Trasplante de microglía derivada de células madre pluripotentes inducidas por humanos en ratones cerebros inmunocompetentes a través de una ruta transnasal no invasiva
31 de mayo de 2022
El protocolo presentado aquí permite el trasplante de microglía humana derivada de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG) en el cerebro a través de una ruta transnasal en ratones inmunocompetentes. Se muestra el método para la preparación y trasplante transnasal de células y la administración de mezcla de citoquinas para el mantenimiento de iPSMG.
Este protocolo permite un trasplante no invasivo de iPSMG en cerebro de ratón inmunocompetente mediante la combinación de encendido / apagado farmacológico de un antagonista del receptor CSF1 PLX5622 con trasplante transnasal. La principal ventaja de esta técnica es que iPSMG se puede trasplantar sin inducir daño cerebral incluso en ratones inmunocompetentes. El trasplante microglial puede servir como una terapia potencial para intercambiar microglía disfuncional con microglías funcionales en diversas enfermedades neurodegenerativas en el futuro.
Demostrando el procedimiento estará Bijay Parajuli, un investigador de mi laboratorio. Comience por descongelar rápidamente las células de microglía humana derivadas de células madre pluripotentes inducidas congeladas en un baño de agua de 37 grados Celsius. Gire las muestras hasta que todo el hielo visible se haya derretido.
Agregue el iPSMG descongelado a los medios de cultivo, calentado a 37 grados centígrados. Agregue un mililitro de células a 10 mililitros de medios de cultivo. Centrifugar las células a 300 veces g durante cinco minutos para obtener un pellet celular.
Retire el sobrenadante sin perturbar la bolita celular. Añadir el medio de trasplante para obtener una concentración celular de 10 a la quinta célula por microlitro. Coloque el iPSMG en hielo e inmediatamente proceda al trasplante.
Para preparar a los ratones para el trasplante transnasal, alimente a los ratones machos con una dieta que contenga PLX durante siete días. Al final del séptimo día, suspenda la dieta PLX y alimente a los ratones con una dieta normal. Una hora antes del trasplante transnasal de iPSMG, administre 2,5 microlitros de hialuronidasa en PBS a cada fosa nasal dos veces utilizando una punta de pipeta de 10 microlitros para aumentar la permeabilidad a la mucosa nasal.
Coloque a los ratones en posición supina después de la aplicación de hialuronidasa. Administrar 2,5 microlitros de hialuronidasa diez minutos antes del trasplante transnasal de iPSMG. Aplique 2,5 microlitros de suspensión celular en una fosa nasal del ratón con una punta de pipeta de 10 microlitros.
Coloque el ratón en posición supina durante cinco minutos antes de la administración de suspensión celular a la otra fosa nasal. Administrar la suspensión celular cuatro veces, aplicando un volumen total de 20 microlitros por animal. 48 horas después del cese de la alimentación con PLX, repetir la administración de hialuronidasa y suspensión celular en los mismos ratones.
Para la administración de citoquinas, aplique 2,5 microlitros del medio de trasplante en una fosa nasal del ratón utilizando una punta de pipeta de 10 microlitros. Después de dos meses de trasplante transnasal, el número de células trasplantadas se puede determinar contando las células que son positivas tanto para marcadores específicos humanos como panmicrogliales. Las microglías endógenas de ratón son positivas solo para el marcador pan-microglial.
En ratones de control, solo se detectaron microglia de ratón tanto en la corteza como en el hipocampo. En la corteza de los ratones trasplantados con iPSMG, solo se detectaron microglías de ratón, mientras que en el hipocampo se detectaron iPSMG. Al intentar este protocolo, la eliminación completa del sobrenadante es esencial para evitar la dilución de las citoquinas.
Es crucial aplicar citoquinas cada 12 horas para la viabilidad de las células trasplantadas. Se requiere el agotamiento de la microglía endógena del ratón para el trasplante de iPSMG. Este procedimiento permite el trasplante de iPSMG en un cerebro de ratón normal o enfermo.
Por lo tanto, se pueden determinar las características de iPSMG, así como la respuesta a la enfermedad. Esta técnica es adecuada para determinar la característica in vivo de iPSMG en el cerebro del ratón. Por lo tanto, el trasplante de iPSMG en ratones modelo de enfermedad nos ayudará a comprender la respuesta y puede allanar el camino para una nueva diana terapéutica.
Resumen
Este estudio presenta un método no invasivo para el trasplante de microglía humana derivada de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG) en el cerebro de ratones inmunocompetentes mediante una vía transnasal. El protocolo aprovecha la administración de citoquinas y la eliminación de la microglía endógena para permitir la integración eficaz de las iPSMG, lo que podría allanar el camino hacia enfoques terapéuticos en enfermedades neurodegenerativas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Investigación con Células Madre
- Biología de la Microglía
Antecedentes
- Las células madre pluripotentes inducidas pueden diferenciarse en microglía funcional.
- La disfunción microglial está implicada en diversas enfermedades neurodegenerativas.
- La administración transnasal representa un enfoque novedoso para el trasplante celular.
- La administración de citocinas es crucial para la viabilidad celular tras el trasplante.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para el trasplante no invasivo de microglía.
- Evaluar la viabilidad de la administración transnasal para mantener la función cerebral normal.
- Evaluar el potencial de las iPSMG para reemplazar la microglía disfuncional.
Métodos Utilizados
- La plataforma principal implica el trasplante transnasal de iPSMG en ratones inmunocompetentes.
- Los ratones macho fueron pretratados con el antagonista del receptor de CSF1, PLX5622, y una solución de hialuronidasa para mejorar la permeabilidad nasal.
- Las suspensiones celulares se administraron en múltiples dosis durante periodos específicos para asegurar una integración adecuada.
- El monitoreo post-trasplante incluyó la evaluación de la presencia y viabilidad de las células trasplantadas.
Resultados principales
- Los iPSMG trasplantados se integraron con éxito en el hipocampo del ratón sin dañar las microglías endógenas.
- La administración de citoquinas cada 12 horas fue fundamental para mantener la viabilidad celular tras el trasplante.
- Este método permite examinar las respuestas de los iPSMG tanto en modelos normales como en modelos enfermos.
Conclusiones
- Este protocolo facilita el estudio de iPSMG in vivo, lo cual podría orientar futuras terapias génicas para enfermedades neurodegenerativas.
- Comprender el comportamiento de las microglías trasplantadas puede ayudar a delimitar su papel en la salud cerebral.
- Este enfoque podría abrir vías hacia nuevos objetivos terapéuticos en el tratamiento de patologías relacionadas con la microglía.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El trasplante no invasivo de microglía derivada de iPSC humanas en cerebros de ratones inmunocompetentes permite el estudio directo in vivo de la función microglial humana y la respuesta ante enfermedades. Este enfoque aborda las brechas traslacionales entre la microglía de roedores y humanos, apoyando modelos preclínicos más predictivos para la investigación de enfermedades neurodegenerativas. El protocolo mejora la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las etapas iniciales del descubrimiento y en los puntos de inflexión preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación in vivo de la biología de las microglías humanas dentro de un entorno cerebral de mamífero.
- Apoya la desestimación mecanicista al distinguir las respuestas microgliales específicas del ser humano de los modelos murinos.
- Facilita la validación funcional de dianas para las vías de neuroinflamación y neurodegeneración.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona un sistema validado para evaluar la integración y viabilidad de microglía humana in vivo.
- Permite la cuantificación reproducible de microglía trasplantada frente a microglía endógena mediante marcadores específicos.
- Facilita el cribado posterior de compuestos dirigidos a la función de la microglía humana en un contexto fisiológico.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea modelos preclínicos con la relevancia de la enfermedad humana mediante la incorporación de microglía humana en cerebros de ratón.
- Permite la evaluación de la respuesta de la microglía humana tanto en ratones normales como en modelos de enfermedad.
- Mejora la confianza predictiva para el descubrimiento de biomarcadores traslacionales y la prueba de hipótesis terapéuticas.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este protocolo conecta el descubrimiento inicial y la investigación preclínica al permitir estudios funcionales de microglía humana in vivo, lo que favorece la identificación de compuestos prometedores y la continuidad traslacional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los roles de las microglías humanas en la fisiología y la patología cerebral.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas de la integración celular y la viabilidad tras el trasplante.
- Análisis: Permite la discriminación basada en marcadores entre microglías humanas y murinas para un análisis de datos robusto.
- Investigación Traducional: Facilita la modelización relevante para enfermedades mediante el trasplante de iPSMG en ratones modelo de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar la función de las microglías humanas en múltiples contextos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad específica de la especie en la investigación de la neuroinflamación.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de administración y cuantificación celular no invasivos para lograr reproducibilidad entre estudios.
- Valor estratégico: Permite tomar mejores decisiones de avance o interrupción de terapias dirigidas a las microglías al proporcionar datos relevantes para humanos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de programas para enfermedades neurodegenerativas al mejorar la fidelidad del modelo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de iPSC, diferenciación microglial y técnicas de trasplante in vivo.
- Necesita acceso a agentes farmacológicos para la eliminación de microglía endógena y soporte con citoquinas.
- Exige protocolos estandarizados para la preparación celular, el trasplante y el análisis post-trasplante.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir la optimización de los parámetros de administración y eliminación.
- La administración continua de citoquinas es fundamental para la viabilidad de las células trasplantadas, tal como respalda el protocolo.
