In vivo Imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones de un ratón usando una ventana craneal grande

Este protocolo muestra una creación de una gran ventana craneal para medir las actividades de reserva de campo amplio y de una sola célula en el mismo ratón. Usando nuestro método, se puede hacer una ventana craneal grande y estable con envoltura de alimentos a bajo costo. Este método es efectivo para estudiar las actividades neuronales y gliales durante el comportamiento a nivel macroscópico y microscópico.

Se recomienda comenzar con una pequeña ventana craneal. Luego, si tiene éxito, aumente el tamaño de la ventana. Comience retirando el cemento adicional sobre el cráneo con un taladro dental.

Marque el área a cortar con un bolígrafo. Corte el hueso con un bisturí con una punta roma para asegurarse de que la punta no penetre en el cráneo. Raspa el hueso repetidamente con un bisturí para profundizar el surco hasta que el hueso en el área a recortar se mueva cuando se toca ligeramente.

Retire el hueso inciso con pinzas finas. Tenga cuidado de no empujar el colgajo óseo en el cerebro que puede dañar el cerebro. Para quitar la duramadre, corte la duramadre con una pipeta de vidrio tirado con una punta cónica de aproximadamente 10 micrómetros.

Use una aguja en forma de U para expandir este corte sobre toda la ventana. Bajo un microscopio estéreo ajustado con un zoom de 60 a 100x, retire la duramadre cortada con pinzas ultrafinas. En caso de sangrado, enjuague con aCSF o use una esponja de gelatina para detener el sangrado.

Luego, esterilice un trozo grande de envoltura de PVDC en autoclave y con etanol al 70%. Bajo un microscopio estéreo, use pinzas y un bisturí para cortar una envoltura del tamaño requerido. Coloque la envoltura en la superficie del cerebro mientras deja el aCSF en la superficie.

Aspire el aCSF del borde de la envoltura, permitiendo que la envoltura se adhiera firmemente a la superficie del cerebro. Recorte la envoltura con un bisturí y pinzas de tal manera que haya aproximadamente un margen de un milímetro entre el borde de la ventana craneal y la envoltura. Una vez que la envoltura esté en su lugar, pegue el borde de la envoltura al cráneo con un adhesivo biológico.

Deje que el adhesivo se seque durante unos 30 minutos. Usando un dispensador con una punta de mezcla, aplique un elastómero de silicona transparente en la parte superior de la envoltura. Coloque el vidrio de cubierta de espesor de 0.12 a 0.17 milímetros en la parte superior.

Selle el perímetro del vidrio de la cubierta con película impermeable, superglue o cemento dental. Primero, mezcle las soluciones de fibroína y AAV en una proporción de uno a cuatro en un pequeño tubo de muestra. Deje caer una alícuota de la solución en la envoltura de plástico para la ventana craneal y séquela durante al menos tres horas.

Luego coloque la envoltura en la superficie del cerebro como se muestra en la sección anterior. Verifique el estado de los ratones y las ventanas regularmente, de dos a cuatro semanas. En este momento, los indicadores de calcio codificados genéticamente se expresarán suficientemente después de crear la ventana tratada con AAV.

Usando este protocolo, las ventanas craneales podrían mantenerse en ocho de cada 10 ratones durante un máximo de 10 semanas. Se crea una ventana ancha con envoltura de plástico, silicona transparente y vidrio de cubierta en un ratón transgénico que expresa un indicador de calcio genéticamente codificado anclado a la membrana en astrocitos. Las imágenes de calcio de campo amplio se realizaron a través de esta ventana y se observaron cambios de fluorescencia cuando se aplicó estimulación de soplo de aire a los bigotes contralaterales.

El curso temporal del cambio de fluorescencia en la corteza somatosensorial mostró actividad cortical. Las imágenes de dos fotones permitieron la observación de imágenes de fluorescencia de células individuales específicas de células gliales. Se observaron cambios de fluorescencia inducidos por la estimulación sensorial en células individuales de diferentes regiones corticales.

Envoltura codificada con AAV que expresa el indicador de calcio codificado genéticamente; y la fibroína se utilizó para hacer la ventana craneal. Las imágenes de calcio de campo amplio mostraron actividad cortical que se propaga a través de la corteza inducida por la estimulación sensorial de dos a cuatro semanas después de la cirugía. Dado que la ventana era grande, se tomaron imágenes de diferentes áreas corticales del mismo ratón y se observaron cambios de fluorescencia inducidos por la estimulación sensorial en células individuales.

Es importante evitar daños en el cerebro al hacer ventana craneal. Uno puede realizar tareas de comportamiento en ratones con una gran ventana craneal. Esto permitirá examinar la relación entre la actividad neuronal y el comportamiento del ratón.

Este método se puede aplicar a una variedad de estudios de neurociencia. Por ejemplo, se puede utilizar para observar la actividad cortical durante las tareas de toma de decisiones, la carrera motora y en modelos masivos de lesiones y enfermedades cerebrales.