, lo que significa que hay células especializadas, como las células ciliadas, presentes que se pueden utilizar para cuantificar la frecuencia de latido de los cilios.

Para permitir una cuantificación consistente y reproducible de la frecuencia de latidos de los cilios entre diferentes individuos y en respuesta a diferentes medicamentos, estandarizamos las condiciones de cultivo y la adquisición de imágenes. Las mediciones de la frecuencia de latidos de los cilios se utilizan como herramientas clínicas en enfermedades como la discinesia ciliar primaria. Esperamos establecer esto como un marcador clínico para la fibrosis quística.

Demostrando el procedimiento están Katelin Allan y Laura Fawcett, estudiantes de doctorado de mi laboratorio, y la Dra. Sharon Wong, un postdoctorado de mi laboratorio. Comience pidiéndole al participante que respire por la boca. Luego, tome un cepillo de citología en la mano dominante y apoye el quinto dígito en la barbilla del participante para anclar la mano, inserte el cepillo de citología en el pasaje nasal del participante en un ángulo de 45 grados con respecto a la cara del participante y páselo a través del meato nasal.

Después de girar el cepillo hacia arriba, de modo que quede perpendicular a la cara del participante, avance el cepillo suavemente, pero firmemente, contra la pared lateral de la nariz debajo del cornete inferior hasta que esté en la parte media a posterior del cornete inferior. Gire el pincel 360 grados hasta tres veces. Luego retírelo suavemente, invirtiendo la maniobra de inserción, para que las células no se desprendan del cepillo.

Coloque el cepillo en el tubo de recolección preparado con medios de recolección de células nasales y coloque el tubo de recolección en hielo. Después de un vórtice suave para desalojar las células del cepillo, transfiera el tubo de recolección con hielo al gabinete de bioseguridad. Usando una pipeta serológica, transfiera el medio del tubo de recolección a un nuevo tubo, dejando atrás los cepillos citológicos.

Luego centrifugar la muestra. Después de la centrifugación, resuspender el pellet celular en un mililitro de medios celulares de reprogramación condicional. Luego, usando una pipeta serológica de cinco mililitros, pase las células a través de un tamiz celular colocado sobre un tubo de 50 mililitros en un movimiento circular.

Para obtener una suspensión de una sola celda, recoja la suspensión del fondo del tubo y pásela a través del tamiz varias veces. Luego deseche el tamiz celular. Para sembrar las células epiteliales de las vías respiratorias en los insertos de soporte permeables preparados, mezcle bien las células sin crear burbujas, asegurándose de que sean homogéneas y estén en suspensión.

Luego agregue 150 microlitros de la suspensión celular al lado apical de los insertos de soporte permeables preparados. Para diferenciar las células epiteliales de las vías respiratorias en la interfaz aire-líquido, cultivarlas en diferenciación o medios ALI durante dos días. Luego aspire el medio y agregue 750 microlitros de medios ALI solo al compartimiento basal para crear una interfaz aire-líquido.

Para sembrar las células epiteliales de las vías respiratorias en domos de ECM, resuspender las células epiteliales disociadas de las vías respiratorias con el volumen apropiado de 90% ECM. Luego, sosteniendo la pipeta verticalmente en un ángulo de 90 grados lo más cerca posible del fondo del pozo, dispense 50 microlitros de la suspensión de celda ECM al centro del pozo. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 20 minutos hasta que la ECM se solidifique.

Mientras el ECM se solidifica, caliente el medio de siembra organoide de las vías respiratorias, o AOSM, a temperatura ambiente para evitar que cause relicuación y desintegración de la cúpula ECM al agregarse. Después de la incubación, agregue 500 microlitros de AOSM calentado a cada pocillo dispensando la pared del pozo. No pipetear los medios directamente sobre la cúpula ECM.

Cambie los medios cada dos días durante cuatro a siete días. Para aspirar el medio, incline la placa en un ángulo de 45 grados y aspire desde el borde inferior del pozo lejos de la cúpula ECM. Después de cuatro a siete días, inicie la diferenciación organoide agregando 500 microlitros de medios de diferenciación de organoides de las vías respiratorias calentados, o AODM, a cada pocillo, y cambie los medios cada dos días durante siete días.

Coloque la placa de cultivo que contiene los modelos de células epiteliales de las vías respiratorias en el inserto de la placa del microscopio y cierre la cámara ambiental del microscopio. Deje que la muestra se equilibre en la cámara de microscopio precalentada, 37 grados centígrados, 5% llena de dióxido de carbono durante 30 minutos. En el ocular del microscopio, concéntrese en el modelo celular.

Luego, utilizando el software de adquisición, haga clic en L100 para cambiar la ruta de la luz al puerto donde está montada la cámara. Haga clic en el botón verde Reproducir para visualizar el campo de visión del microscopio a través del software. Verifique que los cilios estén enfocados y ajuste si es necesario.

Para adquirir imágenes de lapso de tiempo desde el menú, haga clic en Adquirir y luego en Fast TimeLapse. En la ventana emergente, seleccione una ubicación para guardar y un nombre de archivo, adquiera 1, 000 fotogramas. Para obtener una vista previa de los cilios en el campo de visión del microscopio, haga clic en Aplicar, seguido del botón verde Reproducir.

Ajuste el enfoque Z si es necesario. A continuación, haga clic en Ejecutar ahora para capturar el lapso de tiempo rápido. Después de instalar el software y las cajas de herramientas necesarios, copie los scripts de análisis personalizados adecuados y la carpeta de scripts de soporte en la unidad local del equipo.

A continuación, sobre el software informático, haga clic en la pestaña Inicio, seguido de Establecer ruta. En la ventana emergente, haga clic en Agregar con subcarpetas. En la ruta de búsqueda de MATLAB, seleccione la carpeta que se muestra.

Luego haga clic en Guardar y cerrar. Confirme que los scripts de análisis están vinculados al software informático comprobando que aparecen en el panel izquierdo. A continuación, transfiera los archivos de imagen sin procesar de ejemplo adquiridos a la unidad local del equipo.

Luego haga clic en el BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. M Archivo de script de análisis en el software informático. Para ejecutar el script, haga clic en la pestaña Editor, seguido del botón verde Reproducir.

En la ventana de solicitud que aparece, seleccione los archivos de imagen sin procesar que desea analizar. Introduzca el tiempo de exposición para el tiempo de adquisición por fotograma. Luego haga clic en Aceptar. Ejecute GetFirstAmplitude.

m script en la carpeta que contiene los archivos AveSpectrum. Espere a que el script genere FirstAmplitudeStacked. XLSX, que contiene la frecuencia de amplitud más alta, y está dentro del rango fisiológico de latidos epiteliales de las vías respiratorias.

Copie los valores de frecuencia de FirstAmplitudeStacked. XLSX, y trazarlos usando software de análisis científico. Se presentan los resultados de la frecuencia de latidos de los cilios medida en modelos de ALI de células epiteliales de las vías respiratorias derivados de tres participantes con fibrosis quística y tres participantes control sanos.

En el día 14 de diferenciación del cultivo, los cilios vencidos estuvieron presentes. Desde el día 14, día 21 de diferenciación de cultivos, no se observó un aumento estadísticamente significativo en la frecuencia de latidos de cilios entre las cohortes. En el día 21 de diferenciación del cultivo, la frecuencia media de latidos de los cilios para los participantes de control sanos fue significativamente mayor que la de los participantes con fibrosis quística.

Además, cuando se obtuvo una imagen de la frecuencia de latidos de los cilios en los mismos modelos celulares después de la eliminación del moco, hubo un aumento estadísticamente significativo en la frecuencia de latidos de los cilios cuando se eliminó el moco en modelos de ALI de individuos sanos y aquellos con fibrosis quística. El entorno de imágenes debe estar estrictamente regulado, ya que la función de los cilios es extremadamente susceptible a los cambios en los factores ambientales. Esta plataforma tiene el potencial de establecerse para la detección de medicamentos específicos del paciente para poder identificar medicamentos que modulan la función CFTR.