Name: Célula única reutilizable para análisis epigenómicos iterativos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende el método de célula única reutilizable para análisis epigenómicos iterativos que permite estudiar múltiples marcas epigenéticas en la misma célula. Esta técnica facilita la validación estadística y el diseño de terapias epigenéticas cuando las células de pacientes son limitadas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a los doctores David Sánchez-Martin y Christopher B. Buck por sus comentarios durante la etapa de conceptualización del proyecto. También agradecemos al Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health por su ayuda en experimentos preliminares, y al Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH por su asesoramiento en análisis computacional. Anna Word por ayudar con la optimización de las ADN polimerasas utilizadas en el método. Este trabajo utilizó los recursos computacionales del clúster Biowulf (http://hpc.nih.gov) de NIHHPC. Este proyecto es apoyado por el Programa Intramuros del Centro de Investigación del Cáncer, el Instituto Nacional del Cáncer, los Institutos Nacionales de Salud, el Premio a la Innovación del Director del NCI (#397172) y fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer bajo el Contrato No. HHSN261200800001E. Agradecemos a los doctores Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy y a todos los miembros del Laboratorio de Oncología Celular por sus comentarios productivos.

<ol><li>Perkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+enters+the+multiomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis enters the multiomics age.</a> Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra+high-throughput+method+for+single-cell+joint+analysis+of+open+chromatin+and+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptome+in+single+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain.</a> Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).</li>
<li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility%2C+gene+expression+and+protein+levels+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells.</a> Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li>
<li>Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+epigenomic+analyses+in+the+same+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Iterative epigenomic analyses in the same single cell.</a> Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).</li>
<li>Tosato, G., Ohnuki, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosato%2C+G+%22Methods+of+preparing+a+re-usable+single+cell+and+methods+fro+analyzing+the+epigenome%2C+transcriptome%2C+and+genome+of+a+single+cell%22">Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell</a>. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+integration+labelling+method+enables+epigenomic+profiling+with+lower+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Marina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-catalyzed+oxidation+of+intragenic+5-methylcytosine+regulates+CTCF-dependent+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing.</a> EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).</li>
<li>Weast, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22Handbook+of+chemistry+and+physics%3A+a+ready-reference+book+of+chemical+and+physical+data.+56th+edn%22">Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn</a>. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).</li>
<li>Porstmann, T., Kiessig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+techniques.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay techniques. An overview.</a> Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+library+prep+approaches+for+sequencing+low+input+translatome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples.</a> BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Ku, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+immunocleavage+sequencing+%28scChIC-seq%29+to+profile+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification.</a> Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Ohnuki y Tosato son coinventores de una patente titulada "Métodos para preparar una sola célula reutilizable y métodos para analizar el epigenoma, el transcriptoma y el genoma de una sola célula" (EP3619307 y US20200102604). La solicitud de patente se presentó en parte sobre la base de los resultados preliminares relacionados con la tecnología descrita en el manuscrito actual. La invención o invenciones descritas y reivindicadas en esta solicitud de patente se realizaron mientras los inventores eran empleados a tiempo completo del Gobierno de los Estados Unidos. Por lo tanto, bajo 45 Código de Regulaciones Federales Parte 7, todos los derechos, títulos e intereses de esta solicitud de patente han sido o deben ser asignados por ley al Gobierno de los Estados Unidos. El Gobierno de los Estados Unidos transfiere una parte de las regalías que recibe a sus empleados inventores en virtud del artículo 3710c del Código de los Estados Unidos.

Este artículo describe el protocolo paso a paso para el análisis multiepigenómico unicelular recientemente reportado utilizando células individuales reutilizables7. En los párrafos siguientes, discutimos puntos críticos, enfatizando las posibles limitaciones en el protocolo. 
Uno de los puntos críticos a lo largo del protocolo (de los pasos 7.2-13) es evitar la contaminación por DNasa. Una sola célula solo tiene dos copias de ADN genómico. Por lo tanto, el ADN genómico ...

La tecnología unicelular está entrando en la era de la multiómica unicelular, que integra tecnologías ómicas unicelulares individuales1. Recientemente, la transcriptómica unicelular se ha combinado con métodos para detectar la accesibilidad a la cromatina (scNMT-seq2 y SHARE-seq3) o modificaciones de histonas (Paired-seq4 y Paired-Tag5). Más recientemente, la transcriptómica y la proteómica unicelular se integraron con la accesibilidad a la cromatina (DOGMA-seq6). Estos métodos utilizan el etiquetado basado en transposasa para detectar la accesibilidad de la cromatina o las modificaciones de histonas.
Los enfoques basados en transposasa escinden el ADN genómico y agregan un código de barras de ADN al final del fragmento de ADN genómico. Cada fragmento genómico escindido solo puede aceptar hasta dos códigos de barras de ADN (= una marca epigenética por sitio de escisión), y el ADN genómico en el sitio de escisión se pierde. Por lo tanto, los enfoques basados en la escisión tienen una compensación entre el número de marcas epigenéticas probadas y la densidad de la señal. Esto dificulta el análisis de múltiples marcas epigenéticas en la misma célula. Para superar este problemase desarrolló un método epigenómico unicelular que no escinde el ADN genómico 7,8.
Además del problema derivado de la escisión mencionado anteriormente, los enfoques basados en la transposasa tienen otras limitaciones. En el análisis del epigenoma unicelular, es fundamental conocer la ubicación de las histonas y las proteínas asociadas al ADN en el genoma. En los enfoques actuales, esto se logra mediante el uso de células individuales no fijadas y la retención de interacciones proteína-ADN y proteína-proteína. Sin embargo, esto genera un fuerte sesgo a las regiones de cromatina accesibles, incluso en el análisis de modificaciones de histonas 9. La ubicación de las histonas y las proteínas asociadas al genoma en el genoma se puede preservar sin reticulación proteína-ADN y proteína-proteína, utilizando un andamio de poliacrilamida 7,8. Este enfoque reduce el sesgo estructural observado en los enfoques actuales que dependen de las interacciones proteína-ADN y proteína-proteína.
Los enfoques basados en transposasa pueden adquirir señales solo una vez de una sola célula. Por lo tanto, es difícil delinear el epigenoma completo de una sola célula debido a la caída de las señales. Las células individuales reutilizables se han desarrollado para superar las limitaciones actuales al permitir el análisis epigenómico iterativo en la misma célula individual.

<table><tbody><tr><td>10x Tampón CutSmart</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004</td><td>10x Tampón de digestión</td></tr><tr><td>Etanol de 200 grados</td><td>Warner-Graham Company</td><td>Anticuerpo</td><td></td></tr><tr><td>monoclonal de etanol 5-hidroximetilcitosina (5-hmC) de etanol de 200 pruebas [HMC/4D9]</td><td>Epigentek</td><td>A-1018-100</td><td>Anti-5hmC</td></tr><tr><td>Tinción de naranja/yoduro de propidina</td><td>Logos</td><td>Biosystems F23001</td><td>Contador de células</td></tr><tr><td>Solución de acrilamida, 40% en H2O, para biología molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>01697-500ML</td><td>Solución de acrilamida al 40%</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia todo en uno BZ-X710</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>Microscopio de barrido</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Unidad de filtro centrífugo</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510024</td><td>Casete de ultrafiltración</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio para biología</td> <td>molecularMilliporeSigma</td><td>A3678-100G</td><td>Polvo de persulfato de amonio</td></tr><tr><td>DMF anhidro</td><td>Laboratorios</td> vectoriales <td>S-4001-005</td><td>N,N-dimetilformamida anhidra (DMF)</td></tr><tr><td>Anti-ARN polimerasa II CTD repetición YSPTSPS (fosfo S5) anticuerpo [4H8]</td><td>Abcam</td><td>ab5408</td><td>Anti-Pol II</td></tr><tr><td>Anti-TRAP220/MED1 (fosfo T1457)</td><td>anticuerpo Abcam</td><td>ab60950</td><td>Anti-Med1</td></tr><tr><td>BciVI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0596L</td><td>BciVI</td></tr><tr><td>Solución de albúmina sérica bovina, 20 mg/ml en H2O, baja biocarga, sin proteasa, para biología molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>B8667-5ML</td><td>20% BSA (Tabla 7)</td></tr><tr><td>Bst ADN polimerasa, fragmento grande</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td>Bst ADN polimerasa</td></tr><tr><td>BT10 Serie 10 y micro; l Punta de barrera</td><td>NEPTUNE</td><td>BT10</td><td>P10 punta de baja retención</td></tr><tr><td>CellCelector</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>N/A</td><td>Robot automatizado de selección de una sola célula</td></tr><tr><td>CellCelector 4 nl placas de nanopocillos para clonación de una sola célula, placa S200-100 100K, 24 pocillos,ULA</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>CC0079</td><td>4 nL placa de nanopocillos</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>Chloroform</td></tr><tr><td>Corning Costar de 96 pocillos, tratado con cultivo celular, microplaca de fondo plano</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Placas de fondo plano de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Deep Vent (exo-) ADN polimerasa</td><td>New England BioLabs</td><td>M0259L</td><td>Exo- ADN polimerasa</td></tr><tr><td>Tubos LoBind de ADN, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td>0,5 mL Tubo de baja unión</td></tr> al <tr><td>ADN Oligo, 1ª cebadora aleatoria</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>N/ A, ver Tabla 3</td><td>1º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#01</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#02</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#03</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#04</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#05</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#06</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#07</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#08</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#09</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#10</td><td>Tecnologías de ADN Integradas</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#11</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#12</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador aleatorio</td></tr><tr><td>ADN Oligo, 2º cebador de síntesis</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>2º cebador</td></tr> <tr><td>de síntesisDNA Oligo, Adaptador de Ligadura</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>Adaptador de Ligadura</td></tr><tr><td>DNA Oligo, Clonación Inversa Integrated</td><td>DNA Technologies</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>Clonación Inversa Imprimación</td></tr><tr><td>DNasa I (sin RNasa)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303L</td><td>DNasa I (sin RNasa, 4 U).</td></tr><tr><td>Tampón de reacción de DNasa I</td><td>New England BioLabs</td><td>B0303S</td><td>10x Tampón de DNasa I (NEB)</td></tr><tr><td>Mezcla dNTP (10 mM cada uno)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>10 mM dNTPs</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, origen de EE. UU.,</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td>Suero fetal bovino</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit de síntesis de ARN de alto rendimiento</td><td>New England BioLabs</td><td>E2040S</td><td>Mezcla maestra de transcripción in vitro</td></tr><tr><td>Anticuerpo de histona H3K27ac</td><td>Motivo activo</td><td>39133</td><td>Anti-H3K27ac</td></tr><tr><td>Anticuerpo de histona H3K27me3</td><td>Motivo activo</td><td>39155</td><td>Anti-H3K27me3</td></tr><tr><td>IgG de suero de conejo</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5006-10MG</td><td>Control IgG Nanopolvo</td></tr><tr><td>magnético de óxido de hierro (II,III), tamaño medio de la pieza de 30 nm (TEM), éster NHS funcionalizado</td><td>MilliporeSigma</td><td>747467-1G</td><td>Polvo de óxido de hierro funcionalizado con éster NHS de 30 nm</td></tr><tr><td>K-562</td><td>Colección de cultivos tipo americano (ATCC)</td><td>Células CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida lineal (5 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9520</td><td>Acrilamida lineal</td></tr><tr><td>LUNA-FL Contador de células de fluorescencia dual</td><td>Logos</td><td>Biosystems L20001</td><td>Contador</td></tr><tr><td>de células LUNA Portaobjetos de recuento de células, 50 portaobjetos Logos</td><td>Biosystems</td><td>L12001</td><td>Contador de células</td></tr><tr><td>Aceite mineral, BioReactivo, para biología molecular, aceite ligero</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5904-500ML</td><td>Aceite mineral</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiamina para biología molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>T7024-100ML</td><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiamina</td></tr><tr><td>NaCl (5 M), sin RNasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td>5M NaCl</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Fisher</td><td>2516</td><td>&nbsp; espectrofotómetro de microvolumen</td></tr><tr><td>NEST 2 mL Placa de pocillos profundos de 96 pocillos,</td><td>Opentrons</td> de fondo en V <td>N/A</td><td>2 mL de pocillo profundo Placa de 96</td></tr><tr><td>pocillos sin faldón Placa de PCR de 96 pocillos</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-405</td><td>Placa de PCR de 96 pocillos</td></tr><tr><td>NuSive GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida OmniPur de Agarose: Bis-acrilamida 19:1, solución al 40%</td><td>MilliporeSigma</td><td>1300-500ML</td><td>40%Acrilamida/Bis-acrilamida</td></tr><tr><td>Robot de laboratorio OT-2</td><td>Opentrons</td><td>OT2</td><td>Robot automatizado de manipulación de líquidos</td></tr><tr><td>Paraformaldehído, grado EM, purificado, solución acuosa al 20%</td><td>Microscopía electrónica Ciencias 15713</td><td></td><td>20% Pararmadrenehído</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>70011044</td><td>10x PBS</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic P1000</td><td>Pipeta GILSON</td><td>F123602</td><td>A P1000</td></tr><tr><td>Tubos LoBind de proteínas, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>925000090</td><td>1,5 mL Tubo de baja unión a proteínas</td></tr><tr><td>QIAgen Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>A P1000 pipeta</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11495</td><td>&nbsp; Colorante intercalador específico de dsDNA</td></tr><tr><td>Kit de ligadura rápida</td><td>New England BioLabs</td><td>M2200L</td><td>T4 ADN ligasa (NEB)</td></tr><tr><td>RNaseOUT Inhibidor recombinante de la ribonucleasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Inhibidor de la ARNasa</td></tr><tr><td>S-4FB Reticulante (soluble en DMF)</td><td>Laboratorios de vectores</td><td>S-1004-105</td><td>Succinimidyl 4-formilbenzoato (S-4FB)</td></tr><tr><td>S-HyNic</td><td>Laboratorios de vectores</td><td>S-1002-105</td><td>Succinimidyl 6-hidrazinonicotinato acetona hidrazona (S-HyNic)</td></tr><tr><td>Acetato de sodio, 3 M, pH 5.2, grado de biología molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>567422-100ML</td><td>3M acetato de sodio (pH 5.2)</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio, 1M tampón soln., pH 8.5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60408</td><td>1M tampón de bicarbonato de sodio, pH 8.5</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico para biología molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3264-250G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico para biología molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3139-250G</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>SuperScript IV transcriptasa inversa</td><td>Thermo Fisher</td><td>18090050</td><td>Transcriptasa inversa</td></tr><tr><td>SYBR Gold Tinción de gel de ácido nucleico (concentrado 10,000x en DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11494</td><td>Un colorante intercalador para ADN</td></tr><tr><td>T4 Tampón de reacción de ADN ligasa</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td>10x Tampón de reacción de ADN ligasa T4</td></tr><tr><td>Paquete de tampón de reacción ThermoPol</td> New <td>England BioLabs</td><td>B9004S</td><td>10x tampón TPM-T (Tris-HCl/Cloruro de potasio/Sulfato de magnesio/Triton X-100)</td></tr><tr><td>Reactivo TRIzol LS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td>Extracción de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio</td></tr><tr><td>Kit de preparación de la biblioteca de ADN TruSeq Nano</td><td>Illumina</td><td></td><td>20015965 Un kit de preparación de la biblioteca de ADN (consulte también las instrucciones del fabricante)</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, consulte la Tabla 3</td><td>Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, consulte la Tabla 3</td><td>Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos</td></tr><tr><td>Oligo de ADN Ultramer, Anti-H3K27me3_Ab#003 Tecnologías de</td><td>ADN Integradas</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos</td></tr><tr><td>Oligonucleótidos de ADN ultramero, control IgG_Ab#001</td><td>Tecnologías integradas de ADN</td><td>N/A, ver Tabla 3</td><td>Una sonda de ADN modificada con aminas para el control IgG</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td>0,5M EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>Agua destilada UltraPure DNasa/sin RNasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>Agua ultrapura</td></tr><tr><td>Zeba Splin Columnas de desalinización, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>89882</td><td>Columna de desalinización</td></tr></tbody></table>

célula única reutilizable para análisis epigenómicos iterativos

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

Los análisis actuales del epigenoma unicelular están diseñados para un solo uso. La célula se descarta después de un solo uso, evitando el análisis de múltiples marcas epigenéticas en una sola célula y requiriendo datos de otras células para distinguir la señal del ruido de fondo experimental en una sola célula. Este artículo describe un método para reutilizar la misma célula individual para análisis epigenómicos iterativos. 
En este método experimental, las proteínas celulares se anclan primero a un polímero de poliacrilamida en lugar de entrecruzarlas a proteínas y ADN, aliviando el sesgo estructural. Este paso crítico permite repetir experimentos con la misma célula. A continuación, un cebador aleatorio con una secuencia de andamio para la ligadura de proximidad se recoce al ADN genómico, y la secuencia genómica se agrega al cebador por extensión utilizando una ADN polimerasa. Posteriormente, un anticuerpo contra un marcador epigenético y control IgG, cada uno marcado con diferentes sondas de ADN, se unen a los respectivos objetivos en la misma célula individual. 
La ligadura de proximidad se induce entre el cebador aleatorio y el anticuerpo mediante la adición de un ADN conector con secuencias complementarias a la secuencia de andamio del cebador aleatorio y la sonda de anticuerpo-ADN. Este enfoque integra información de anticuerpos y secuencias genómicas cercanas en un solo producto de ADN de ligadura de proximidad. Al permitir experimentos repetidos con la misma célula única, este método permite un aumento en la densidad de datos de una célula rara y un análisis estadístico utilizando solo datos de IgG y anticuerpos de la misma célula. Las células individuales reutilizables preparadas por este método pueden almacenarse durante al menos unos meses y reutilizarse más tarde para ampliar la caracterización epigenética y aumentar la densidad de datos. Este método proporciona flexibilidad a los investigadores y sus proyectos.

Las celdas individuales K562 se generaron utilizando el protocolo descrito en el paso 8 (consulte la figura 5). Las células individuales se incrustaron en la capa externa de la perla de poliacrilamida. El ADN celular se tiñó y visualizó utilizando un tinte intercalador para la tinción del ADN.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63456/63456fig05.jpg"> Figura 5: Células...

El presente protocolo describe un método de una sola célula para análisis epigenómicos iterativos utilizando una sola célula reutilizable. La célula única reutilizable permite el análisis de múltiples marcas epigenéticas en la misma célula única y la validación estadística de los resultados.

Célula única reutilizable para análisis epigenómicos iterativos

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

Este método experimental permite el almacenamiento a largo plazo de las células individuales reutilizables para pruebas epigenómicas. También permite el análisis de muchas marcas epigenéticas y factores de transcripción en la misma célula. En los métodos actuales para el análisis del epigenoma de una sola célula, las mismas células individuales no se pueden volver a analizar.Sin embargo, con células individuales reutilizables, las mismas células individuales se pueden volver a analizar muchas veces. Esta técnica es útil para el diagnóstico y diseño de la terapia epigenética, particularmente cuando las células del paciente son limitadas en número. Este método es más adecuado para el estudio del epigenoma, la regulación de la expresión génica y otros sistemas, siempre que se disponga de anticuerpos específicos para marcas epigenéticas.Cuando pruebe esta técnica por primera vez, le recomendamos que practique en muestras que no sean demasiado preciosas y valide el experimento utilizando secuenciación superficial como MiSeq o iSeq 100. Para comenzar, en una campana de flujo laminar limpia, mezcle un mililitro de suspensión celular y 199 mililitros de un PBS EDTA milimolar que contenga un colorante intercalador para el ADN. Después de mezclar, transfiera 200 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de la placa de fondo plano de 96 pocillos.Coloque la cubierta en la placa de 96 pocillos y escanee la placa con un microscopio de barrido. A continuación, incline la placa y espere unos minutos hasta que la celda individual se haya hundido en el borde inferior del pozo. A continuación, coloque la punta de la pipeta en la esquina inferior y transfiera la célula individual y el tampón a un tubo de PCR.Verifique el pozo con un microscopio de fluorescencia para confirmar la transferencia. Si una sola célula todavía está en el pozo, agregue 200 microlitros por pocillo de un PBS EDTA milimolar que contenga un colorante intercalador para el ADN y repita la transferencia. Después de la transferencia, coloque una cubierta en la placa de PCR de 96 pocillos y centrifugue la placa con un rotor de giro sin interrupción.Después de la centrifugación, coloque la placa en la cubierta de un robot automático de manejo de líquidos. A continuación, arrastre y suelte el código suplementario uno a la ventana de software del robot de manejo de líquidos y ejecute el programa para eliminar 195 microlitros del sobrenadante con una velocidad de pipeteo muy lenta. Agregue 50 microlitros de 4% TEMED o aceite mineral e incube la placa durante la noche a temperatura ambiente.Al día siguiente, retire el aceite mineral pipeteando y lave las células cinco veces con 200 microlitros de tampón negativo de magnesio TP. Después del último lavado, retire el sobrenadante, agregue 15 microlitros de tampón recocido e incube en hielo durante una hora. Después de la incubación, coloque los tubos de PCR en un termociclador y caliente a 94 grados centígrados durante tres minutos.Luego transfiera los tubos a un bloque de metal enfriado por hielo e incube durante dos minutos. A continuación, agregue cuatro microlitros de sulfato de magnesio-cloruro de sodio, mezcla de DNTP y mezcle por vórtice a una velocidad máxima. Luego agregue un microlitro de fragmento grande de polimerasa BST, mezcle por vórtice e incube durante cuatro horas en un agitador.Después de la incubación, coloque el tubo de PCR en un termociclador y ejecute un programa de cuatro horas o durante la noche como se describe en el texto. Para la unión de anticuerpos, agregue 1.625 microlitros de solución BSA de cloruro de sodio EDTA al tubo. Mezclar por vórtice a baja velocidad e incubar el tubo en hielo durante una hora.Luego agregue 0.1 microgramos por mililitro de anticuerpo y controle IgG conjugado con la sonda de anticuerpos. Después de agregar los anticuerpos, incubar los tubos en hielo con una agitación suave. Al día siguiente, lave las células dos veces con 200 microlitros de tampón TPM-T en hielo.Luego retire el sobrenadante y lávese una vez con tampón de ADN ligasa T4. A continuación, agregue 19 microlitros de solución adaptadora de ligadura e incube durante una hora a 25 grados centígrados. Luego, agregue un microlitro de ADN ligasa T4 y mezcle el tubo mediante vórtice a velocidad media.Coloque el tubo en un termociclador y ejecute el programa de ligadura de proximidad. Después de la carrera, lave las células dos veces con 200 microlitros de tampón positivo con EDTA negativo para magnesio BST y almacene las células durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave las células dos veces con 200 microlitros de tampón negativo con EDTA negativo de magnesio BST y agregue 20 microlitros de una mezcla que contenga BST, DNTP y sulfato de magnesio.Luego mezclar con un mezclador de vórtice e incubar el tubo durante cuatro horas en un agitador orbital. Después de la incubación, coloque el tubo en un termociclador y ejecute el programa de extensión completo como se describe en el texto manuscrito. A continuación, para la amplificación de desplazamiento múltiple, agregue 0.4 microlitros de 100 micromolares segundos cebadores aleatorios y mezcle por vórtice.Luego, incubar el tubo durante dos horas en un agitador orbital antes de colocar el tubo en un termociclador para calentar a 94 grados centígrados. Después de tres minutos, coloque los tubos en un bloque de metal enfriado con hielo y agregue un microlitro de ADN polimerasa BST. Vórtice los tubos a baja velocidad.Luego coloque los tubos en un termociclador para ejecutar el programa de amplificación de desplazamiento múltiple. Después del programa, transfiera aproximadamente 20 microlitros de sobrenadante a un tubo de PCR y guárdelo a menos 80 grados centígrados. A continuación, agregue 20 microlitros de tampón TE 0.05% TWEEN 20 y 0.1X a un tubo de PCR que contenga la célula individual reutilizable e incube el tubo durante la noche a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, recoge el sobrenadante y combínalo con el sobrenadante recogido previamente. Luego, remoje la célula única reutilizable y el tampón TBS que contiene 50% de glicerol, cinco EDTA milimolares, 0.5% BSA y 0.05% TWEEN 20, luego incubarlo durante 30 minutos en un agitador orbital. Después de la incubación, almacene la celda individual reutilizable a menos 20 grados centígrados hasta que se vuelva a usar.Finalmente, agregue 40 microlitros de mezcla maestra negativa Exo y coloque el tubo en un termociclador para ejecutar el programa como se describe en el texto manuscrito. Las celdas individuales reutilizables K562 se generaron utilizando este protocolo. Las células individuales se incrustaron en la capa externa de la perla de poliacrilamida y se visualizaron utilizando un tinte intercalador para la tinción de ADN.Los productos de ADN antes y después de la digestión BciVI se muestran aquí. La digestión de la enzima de restricción generó los fragmentos esperados de 19 a 20, 31 a 32, 49 y más de 49 pares de bases. Además, la biblioteca de ADN construida se analizó mediante electroforesis capilar para los productos deseados.Los resultados de la secuenciación indicaron que las lecturas mapeadas únicas de lisina acetilada 27 anti-histona H3 y lisina 27 trimetilada anti-histona H3 fueron significativamente más numerosas que las de la IgG de control. Las señales de secuenciación REpi se evaluaron comparando los datos de secuenciación REpi con los datos de secuenciación ChIP masivos. En promedio, aproximadamente el 91% de las señales de lisina 27 acetilada de histona H3 de la secuenciación REpi se superpusieron con los picos de lisina acetilada 27 de la histona H-3 en la secuenciación masiva de ChIP.La precisión de la secuenciación REpi para la marca de histona inactiva, histona H3 trimetilada lisina 27 fue del 52%La sensibilidad de la secuenciación REpi se analizó para medir cuántos picos de secuenciación ChIP masiva se detectaron mediante lecturas reproducidas de secuenciación REpi. La sensibilidad de la secuenciación de REpi fue del 55,30% en la histona H3 acetilada lisina 27 y del 50,94% en la histona H3 trimetilada lisina 27. Asegúrese de utilizar reactivos sin DNS.Además, todas las operaciones que involucran los cables del tubo de apertura o los cables del reactivo deben realizarse en una campana limpia. Los productos de ADN de este procedimiento se secuencian y luego se mapean al genoma para revelar qué modificaciones de histonas están presentes, en qué regiones del genoma en células individuales. Esta tecnología hizo posible analizar múltiples marcas epigenéticas en la misma célula individual y allanó el camino para el análisis multiómico en cualquier célula individual.

reusable-single-cell-for-iterative-epigenomic-analyses

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

En este artículo se describe un método simple para la recolección de las células individuales de rata cultivos primarios de neuronas y posterior análisis de transcriptoma utilizando la amplificación ARNA. Este enfoque es generalizable a cualquier tipo de célula.

El análisis del transcriptoma de células individuales

Los métodos para mapear las interacciones proteína-ADN in vivo se están volviendo cruciales para todos los aspectos de la investigación genómica, pero son laboriosos, costosos y requieren mucho tiempo. Aquí se presenta un sistema robótico de manejo de líquidos disponible comercialmente que automatiza la inmunoprecipitación de cromatina para mapear las interacciones proteína-ADN in vivo con cantidades limitadas de células.

La automatización de experimentos-chip siguientes para generar perfiles epigenéticos en 10.000 células HeLa

Sola célula secuencia revela heterogeneidad genotípica en los sistemas biológicos, pero las tecnologías actuales carecen de la capacidad necesaria para el perfilado profundo de la función y composición de la comunidad. Aquí, describimos un flujo de trabajo de microfluidos para la secuencia &gt; 50.000 genomas unicelulares de diversas poblaciones de la célula.

Una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular

A granel gene expresión medidas nube célula individual diferencias en poblaciones celulares heterogéneas. Aquí, describimos un protocolo para análisis de expresión génica e índice cómo sola célula clasificación de Florescence activa célula clasificación (FACS) puede combinarse para delinear la heterogeneidad y immunophenotypically caracterizar poblaciones celulares molecularmente distintos.

Una combinatoria unicelular enfoque para caracterizar Molecular y heterogeneidad de Immunophenotypic de madre humana y de las poblaciones progenitoras

Este protocolo describe el proceso general y control de calidad controles necesarios para la preparación de células sanas de mamíferas adultos solo para preparaciones de RNA-Seq de celulares solo basada en gota, alto rendimiento. Secuenciación parámetros, lea alineación y análisis Bioinformático unicelular aguas abajo también se proporcionan.

Transcriptómica de célula basada en código de barras gotita de tejidos mamíferos adultos

Aquí presentamos un método de secuenciación de ARNm de una sola célula multiplexado para perfilar la expresión génica en tejidos embrionarios de ratón. El método de secuenciación de mRNA de una sola célula basada en gotas (scRNA-Seq) en combinación con estrategias de multiplexación puede perfilar celdas individuales de varias muestras simultáneamente, lo que reduce significativamente los costos de reactivos y minimiza los efectos experimentales por lotes.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

CUT&amp;RUN y sus variantes se pueden utilizar para determinar la ocupación de proteínas en la cromatina. Este protocolo describe cómo determinar la localización de proteínas en la cromatina utilizando uliCUT&amp;RUN unicelular.

Localización de factor de una sola célula en cromatina utilizando escisión de entrada ultra baja bajo objetivos y liberación con nucleasa

En este protocolo, el método de purificación de afinidad ribosómica por traducción (TRAP) y el método de aislamiento de núcleos marcados en tipos celulares específicos (INTACT) se optimizaron para la interrogación pareada del transcriptoma ovárico específico de células y el epigenoma utilizando el modelo de ratón NuTRAP cruzado a una línea de ratón Cyp17a1-Cre.

Interrogación pareada específica de células del epigenoma ovárico y transcriptoma de ratón

El protocolo combina la tecnología de organoides intestinales humanos con el análisis transcriptómico de células individuales para proporcionar información significativa sobre la biología intestinal previamente inexplorada.

Uso de organoides intestinales humanos para comprender el epitelio del intestino delgado a nivel transcripcional de una sola célula

Este estudio presenta un protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificación de barras espacial directa de una sección tisular con análisis multioma de célula única. Este enfoque permite simultáneamente un perfilado espacial de expresión génica en células individuales y la modificación de la histona H3K27ac, ofreciendo conocimientos mecanicistas sobre la regulación génica en el contexto de la microanatomía tisular.

Perfilado multiómico integrado de célula única y resuelto espacialmente del transcriptoma y objetivos epigenómicos en secciones de tejido congelado

Aprende el método de célula única reutilizable para análisis epigenómicos iterativos que permite estudiar múltiples marcas epigenéticas en la misma célula. Esta técnica facilita la validación estadística y el diseño de terapias epigenéticas cuando las células de pacientes son limitadas.

Célula única reutilizable para análisis epigenómicos iterativos

Explorar más videos