Name: Un modelo murino de disfunción de la mano relacionada con el acceso a la hemodiálisis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a crear una fístula arteriovenosa ilíaca común en ratones para estudiar la isquemia de mano relacionada con acceso a hemodiálisis. Este modelo permite examinar la interacción entre uremia y alteraciones neuromusculares.

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Agradecemos sinceramente al Dr. Guanyi Lu de la División de Cirugía Vascular y Terapia Endovascular de la Universidad de Florida por el apoyo técnico en el desarrollo del modelo de FAV ilíaca, así como la capacitación quirúrgica, y a Ravi Kumar del Departamento de Fisiología Aplicada y Kinesiología de la Universidad de Florida por el apoyo técnico para obtener las imágenes microquirúrgicas en vivo.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud y Corazón Nacional, Pulmón y Sangre, números de instituto R01-HL148697 (a S.T.S.), así como el número de subvención de la Asociación Americana del Corazón POST903198 (a K.K.).

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Florida y el Centro Médico de Asuntos de Veteranos Malcom Randall.
NOTA: Los ratones machos C57BL / 6J adultos jóvenes (8-10 semanas de edad) se compraron en el Laboratorio Jackson y se alojaron en una instalación de animales controlada por luz (12 h luz: 12 h ciclo oscuro), temperatura (22 ° C ± 1 ° C) y humedad (50% ± 10%). Se permitió que cinco ratones habitaran por jaula (W: 18 cm x L: 29 cm x H: 12.5 cm) con materiales de anidación, alimentos y agua disponibles ad libitum. Después de 7 días de aclimatación al hábitat con comida estándar, los ratones fueron cambiados a una dieta de comida a base de caseína durante 7 días como una fase de transición de la dieta. Posteriormente, los ratones fueron alimentados con la comida a base de caseína con suplementación con 0,2%-0,15% de adenina durante 2-3 semanas para inducir disfunción renal (ERC) antes de la cirugía de FAV como se describió anteriormente22,23,24. Los ratones de control recibieron una dieta de comida a base de caseína sin suplementos de adenina (control). Las dietas control y ERC se mantuvieron durante todo el período de recuperación postoperatoria (POD).
1. Mediciones preoperatorias
<ol><li>Evaluar las mediciones de resultados basales/preoperatorios, los diámetros de los vasos aortoilíacos y los parámetros de flujo hemodinámico mediante imágenes de ultrasonido dúplex y perfusión de las extremidades posteriores mediante Doppler láser como se describió anteriormente25.</li>
	<li>Determinar la fuerza de agarre unilateral de las extremidades posteriores y la evaluación de la marcha en cinta rodante para establecer la función basal de las extremidades posteriores como se describió anteriormente25,26.</li>
	<li>Evaluar la función renal midiendo la tasa de filtración glomerular (TFG) a través del aclaramiento de inulina FITC y/o el nivel de nitrógeno ureico en sangre sérico (BUN) como se describió anteriormente22,24,27.</li>
</ol>2. Preparación quirúrgica
<ol><li>Prepare las siguientes herramientas y suministros quirúrgicos (Tabla de materiales): un esterilizador de perlas calientes, lubricante para ojos, un recortador de plumas, preparaciones de alcohol, toallitas de clorhexidina, pinzas Graefe extrafinas, solución salina esterilizada al 0,9%, jeringas de aguja de 29 G y 31 G, 2 x 2 esponjas no tejidas, medianas redondas de un solo extremo (SC-9) y pequeñas de doble extremo duras, afiladas y puntiagudas (SC-4), cauterización a baja temperatura, pinzas Dumont rectas, pinzas Dumont en ángulo de 45°, tijeras de resorte Vannas rectas, tijeras de resorte Vannas curvadas, soportes de agujas de mango redondo, múltiples tamaños de suturas (seda 4-0, PGA 5-0, seda 6-0 y suturas de nylon 10-0), heparina, esponja de gelatina absorbible, un soporte de aguja recto y buprenorfina. NOTA: Las bandas elásticas de fijación de extremidades y los retractores para el abdomen y las piernas fueron hechos a mano.</li>
	<li>Esterilizar las preparaciones quirúrgicas usando autoclave con esterilización por vapor a 120-125 °C durante 30 minutos seguido de secado durante 30 minutos antes de la cirugía. Utilice una limpieza con etanol al 70% seguida de esterilización de perlas calientes (240-270 °C durante 3 min) entre cada cirugía animal.</li>
	<li>Prepare solución salina normal esterilizada al 0,9%, solución salina heparinizada (100 UI/ml) y buprenorfina (0,01 mg/ml) esterilizada con jeringas de aguja de 29-31 G.</li>
</ol>3. Anestesia y posicionamiento
<ol><li>Iniciar la anestesia de ratón en la cámara de inducción (0,8 mL/min, 2,5% de isoflurano). Una vez que el ratón esté adecuadamente anestesiado, coloque el ratón en posición supina en la estación quirúrgica cubierta por una cortina estéril. Reduzca la concentración de isoflurano a ~ 1.2% durante los pasos de afeitado y posicionamiento.</li>
	<li>Aplique el lubricante ocular para proteger los ojos de la sequedad durante la cirugía.</li>
	<li>Usando un recortador de plumas, afeite el vello abdominal para la operación y el vello de las piernas para las mediciones de perfusión postoperatorias. Limpie el cabello del campo quirúrgico.</li>
	<li>Fije las extremidades superiores e inferiores con bandas elásticas y tachuelas, verifique la profundidad de la anestesia monitoreando el reflejo de pellizco del dedo del pie y ajuste la anestesia según sea necesario. Realice la evaluación del patrón respiratorio cada 3-5 minutos durante todo el procedimiento quirúrgico para calibrar el nivel de anestesia.</li>
</ol>4. Exploración del área objetivo quirúrgica
<ol><li>Limpie el área de la piel afeitada varias veces, alternando entre la preparación de alcohol y las toallitas de clorhexidina en un patrón circular para desinfectar el campo quirúrgico.</li>
	<li>Hacer una laparotomía de la línea media desde el borde inferior del margen esternal hasta la sínfisis del pubis. Diseccionar la almohadilla de grasa del pubis para obtener un campo operativo más amplio.</li>
	<li>Abra la celiotomía para acceder al contenido peritoneal con retractores y eviscere los intestinos delgado y grueso utilizando hisopos de algodón redondos medianos de un solo extremo. Cubra los intestinos con una esponja no tejida empapada en solución salina.</li>
	<li>Una vez que se obtenga una exposición adecuada de la vasculatura retroperitoneal, cubra el intestino, los riñones y los uréteres restantes con pequeñas esponjas no tejidas empapadas en solución salina. Evacúe una vejiga distendida apretando suavemente la cúpula de la vejiga con hisopos de algodón redondos medianos de un solo extremo según sea necesario.</li>
	<li>Diseccionar cuidadosamente la fascia perivascular y el tejido adiposo desde aproximadamente 1 cm proximal hasta la bifurcación aórtica que se extiende hasta el nivel de la bifurcación ilíaca izquierda utilizando pinzas de Dumont rectas y pequeños hisopos de algodón duros, afilados y puntiagudos de doble extremo. NOTA: La arteria ilíaca izquierda y la vena se mantienen adheridas entre sí mientras se aíslan las estructuras arteriovenosas en masa. Este paso proporcionará suficiente movilización de buques para facilitar la creación de AVF.</li>
	<li>Si se encuentran pequeñas ramas venosas que se originan o convergen con la vena ilíaca común izquierda, ligarlas usando cauterización a baja temperatura con o sin sutura de seda 6-0 según sea necesario.</li>
	<li>Pase la punta de los fórceps en ángulo debajo del haz vascular ilíaco común izquierdo y extienda suavemente varias veces para movilizar los vasos de la musculatura retroperitoneal subyacente (Figura 1A).</li>
</ol>5. Creación de una fístula arteriovenosa ilíaca común anastomosis
<ol><li>Coloque dos suturas de seda 4-0 alrededor del haz arteriovenoso ilíaco común izquierdo aislado y úselas como ligaduras (por ejemplo, pinzas cruzadas) para el haz vascular. Crea un solo nudo con cada corbata de seda 4-0 y aplícalos secuencialmente de proximal a distal.</li>
	<li>Asegúrese de que las abrazaderas cruzadas de lazo de seda estén lo suficientemente separadas para aislar ~ 2 mm de longitud del vaso, y la aplicación secuencial de las ligaduras de sutura precipitará la congestión de la vena ilíaca izquierda.</li>
	<li>Usando las cuerdas de sutura de seda 4-0 como asas, gire el haz vascular arteriovenoso ilíaco izquierdo en el sentido de las agujas del reloj y ajuste la posición para ubicar temporalmente la vena anterior a la arteria (Figura 1B).</li>
	<li>Haga una venotomía longitudinal (~ 1 mm) con tijeras de resorte Vannas rectas y elimine suavemente la sangre residual de la luz venosa con solución salina al 0.9% (Figura 1C). Tenga cuidado durante este paso, ya que un lavado salino a alta presión puede causar interrupción venosa. NOTA: La región de color rojo que permanece en la arteria ilíaca después del lavado venoso proporciona una ventana visual para el siguiente paso.</li>
	<li>Coloque una sutura imbricada de nylon 10-0 a través de la pared posterior de la vena. NOTA: Esta porción de la vena ilíaca debe estar en aposición inmediata a la pared anterior de la arteria ilíaca, y las paredes son naturalmente adherentes. La sutura debe atravesar ambas paredes y atar la sutura con un solo nudo (Figura 1D). Tenga en cuenta que una pequeña cantidad de sangrado, que se origina en la sangre estancada en la arteria ilíaca, aparecerá una vez que la aguja pase a través de ambas paredes. Si el sangrado intraluminal continúa durante este paso, las pinzas cruzadas de sutura de seda pueden estar demasiado flojas y deben apretarse aún más.</li>
	<li>Agarre los extremos de la sutura imbricada y colóquelos bajo una tensión suave para desplazar la pared anterior de la pared posterior de la arteria ilíaca. Haga una incisión elíptica de ~ 1.0 mm x 0.3 mm con tijeras curvas de resorte Vannas, eliminando las paredes adherentes tanto de la arteria ilíaca como de la vena. NOTA: La fístula arteriovenosa se crea una vez que se establece este canal común. Es posible lesionar las paredes laterales de la vena durante este paso, ya que la incisión de la vena ilíaca posterior / arteria ilíaca anterior se realiza a través de la exposición a la venotomía. Se debe tener precaución para evitar esta complicación, ya que esto puede reducir considerablemente el diámetro de la fístula y conducir al desarrollo de trombos.</li>
	<li>Eliminar suavemente la sangre residual de la luz arterial expuesta con solución salina al 0,9% y solución salina heparinizada (100 UI/ml)28 (Figura 1E).</li>
	<li>Después de la creación de la FAV, reparar la venotomía inicial de la pared anterior utilizando dos o tres suturas de nylon 10-0 de manera interrumpida (Figura 1F).</li>
	<li>Restaure el haz vascular a su orientación anatómica original y coloque un pequeño trozo de esponja de gelatina absorbible empapada en solución salina adyacente a la venotomía reparada para facilitar la hemostasia.</li>
	<li>Afloje las ligaduras de pinza cruzada de un solo nudo 4-0 secuencialmente de distal a proximal. Controle de cerca el sitio de la venotomía para detectar sangrado excesivo mientras afloja cada sutura.</li>
	<li>Si la reparación no es adecuadamente hemostática, vuelva a aplicar las pinzas cruzadas y coloque otra sutura de nylon 10-0 en el sitio del sangrado. Si la hemostasia está asegurada, retire las suturas y luego la esponja de gelatina absorbible.</li>
	<li>Frote suavemente el haz vascular con pequeños hisopos de algodón duros, afilados y puntiagudos de doble extremo, que facilitan aún más la restauración del flujo sanguíneo. Confirme el éxito técnico de la operación mediante la visualización de sangre oxigenada pulsátil de color rojo brillante que ingresa a la vena ilíaca y se mezcla con sangre venosa oscura que regresa de la extremidad posterior.</li>
	<li>Inyectar solución salina heparinizada (0,2 UI/g)15 en la VCI para la anticoagulación sistémica a fin de mejorar los resultados de permeabilidad de la FAV. NOTA: Aunque este paso ocurre después de la reconstrucción vascular (a diferencia del análogo humano donde la heparinización ocurre antes del pinzamiento cruzado del vaso), se observó una reducción en el sangrado intraoperatorio y una mejor permeabilidad de la FAV cuando se realizó en esta etapa del procedimiento. La inyección en un sitio cubierto por fascia y / o grasa es preferible para prevenir el sangrado del sitio de punción.</li>
	<li>Vuelva a inspeccionar el sitio quirúrgico para detectar hemostasia después de la inyección de solución salina heparinizada. Si no hay problemas de sangrado, cierre la fascia de la línea media y luego la incisión de la piel con suturas absorbibles 5-0 PGA en forma de correr.</li>
	<li>Para operaciones simuladas, siga todos los pasos clave del procedimiento, excepto la formación de FAV. Aplique un solo nudo de la ligadura de seda 4-0 en el extremo proximal del haz arteriovenoso ilíaco izquierdo y haga coincidir los tiempos de pinza con las cirugías de FAV (por ejemplo, ~ 20 min, dependiendo de la competencia del microcirujano).</li>
</ol>6. Cuidados y medición postoperatoria
<ol><li>Después del cierre de la laparotomía, medir la perfusión sanguínea de los músculos tibiales anteriores bilaterales y las patas ventrales utilizando imágenes Doppler con láser. NOTA: Los déficits unilaterales de perfusión confirmarán la desviación de la fístula del flujo arterial ("robo").</li>
	<li>Administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea y devolver el ratón a una jaula de ratón precalentada con ropa de cama blanda altamente absorbible con nido.</li>
	<li>Permita que el ratón se recupere en la jaula del ratón precalentada hasta que la anestesia desaparezca, lo que será obvio cuando el ratón sea ambulatorio e interactivo (~ 2 h). Durante la recuperación, dale al ratón fácil acceso a una dieta hidratada y blanda.</li>
	<li>Administrar buprenorfina y/o hidratación salina subcutánea cada 12 h hasta 48 h y realizar un seguimiento diario durante 5 días postoperatorio. Eutanasia a los animales con una condición de deterioro o necrosis tisular excesiva, clasificada como una puntuación de isquemia modificada ≥229.</li>
	<li>Utilice evaluaciones seriadas de ultrasonido dúplex para evaluar la permeabilidad de la fístula después de la operación; los ratones con trombosis de fístula se excluyen de los análisis posteriores a menos que el propósito de los experimentos sea caracterizar el fracaso de la maduración de la FAV.</li>
	<li>Determinar otras mediciones de resultados postoperatorios como la hemodinámica local, la fuerza de agarre y el rendimiento de la marcha durante el período de recuperación. Recolectar fístulas y tejidos musculares para evaluar la histomorfología al final del experimento durante el sacrificio25,27.</li>
</ol>

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<li>Francis, B. N., Abassi, Z., Heyman, S., Winaver, J., Hoffman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+ET+%28A%29+and+ET+%28B%29+in+the+renal+tissue+of+rats+with+compensated+and+decompensated+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of ET (A) and ET (B) in the renal tissue of rats with compensated and decompensated heart failure.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 44, 362-365 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La prevalencia de pacientes en hemodiálisis con ARHD después de la creación de FAV ha continuado aumentando30,31. De hecho, las complicaciones sintomáticas no resueltas 4,32,33 como dolor, debilidad, parestesia y/o rango de movimiento reducido pueden afectar negativamente el bienestar del paciente 4,32,33,34,35,36 y amenaza...

El establecimiento y la preservación del acceso vascular funcional siguen siendo un objetivo primario importante para los pacientes con enfermedad renal terminal (ERT) que reciben terapia de reemplazo renal por hemodiálisis1. Los tratamientos repetidos de hemodiálisis son necesarios para eliminar los productos de desecho, normalizar los electrolitos y mantener el equilibrio de líquidos una vez que la función renal se vuelve inadecuada y, por lo tanto, son necesarios para la supervivencia a largo plazo2. Por lo tanto, el acceso vascular representa un "salvavidas" para los pacientes con ERT, y la colocación de fístula arteriovenosa autógena (FAV) sigue siendo una opción preferida de acceso a diálisis entre estacohorte 3. Sin embargo, aproximadamente el 30% -60% de los pacientes en hemodiálisis experimentan un espectro de discapacidades de la mano, clínicamente definidas como disfunción de la mano relacionada con el acceso (ARHD). Los síntomas de ARHD pueden variar desde debilidad y descoordinación hasta monoplejia y gangrena digital, que pueden ocurrir temprano después de la creación de AVF o desarrollarse gradualmente con la maduración de la fístula. Además, la ARHD complica el esquema de tratamiento de la ERT, que se asocia con mala calidad de vida, alto riesgo de enfermedad cardiovascular y aumento de la mortalidad 2,3,4.
Se han desarrollado varios modelos animales para estudiar la remodelación vascular inducida por alteraciones hemodinámicas tras la creación de FAV 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Los modelos animales grandes con FAV ilíaca o femoral 16,17,18,19,20 y los modelos de roedores que utilizan anastomosis de la vena yugular de la arteria carótida o la formación de fístula infrarrenal de la vena cava inferior de la aorta están bien establecidos para examinar los aspectos antes mencionados de la maduración y permeabilidad de la FAV 21 . Por ejemplo, la hipertensión venosa, el mayor diámetro luminal y el aumento del grosor de la pared venosa son signos de maduración exitosa de la FAV, mientras que la fibrosis sustancial de los medios y la hiperplasia de la íntima o el desarrollo de trombos sin cambios en el flujo a menudo caracterizan las fallas de la FAV 6,15. Sin embargo, los modelos animales grandes carecen de la flexibilidad experimental o las capacidades transgénicas de los modelos murinos, mientras que los modelos actuales de roedores no facilitan fácilmente la investigación de ARHD debido a la ubicación anatómica y / o la falta de patología asociada de las extremidades. De hecho, debido a la falta de un modelo animal preclínico establecido que recapitule el fenotipo clínico relevante, el progreso de la investigación para dilucidar los mecanismos patobiológicos y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas se ha mantenido estancado, a pesar de un aumento progresivo en el número de pacientes sintomáticos con ARHD. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio es introducir un modelo único de ratón de ARHD, proporcionando pasos de procedimiento de microcirugía AVF y caracterización de la fisiopatología relacionada con AVF.

<table><tbody><tr><td>0,15% Adenina dieta</td><td>ENVIGO</td><td>TD.130899</td><td>20% caseína, 0,15% adenina, 0,9% P</td></tr><tr><td>0,2% Adenina dieta</td><td>ENVIGO</td><td>TD.130900</td><td>20% caseína, 0,2% adenina, 0,9% P</td></tr><tr><td>10-0 Sutura de nailon</td><td>AD quirúrgica</td><td>XXS-N1005T4</td><td></td></tr><tr><td>jeringas de aguja de 29 G</td><td>Exel International</td><td>14-841-32</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de aguja de 31 G</td><td>Advocate</td><td>U-100 jeringa de insulina</td><td></td></tr><tr><td>4-0 sutura de seda</td><td>AD quirúrgico</td><td>S-S41813</td><td></td></tr><tr><td>pinza Dumont en ángulo de 45 grados</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>5-0 sutura PGA</td><td>AD quirúrgico</td><td>PSGU-518R13</td><td></td></tr><tr><td>6-0 sutura de seda</td><td>AD quirúrgico</td><td>S-S618R13</td><td></td></tr><tr><td>Esponja de gelatina absorbible</td><td>ETHICON</td><td>1975</td><td></td></tr><tr><td>Preparaciones con alcohol</td><td>Covidien</td><td>5110-cs4000</td><td>Alcohol isopropílico al 70%</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td>NA NA</td><td>0,01 g/mL</td></tr><tr><td>C57BL6/J</td><td>ratones Jaxon</td> Laboratorio <td></td><td></td></tr><tr><td>Dieta de caseína</td><td>ENVIGO</td><td>TD.130898</td><td>20% caseína, 0,9% P</td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón</td><td>CONSTIX</td><td>SC-9</td><td>Bastoncillos de algodón redondos medianos de un solo extremo</td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón</td><td>CONSTIX</td><td>SC-4</td><td>Pequeño bastoncillo de algodón duro, afilado y puntiagudo de doble punta</td></tr><tr><td>Curity esponjas no tejidas (2x2)</td><td>Covidien</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas curvadas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Ecografía Doppler</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de graefe extrafina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11150-10</td><td>2 pares</td></tr><tr><td>Eye lubricante</td><td>CLCMEDICA</td><td>Optixcare lubricante para ojos Heparina</td><td></td></tr><tr><td>(5000 U/mL)</td><td>Lista Nacional de Códigos de Medicamentos</td><td>63739-953-25</td><td>100 UI/mL</td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas calientes</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-50</td><td></td></tr><tr><td>Cauterización a baja temperatura</td><td>Bovie</td><td>AA04</td><td></td></tr><tr><td>Recortador de bolígrafos</td><td>Wahl</td><td>5640-600</td><td></td></tr><tr><td>Guantes</td> <td>quirúrgicos sin polvoAnsell</td><td>7824PF</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas con mango redondo</td><td>Fine Science Tools</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>Paño toalla estéril</td><td>Dynarex</td><td>DY440-MI</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina esterilizada al 0,9%</td> Lista Nacional de <td>Códigos de Medicamentos</td><td>46066-807-25</td><td></td></tr><tr><td>Pinza dumont recta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas recto</td><td>Fine Science Herramientas</td><td>FST 12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte de vannas rectas</td><td>Fine Science Tools</td><td>25001-08</td><td></td></tr><tr><td>TrizChLOR4</td><td>Lista de códigos nacionales de medicamentos</td><td>17033-279-50</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo murino de disfunción de la mano relacionada con el acceso a la hemodiálisis

A Murine Model of Hemodialysis Access-Related Hand Dysfunction

La enfermedad renal crónica es un importante problema de salud pública, y la prevalencia de la enfermedad renal terminal (ESRD) que requiere terapias de reemplazo renal crónicas como la hemodiálisis continúa aumentando. La colocación de fístula arteriovenosa autógena (FAV) sigue siendo una opción de acceso vascular primario para los pacientes con ESRD. Desafortunadamente, aproximadamente la mitad de los pacientes de hemodiálisis experimentan disfunción de la mano relacionada con el acceso a diálisis (ARHD), que va desde parestesia sutil hasta gangrena digital. En particular, los impulsores biológicos subyacentes responsables de la ARHD son poco conocidos, y no existe un modelo animal adecuado para dilucidar los mecanismos y / o desarrollar nuevas terapias para la prevención / tratamiento de ARHD. Aquí, describimos un nuevo modelo de ratón en el que se crea una FAV entre la arteria ilíaca común izquierda y la vena, facilitando así la evaluación de la fisiopatología de las extremidades. La microcirugía incluye aislamiento de vasos, venotomía longitudinal, creación de anastomosis arteriovenosa y reconstrucción venosa. Las cirugías simuladas incluyen todos los pasos críticos, excepto la creación de FAV. La colocación de FAV ilíaca da lugar a alteraciones clínicamente relevantes en la hemodinámica central, isquemia periférica y deficiencias en el rendimiento neuromotor de las extremidades posteriores. Este nuevo modelo preclínico de FAV proporciona una plataforma útil que recapitula las perturbaciones neuromotoras comunes informadas por los pacientes en hemodiálisis, lo que permite a los investigadores investigar los mecanismos de la fisiopatología de ARHD y probar posibles terapias.

Los animales expuestos a una dieta de adenina han reducido las tasas de filtración glomerular (control: 441,3 ± 54,2 μL/min vs. ERC: 165,1 ± 118,3 μL/min, p &lt; 0,05) y un aumento de los niveles séricos de nitrógeno ureico en sangre (control: 20,39 ± 4,2 μL/min vs. ERC: 38,20 ± 10,65 μL/min, p &lt; 0,05) en comparación con los animales que recibieron chow a base de caseína, confirmando la presencia de insuficiencia renal antes de la cirugía de fístula arteriovenosa.
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Este protocolo detalla los pasos quirúrgicos de la creación de fístula arteriovenosa ilíaca común murina. Desarrollamos este modelo para estudiar la fisiopatología de las extremidades relacionada con el acceso a la hemodiálisis.

Un modelo murino de disfunción de la mano relacionada con el acceso a la hemodiálisis

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement ...

Este es el único modelo animal disponible para estudiar los mecanismos responsables de la isquemia de la mano relacionada con el acceso a diálisis. El modelo proporciona una plataforma robusta para examinar la compleja interacción entre la uremia y las perturbaciones neuromusculares que resultan de los cambios hemodinámicos resultantes de la cirugía de fístula venosa arterial. La disfunción de la mano relacionada con el acceso afecta hasta al 60% de los pacientes en hemodiálisis y puede afectar gravemente la calidad de vida del paciente.Este modelo nos ayuda a comprender la discapacidad y probar terapias novedosas. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Raymond Kim, un investigador postdoctoral de nuestro laboratorio. Para comenzar, coloque el ratón anestesiado en posición supina en una mesa de cirugía cubierta por una cortina estéril y aplique el lubricante ocular para proteger los ojos de la sequedad durante la cirugía.Usando un recortador de plumas, afeite el vello abdominal para la operación y el vello de las piernas para las mediciones de perfusión postoperatorias, luego limpie el cabello del campo quirúrgico. A continuación, fije las extremidades superiores e inferiores con bandas elásticas y tachuelas. Verifique la profundidad de la anestesia monitoreando el reflejo de pellizco del dedo del pie y titule la anestesia según sea necesario.Realice la evaluación del patrón respiratorio cada tres a cinco minutos durante todo el procedimiento quirúrgico para calibrar el nivel de anestesia. Haga una laparotomía de la línea media desde el borde inferior del margen esternal hasta la sínfisis del pubis y disecte la almohadilla de grasa del pubis para obtener un campo operatorio más amplio. Abra la celiotomía para acceder al contenido peritoneal y cubra los intestinos con una esponja no tejida empapada en solución salina.A continuación, diseccione cuidadosamente la fascia perivascular y el tejido adiposo desde aproximadamente un centímetro proximal hasta la bifurcación aórtica, extendiéndose hasta el nivel de la bifurcación ilíaca izquierda utilizando pinzas Dumont rectas y pequeños hisopos de algodón de punta afilada dura de doble extremo. Luego pase la punta de los fórceps en ángulo debajo del haz vascular ilíaco común izquierdo y extienda suavemente varias veces para movilizar los vasos de la musculatura retroperitoneal subyacente. Coloque dos suturas de seda 4-0 alrededor del haz venoso aislado de la arterio ilíaca común izquierda y utilícelas como ligaduras al haz vascular.Luego crea un solo nudo con cada corbata de seda 4-0 y aplícalos secuencialmente, proximalmente y luego distalmente. A continuación, utilizando las cuerdas de sutura de seda 4-0 como asas, gire el haz vascular venoso arterial ilíaco izquierdo en el sentido de las agujas del reloj y ajuste la posición para ubicar temporalmente la vena anterior a la arteria. Haga una venotomía longitudinal de aproximadamente un milímetro con una tijera de resorte Vannas rectas y elimine suavemente la sangre residual de la luz venosa con solución salina al 0,9%.Luego, coloque una sutura de nylon 10-0 implicadora a través de la pared posterior de la vena. Después, agarre los extremos de sutura implicados y colóquelos bajo una tensión suave para desplazar la pared anterior de la pared posterior de la arteria ilíaca. A continuación, haga una incisión elíptica de un tamaño de aproximadamente 1.0 por 0.3 milímetros utilizando tijeras curvas de resorte Vannas, eliminando las paredes adherentes tanto de la arteria ilíaca como de la vena.Elimine suavemente la sangre residual de la luz arterial expuesta con solución salina al 0,9% y solución salina heparinizada. Después de la creación de la fístula venosa arterial, reparar la venotomía inicial de la pared anterior utilizando de dos a tres suturas de nylon 10-0 de manera interrumpida. Luego, restaure el haz vascular a su orientación anatómica original y coloque un pequeño trozo de esponja de gelatina absorbible empapada en solución salina adyacente a la venotomía reparada para facilitar la hemostasia.Luego, afloje las ligaduras de pinza cruzada de un solo nudo 4-0 secuencialmente de distal a proximal, mientras monitorea de cerca el sitio de la venotomía para detectar sangrado excesivo. Frote suavemente el haz vascular con pequeños hisopos de algodón de punta dura y puntiaguda de doble extremo que facilitan aún más la restauración del flujo sanguíneo. A continuación, confirme el éxito técnico de la operación utilizando la visualización de sangre oxigenada de color rojo brillante pulsátil que ingresa a la vena ilíaca y se mezcla con sangre venosa oscura que regresa de la extremidad posterior.Inyecte solución salina heparinizada en la vena cava inferior para la anticoagulación sistémica para mejorar los resultados de permeabilidad de la fístula venosa arterial, y vuelva a inspeccionar el sitio quirúrgico para detectar hemostasia después de la inyección de solución salina heparinizada. Si no hay problemas de sangrado, cierre la fascia de la línea media y luego la incisión de la piel con suturas absorbibles 5-0 PGA en forma de correr. Se utilizó ecografía Doppler para validar la permeabilidad de la fístula venosa arterial.El Doppler color reveló un flujo turbulento en el sitio de la fístula, y el ensanchamiento espectral pulsátil se visualizó en la evaluación Doppler de onda de pulso. Si la fístula es permeable, la aorta tiene una velocidad sistólica máxima elevada y diastólica final, mientras que la vena cava inferior desarrolla pulsatilidad con velocidad máxima elevada. La dilatación de los vasos tanto en la aorta como en la vena cava inferior es evidente con mediciones seriadas pre y postoperatorias.Las mediciones de ultrasonido Doppler de onda B y de onda de pulso después de la cirugía revelaron dilatación de los vasos de entrada y salida y aumentos en la velocidad sistólica máxima en comparación con los animales simulados. La evaluación Doppler láser de las extremidades posteriores mostró que los déficits de perfusión POD izquierda eran aproximadamente el 20% de la extremidad contralateral después de la cirugía, con una recuperación gradual con el tiempo. El déficit de perfusión del músculo tibial anterior fue de aproximadamente el 60% después de la cirugía, con una recuperación similar.La función neuromotora de las extremidades posteriores se cuantificó mediante pruebas de fuerza de agarre y análisis del patrón de marcha en cinta rodante, que se realizaron secuencialmente durante todo el período de recuperación. La fuerza de agarre unilateral esperada es de aproximadamente el 50% de la extremidad contralateral en el cuarto día postoperatorio con recuperación gradual. Cada paso de microcirugía debe realizarse con especial cuidado para evitar posibles traumatismos nerviosos o vasculares que pueden causar cambios sustanciales tanto en la hemodinámica como en la patología de las extremidades.Después de la caracterización del modelo, se pudieron explorar una multitud de estudios que examinan los impulsores biológicos de la disfunción neuromuscular resultante de la colocación de la fístula arteriovenosa.

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Investigación

JoVE Journal

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Medicina

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