Expresión de transgenes en urotelio de vejiga nativa mediante transducción mediada por adenovirus

Este protocolo describe métodos que permiten a los investigadores expresar CDNA o SIRNA en el urotelio de la vejiga nativa. Las principales ventajas de esta técnica son su relativa simplicidad, la capacidad de expresar ADNc, ARNip en el urotelio con alta eficiencia y en un período de tiempo relativamente corto. La parte más difícil de esta técnica es el cateterismo.

Sin embargo, la técnica general es relativamente fácil de dominar una vez aprendida. Demostrando el procedimiento estará Giovanni Ruiz, un especialista en investigación IV en mi laboratorio. Para comenzar, coloque el mouse anestesiado en una almohadilla térmica junto a los conos nasales.

Mantener al animal bajo anestesia durante la duración del protocolo. Confirme que el ratón está completamente anestesiado con un pellizco en el dedo del pie. Para evitar la introducción de aire en la vejiga, llene la porción plástica del catéter de un catéter intravenoso y el cubo asociado con PBS estéril usando una pipeta o jeringa de transferencia estéril.

Con el animal en posición supina frotamos el meato uretral externo con 70% de alcohol. Luego agarre suavemente el tejido que forma el meato uretral externo y extiéndalo verticalmente lejos del animal usando fórceps finos. Inserte el catéter estéril en el meato externo.

Con la otra mano, inserte cuidadosamente el catéter verticalmente de tres a cuatro milímetros en el meato uretral. Luego baje el catéter insertado en el meato externo hacia la cola del animal, lo que facilita su entrada en la porción de la uretra que pasa por debajo del hueso púbico y finalmente a la vejiga. Permita que la orina en la vejiga se escape.

Elimine cualquier orina residual realizando la maniobra de Crede masajeando y presionando suavemente hacia abajo sobre la protuberancia de la vejiga en el área abdominal inferior. Para hacer que el urotelio sea receptivo a la transducción, lave la vejiga del ratón o rata conectando una jeringa estéril de un mililitro llena de PBS al cubo del catéter. Inyecte 100 microlitros de PBS estéril en la vejiga del ratón.

Después de separar la jeringa del accesorio del catéter, permita que el PBS drene. Instilar 100 microlitros de 0,1% N-dodecil-beta-D-maltósido disuelto en PBS y filtro de 0,2 micrómetros esterilizado en la vejiga del ratón utilizando una jeringa estéril de un mililitro. Retenga el N-dodecil-beta-D-maltósido en la vejiga durante 10 minutos dejando la jeringa en su lugar.

Retire el N-dodecil-beta-D-maltósido de la vejiga desprendiendo la jeringa y dejando que drene. Para introducir el virus en la vejiga, conecte una jeringa estéril de un mililitro al cubo del catéter e instilar 5, 000, 000 a 100, 000, 000 IVP de adenovirus diluido en 100 microlitros de PBS estéril para ratones, o 450 microlitros para ratas en la vejiga. Después de 30 minutos, separe la jeringa y permita que la solución de virus evacue la vejiga a una almohadilla desechable.

Seque cualquier solución de virus residual con una toallita absorbente mientras desecha la almohadilla y limpie los desechos biopeligrosos. Para permitir que el animal se recupere, detenga el flujo de isoflurano. Permita que el animal se recupere y esté completamente móvil antes de devolverlo a su jaula, especialmente si los animales están alojados en grupos.

Analizar los efectos de la expresión transgénica de 12 a 72 horas después del tratamiento utilizando métodos como la hibridación in situ de ARNm, Western blot o inmunofluorescencia. El análisis Western blot de lisados uroteliales reveló expresión de hormona de crecimiento humana marcada con V5 en el urotelio de vejigas transducidas, pero no en las no transducidas. La expresión también fue confirmada por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos que reconocieron la hormona del crecimiento humano, o la etiqueta de epítopo V5.

El análisis de Western blot confirmó la expresión de Claudin-2 en ratas transducidas con adenovirus, pero no en aquellas transducidas con un virus controlado que codifica GFP. El análisis de inmunofluorescencia confirmó además la expresión exógena de claudina-2 en células paraguas uroteliales transducidas con ADNc de claudina-2 que codifica el virus. La detección de claudina-2 exógena en la proteína de unión estrecha 1 por inmunofluorescencia y microscopía confocal de urotelio montado entero o seccionado transversalmente reveló la presencia de acumulación de unión estrecha e intracelular de claudina-2 en el citoplasma celular.

El campo de imagen muestra que contar el número de células paraguas transducidas revela una eficiencia que se acerca al 95% y en la totalidad de la pared de la vejiga solo se transduce el urotelio, y ningún otro tejido es atacado por el adenovirus instilado. El cateterismo es crítico para que el protocolo funcione según lo previsto. Esta técnica permite a los investigadores estudiar la biología urotelial normal, así como comprender las condiciones en las que la sobreexpresión de proteínas, o la subexpresión, conduce a la enfermedad.