Name: Expresión de transgenes en urotelio de vejiga nativa mediante transducción mediada por adenovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Aprende a expresar transgenes en urotelio nativo de vejiga mediante transducción con adenovirus en modelos de roedores. Este método alcanza una eficiencia del 95% para estudiar biología urotelial y enfermedades vesicales.

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Este trabajo fue apoyado por una adjudicación de proyecto piloto a través de P30DK079307 (a M.G.D.), subvención de los NIH R01DK119183 (a G.A. y M.D.C.), subvención de los NIH R01DK129473 (a G.A.), un premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana de Urología y una subvención de la Fundación Winters (a N.M.), por los Núcleos de Imágenes Renales de Fisiología Celular y Organismos Modelo del Centro de Investigación Renal de Pittsburgh (P30DK079307), y por S10OD028596 (a G.A.), que financió la compra del sistema confocal utilizado para capturar algunas de las imágenes presentadas en este manuscrito.

<ol><li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Urothelium%3A+Life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li>
<li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-regulated+exocytosis%2Fendocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li>
<li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li>
<li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li>
<li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li>
<li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li>
<li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+bladder%2C+cystitis+and+nerve%2Furothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li>
<li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uroepithelial-associated+sensory+web%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984(2021).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li>
<li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463(2014).</li>
<li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+conditional+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li>
<li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li>
<li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Quantitative+Cytology+and+Histology%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li>
<li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li>
<li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+delivery%3A+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li>
<li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li>
<li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal%2Ffusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li>
<li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Molecular+Biology+Organization+journal%22%5BJournal%5D)">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li>
<li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li>
<li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li>
<li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li>
<li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li>
<li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores%3A+identification+of+an+electrostatic+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li>
<li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li>
<li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaching+the+limit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804(2018).</li>
<li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888(2022).</li>
<li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mientras que Ramesh et al. se centraron en desarrollar estrategias para utilizar la transducción adenoviral en el tratamiento del cáncer de vejiga 18, informes más recientes han demostrado la utilidad de estas técnicas en el estudio de la biología/fisiología urotelial normal y la fisiopatología 10,18,19,20,21 . Las características impor...

El urotelio es el epitelio especializado que recubre la pelvis renal, los uréteres, la vejiga y la uretra proximal1. Comprende tres estratos: una capa de células paraguas a menudo binucleadas altamente diferenciadas y polarizadas, cuyas superficies apicales están bañadas en orina; una capa celular intermedia con una población de células binucleadas amplificadoras del tránsito que pueden dar lugar a células paraguas superficiales en respuesta a su pérdida aguda; y una sola capa de células basales, un subconjunto de las cuales funcionan como células madre que pueden regenerar la totalidad del urotelio en respuesta a una lesión crónica. Las células paraguas son las principales responsables de formar la barrera urotelial de alta resistencia, cuyos componentes incluyen una membrana apical (rica en colesterol y cerebrósidos) con baja permeabilidad al agua y los solutos, y un complejo de unión apical de alta resistencia (compuesto por uniones estrechas, uniones adherentes, desmosomas y un anillo de actomiosina asociado)1 . Tanto la superficie apical de la célula paraguas como su anillo de unión se expanden durante el llenado de la vejiga y vuelven a su estado precargado rápidamente después de vaciar 1,2,3,4,5. Además de su papel en la función de barrera, también se presume que el urotelio tiene funciones sensoriales y transductoras que le permiten detectar cambios en el medio extracelular (por ejemplo, estiramiento) y transmitir esta información a través de la liberación de mediadores (incluyendo ATP, adenosina y acetilcolina) a los tejidos subyacentes, incluidos los procesos nerviosos aferentes suburoteliales 6,7,8 . La evidencia reciente de este papel se encuentra en ratones que carecen de expresión urotelial tanto de Piezo1 como de Piezo2, lo que resulta en una función miccional alterada9. Además, las ratas que sobreexpresan la proteína formadora de poros de unión estrecha CLDN2 en la capa de células paraguas desarrollan inflamación y dolor análogos a los observados en pacientes con cistitis intersticial10. Se plantea la hipótesis de que la interrupción de la función sensorial/transductor urotelial o de barrera puede contribuir a varios trastornos de la vejiga 6,11.
Una mejor comprensión de la biología del urotelio en estados normales y de enfermedad depende de la disponibilidad de herramientas que permitan a los investigadores regular fácilmente a la baja la expresión génica endógena o permitir la expresión de transgenes en el tejido nativo. Si bien un enfoque para regular a la baja la expresión génica es generar ratones knockout uroteliales condicionales, este enfoque depende de la disponibilidad de ratones con alelos floxados, requiere mucho trabajo y puede tardar meses o años en completar12. No es sorprendente entonces, que los investigadores hayan desarrollado técnicas para transfectar o transducir el urotelio, lo que puede conducir a resultados en una escala de tiempo más corta. Los métodos publicados para la transfección incluyen el uso de lípidos catiónicos13, oligodesoxinucleótidos fosforotioados antisentido 14 o ácidos nucleicos antisentido atados a la proteína TAT del VIH que penetra en el péptido 11-mer15. Sin embargo, el enfoque de este protocolo está en el uso de la transducción mediada por adenovirus, una metodología bien estudiada que es eficiente en la entrega de genes a una amplia gama de células, se ha probado en numerosos ensayos clínicos y, más recientemente, se utilizó para administrar el ADNc que codifica la proteína de la cápside COVID-19 a los receptores de una variante de la vacuna COVID-1916, 17. Para una descripción más completa del ciclo de vida de los adenovirus, los vectores adenovirales y las aplicaciones clínicas de los adenovirus, se dirige al lector a la referencia17.
Un hito importante en el uso de adenovirus para transducir el urotelio fue un informe de Ramesh et al. que mostró pretratamientos cortos con detergentes, incluyendo N-dodecil-β-D-maltósido (DDM) dramáticamente mejorado transducción del urotelio por un adenovirus que codifica β-galactosidasa18. Utilizando este estudio de prueba de principio como guía, la transducción mediada por adenovirus del urotelio ahora se ha utilizado para expresar una variedad de proteínas, incluidas las GTPasas de la familia Rab, los factores de intercambio guanina-nucleótido, los fragmentos motores de miosina, las claudinas asociadas a la unión estrecha formadoras de poros y ADAM17 10,19,20,21,22 . El mismo enfoque se adaptó para expresar pequeños ARN interferentes (ARNsi), cuyos efectos fueron rescatados mediante la coexpresión de variantes resistentes al ARNip del transgen22. El protocolo aquí descrito incluye métodos generales para generar grandes cantidades de adenovirus altamente concentrados, requisito para estas técnicas, así como adaptaciones de los métodos de Ramesh et al.18 para expresar transgenes en el urotelio con alta eficiencia.

<table><tbody><tr><td>Pipeta de 10 mL</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4488</td><td>pipeta estéril serológica, envuelta individualmente</td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga de 12 mL</td><td>ThermoFisher</td><td>06-752 Tubo de</td><td>ultracentrífuga de pared fina de PET Tubo</td></tr> de <tr><td>centrífuga cónico de 15 mL</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>estéril aguja de 18 g</td><td>BD&nbsp;</td><td>305196</td><td>Aguja de 18 G x 1,5 pulgadas</td></tr><tr><td>Pipeta de 20 mL</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4489</td><td>pipeta serológica estéril, envuelta individualmente</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cónico de 50 mL</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352098</td> pipeta <td>estéril</td></tr> de <tr><td>5 mL</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4487</td><td>pipeta serológica estéril, envuelta individualmente</td></tr><tr><td>Cavicide</td><td>Henry Schein</td><td>6400012</td><td>Solución antiviral</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular - 15 cm</td><td>Falcon (Corning)</td><td>353025</td><td>estéril, tratado con cultivo de tejidos&nbsp; (Plato de 150 mm x 25 mm)</td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Sarstedt</td><td>893.1832</td><td>longitud del mango 24 cm, longitud de la hoja 1,7 cm</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>C-4306 Grado de</td><td>biología molecular &ge; 98%</td></tr><tr><td>Medio de cultivo DMEM (glucosa alta)</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td>con 4,5 g/L glucosa + L-glutamina + rojo</td></tr><tr><td>fenol EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>EDS</td><td>Bioiultra grado &ge; 99%</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Hyclone (Cytiva)</td><td>SH30070.03</td><td>sérico definido</td></tr><tr><td>Pipeta de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>5.75 en pipeta de vidrio, esterilizada en autoclave</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>G-5516</td><td>Grado de biología molecular &ge; 99%</td></tr><tr><td>Células HEK293 Las células</td><td>HEK293T ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>son una variante de las células HEK293 que expresan el antígeno T grande SV40</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Catéter intravenoso - ratón</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3063</td><td>24 G x 3/4 in Catéter intravenoso de seguridad&nbsp;</td></tr><tr><td>catéter intravenoso radiopaco - rata</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3060</td><td>22 G x 1 in Catéter intravenoso de seguridad radiopaco</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P-9541</td><td>Biología Molecular grado &ge; 99%</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5655</td><td>Grado de cultivo celular&nbsp; &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2HPO4&bull; 7 H2O</td><td>Millipore Sigma</td><td>431478</td><td>&nbsp; &ge; 99.99%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3014</td><td>Grado de Biología Molecular &ge; 99%</td></tr><tr><td>N-dodecilo-&beta;-D-maltósido&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4641</td><td>&nbsp; &ge; 98%</td></tr><tr><td>Cono de nariz para múltiples animales</td> Las opciones comerciales <td>diseñadas</td><td></td> a medida <td>incluyen una de Parkland Scientific (RES3200)</td></tr><tr><td>Columna PD-10&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-085-01</td><td>Columnas preempaquetadas rellenas con el antibiótico Sephadex G-25M</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (100x)</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>15070063</td><td>100x solución concentrada</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>BioFotómetro</td><td></td></tr><tr><td>Soporte y abrazadera</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-679Q y 05-769-8FQ</td><td>disponibles de numerosos proveedores</td></tr><tr><td>Unidad de filtro estéril</td><td>Fisher Scientific (Nalgene)</td><td>09-740-65B</td><td>0.2 &micro; m unidad de filtro de flujo rápido (150 mL)</td></tr><tr><td>Unidad de filtro estéril 0,2 y micro; m (jeringa)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SLGV004SL</td><td>Millipore Sigma Milex 0.22 &micro; m unidad de filtro que se conecta a la jeringa</td></tr><tr><td>centrífuga de súper velocidad</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810R</td><td>con rotor de ángulo fijo Eppendorf F34-6-38 (12.000 rpm)</td></tr><tr><td>Jeringa (1 mL)</td><td>BD&nbsp;</td><td>309628</td><td>Jeringa de 1 mL Punta Luer-lok - estéril</td></tr><tr><td>Jeringa (3 mL)</td><td>BD&nbsp;</td><td>309656</td><td>Punta deslizante de jeringa de 3 mL - estéril</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa (baja velocidad)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5702</td><td>con rotor de cangilón basculante</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>polietileno 3,4 mL</td></tr> pipeta <tr><td>de transferencia Tris-base</td><td>Millipore Sigma</td><td>648310-M</td><td>Grado de biología molecular&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE select solución de proteasa</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>12604013</td><td>Enzima exprés TrypLE (1x), ultracentrífuga sin rojo fenol</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-80 XP</td><td>con rotor Beckman SW41 (41.000 rpm)</td></tr><tr><td>Vaporizador&nbsp;</td><td>Servicios de Anestesia General, Inc.</td><td>Tec 3</td><td>Vaporizador de isoflurano</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>mezclador de vórtice analógico</td></tr></tbody></table>

expresión de transgenes en urotelio de vejiga nativa mediante transducción mediada por adenovirus

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Además de formar una barrera de alta resistencia, se plantea la hipótesis de que el urotelio que recubre la pelvis renal, los uréteres, la vejiga y la uretra proximal detecta y transmite información sobre su entorno a los tejidos subyacentes, promoviendo la función miccional y el comportamiento. La interrupción de la barrera urotelial, o su función sensorial/transductora, puede conducir a la enfermedad. El estudio de estos eventos complejos se ve obstaculizado por la falta de estrategias simples para alterar la expresión génica y proteica en el urotelio. Aquí se describen métodos que permiten a los investigadores generar grandes cantidades de adenovirus de alto título, que luego se pueden usar para transducir urotelio de roedores con alta eficiencia y de una manera relativamente sencilla. Tanto los ADNc como los ARN interferentes pequeños pueden expresarse mediante transducción adenoviral, y el impacto de la expresión transgénica en la función urotelial se puede evaluar de 12 h a varios días después. Estos métodos tienen una amplia aplicabilidad a estudios de biología urotelial normal y anormal utilizando modelos animales de ratón o rata.

Preparación del virus Un ejemplo de purificación de virus por centrifugación por gradiente de densidad se muestra en la Figura 1A. La banda de color rosa claro, que se encuentra en la interfaz del material celular cargado y la capa de CsCl de 1,25 g/ml, está compuesta principalmente de células interrumpidas y sus restos (ver flecha magenta en la Figura 1A). Deriva su color rosado de la pequeña cantidad de medio de cultivo que se transfiere de...

Se describen métodos para la generación de grandes cantidades de adenovirus recombinantes, que luego se pueden utilizar para transducir el urotelio nativo de roedores permitiendo la expresión de transgenes o la regulación a la baja de productos génicos endógenos.

Expresión de transgenes en urotelio de vejiga nativa mediante transducción mediada por adenovirus

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Este protocolo describe métodos que permiten a los investigadores expresar CDNA o SIRNA en el urotelio de la vejiga nativa. Las principales ventajas de esta técnica son su relativa simplicidad, la capacidad de expresar ADNc, ARNip en el urotelio con alta eficiencia y en un período de tiempo relativamente corto. La parte más difícil de esta técnica es el cateterismo.Sin embargo, la técnica general es relativamente fácil de dominar una vez aprendida. Demostrando el procedimiento estará Giovanni Ruiz, un especialista en investigación IV en mi laboratorio. Para comenzar, coloque el mouse anestesiado en una almohadilla térmica junto a los conos nasales.Mantener al animal bajo anestesia durante la duración del protocolo. Confirme que el ratón está completamente anestesiado con un pellizco en el dedo del pie. Para evitar la introducción de aire en la vejiga, llene la porción plástica del catéter de un catéter intravenoso y el cubo asociado con PBS estéril usando una pipeta o jeringa de transferencia estéril.Con el animal en posición supina frotamos el meato uretral externo con 70% de alcohol. Luego agarre suavemente el tejido que forma el meato uretral externo y extiéndalo verticalmente lejos del animal usando fórceps finos. Inserte el catéter estéril en el meato externo.Con la otra mano, inserte cuidadosamente el catéter verticalmente de tres a cuatro milímetros en el meato uretral. Luego baje el catéter insertado en el meato externo hacia la cola del animal, lo que facilita su entrada en la porción de la uretra que pasa por debajo del hueso púbico y finalmente a la vejiga. Permita que la orina en la vejiga se escape.Elimine cualquier orina residual realizando la maniobra de Crede masajeando y presionando suavemente hacia abajo sobre la protuberancia de la vejiga en el área abdominal inferior. Para hacer que el urotelio sea receptivo a la transducción, lave la vejiga del ratón o rata conectando una jeringa estéril de un mililitro llena de PBS al cubo del catéter. Inyecte 100 microlitros de PBS estéril en la vejiga del ratón.Después de separar la jeringa del accesorio del catéter, permita que el PBS drene. Instilar 100 microlitros de 0,1% N-dodecil-beta-D-maltósido disuelto en PBS y filtro de 0,2 micrómetros esterilizado en la vejiga del ratón utilizando una jeringa estéril de un mililitro. Retenga el N-dodecil-beta-D-maltósido en la vejiga durante 10 minutos dejando la jeringa en su lugar.Retire el N-dodecil-beta-D-maltósido de la vejiga desprendiendo la jeringa y dejando que drene. Para introducir el virus en la vejiga, conecte una jeringa estéril de un mililitro al cubo del catéter e instilar 5, 000, 000 a 100, 000, 000 IVP de adenovirus diluido en 100 microlitros de PBS estéril para ratones, o 450 microlitros para ratas en la vejiga. Después de 30 minutos, separe la jeringa y permita que la solución de virus evacue la vejiga a una almohadilla desechable.Seque cualquier solución de virus residual con una toallita absorbente mientras desecha la almohadilla y limpie los desechos biopeligrosos. Para permitir que el animal se recupere, detenga el flujo de isoflurano. Permita que el animal se recupere y esté completamente móvil antes de devolverlo a su jaula, especialmente si los animales están alojados en grupos.Analizar los efectos de la expresión transgénica de 12 a 72 horas después del tratamiento utilizando métodos como la hibridación in situ de ARNm, Western blot o inmunofluorescencia. El análisis Western blot de lisados uroteliales reveló expresión de hormona de crecimiento humana marcada con V5 en el urotelio de vejigas transducidas, pero no en las no transducidas. La expresión también fue confirmada por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos que reconocieron la hormona del crecimiento humano, o la etiqueta de epítopo V5.El análisis de Western blot confirmó la expresión de Claudin-2 en ratas transducidas con adenovirus, pero no en aquellas transducidas con un virus controlado que codifica GFP. El análisis de inmunofluorescencia confirmó además la expresión exógena de claudina-2 en células paraguas uroteliales transducidas con ADNc de claudina-2 que codifica el virus. La detección de claudina-2 exógena en la proteína de unión estrecha 1 por inmunofluorescencia y microscopía confocal de urotelio montado entero o seccionado transversalmente reveló la presencia de acumulación de unión estrecha e intracelular de claudina-2 en el citoplasma celular.El campo de imagen muestra que contar el número de células paraguas transducidas revela una eficiencia que se acerca al 95% y en la totalidad de la pared de la vejiga solo se transduce el urotelio, y ningún otro tejido es atacado por el adenovirus instilado. El cateterismo es crítico para que el protocolo funcione según lo previsto. Esta técnica permite a los investigadores estudiar la biología urotelial normal, así como comprender las condiciones en las que la sobreexpresión de proteínas, o la subexpresión, conduce a la enfermedad.

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