Generación de células asesinas naturales a partir de células madre humanas de potencial expandido

Hablando de importancia, la generación de células NK a partir de una fuente expandible es fundamental para aplicaciones como la inmunoterapia contra el cáncer. La ventaja de esta tecnología es que se pueden utilizar células madre potenciales expandidas que poseen una capacidad de diferenciación más amplia en lugar de células IP regulares. Para la prediferenciación de hEPSC, retire el medio hEPSC en el que se mantuvieron las células y agregue un mililitro de medio DFK.

Incubar durante dos o tres días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para verificar la formación de cuerpos embrioides, después de eliminar el medio DFK gastado, lave las células una vez con un mililitro de PBS. Agregue 500 microlitros de tripsina al 0,05% e incube la placa a 37 grados centígrados y dióxido de carbono al 5% durante tres a siete minutos, según la morfología.

Una vez que se elimina la tripsina, y dos mililitros de DFK medio para cosechar las células. Girar las celdas a 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el sobrenadante, agregue un mililitro de medio DFK y un microlitro de Y-27632 y resuspenda las células moviéndolo.

Contar las células utilizando un hemocitómetro y diluir la suspensión celular con medio DFK y Y-27632 para obtener 4.000 células por cada 25 microlitros de medio. Coloque de 30 a 40 gotas de suspensión celular en la tapa de una placa de Petri de 10 centímetros y vierta un poco de PBS en la placa inferior para evitar la evaporación de las gotas. Invierta suavemente la tapa para cubrir el plato e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres días.

Para recolectar los cuerpos embrioides de la gota, usando una pipeta de un mililitro que contiene PBS, bombee un poco de PBS en la gota y aspire el medio, incluidos los cuerpos embrioides. Luego, transfiera estos cuerpos embrioides a un tubo de 15 mililitros y gírelos a 100 G durante un minuto a temperatura ambiente. Después de retirar el sobrenadante, agregue un mililitro de A. Transferir los cuerpos embrioides recolectados a una placa de 24 pocillos no adherente y considéralo el día cero.

Para realizar el patrón de mesodermo de los cuerpos embrioides, incubar la placa durante tres días a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. En el segundo día, reemplace 500 microlitros de medio A gastado con medio A fresco del mismo volumen. Para realizar la especificación hematoendotelial del cuerpo embrioide, retire 700 microlitros del medio A del pozo y agregue el mismo volumen de medio B.Culture durante siete días, cambiando el medio medio cada dos días.

Para transferir los cuerpos embrioides estampados a una interfaz aire/líquido, incline ligeramente la placa para que los cuerpos embrioides se agreguen en la parte inferior y, con una pipeta de un mililitro, retire la mayor cantidad posible de medio B. Ahora recoger los cuerpos embrionarios con una pipeta aspirando el medio restante y transferirlos a un trans-pozo en una placa de 24 pocillos, Para realizar la expansión del progenitor linfoide, agregue 500 microlitros de medio NK-1 al compartimiento inferior del pozo trans, cultive durante 14 días y realice un cambio de medio cada dos días. Para recubrir la placa, diluya el material de recubrimiento en PBS, agregue un mililitro de solución de recubrimiento diluida a cada pocillo de una placa de 12 pocillos y cubra la abertura de la placa con una película de envoltura.

Incubar el plato a cuatro grados centígrados durante la noche. Agregue 200 microlitros de PBS en el pozo trans y pipetear lentamente hacia arriba y hacia abajo alrededor de cinco a seis veces para cosechar las células liberadas de los organoides. Transfiera la suspensión celular cosechada a un tubo de dos mililitros y gire las células a 500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de retirar el sobrenadante, resuspenda las células en un mililitro de medio NK-1. Retire toda la solución de recubrimiento del pozo y lave cada pocillo de una placa de 12 pocillos con un mililitro de PBS dos veces. A continuación, divida las células cosechadas en una proporción de 1: 2 y transfiera la suspensión celular a una placa recubierta de 12 pocillos.

Agregue un mililitro de NK-1 medio para que cada pocillo tenga 1.5 mililitros de medio. Para cambiar el medio, permita que las células se hundan hasta el fondo durante uno o dos minutos. Luego, aspire cuidadosamente 750 microlitros de medio y gírelo hacia abajo como se demostró anteriormente.

Después de desechar el sobrenadante, resuspenda el pellet obtenido en 750 microlitros de medio NK-1 pipeteando de cinco a seis veces y transfiéralo al pozo original. En el presente estudio, se analizaron los productos derivados de hEPSC en el punto final. Aproximadamente el 15% de las células disociadas del sistema de cultivo 3D de dos lotes inducidos en diferentes puntos de tiempo eran CD3 negativos, CD56 positivos y el 16% de las células eran CD45 positivos, CD-56 positivos, lo que está en línea con los porcentajes de células CD3 negativas, CD56 positivas observadas en ensayos anteriores.

Los porcentajes de células CD3 negativas, CD56 positivas en las células recolectadas del sistema de cultivo 2D variaron de 30 a 6%Los productos derivados de hEPSC durante el día 18 de cultivo del sistema 2D mostraron expresión de CD56 y CD107a ectópica en el 12% de las células después de dos horas de estimulación con anticuerpos, y aproximadamente el 28% de las células recolectadas fueron CD94 positivas, CD159a-positivo. Los productos de diferenciación in vitro se probaron para determinar la citotoxicidad contra las células de eritroleucemia humana K562. Cuando se cultivan conjuntamente con objetivos tumorales durante tres horas, los productos diferenciados muestran citotoxicidad leve en comparación con una línea celular permanente independiente de la interleucina 2 células NK92mi.

Siguiendo este método, se pueden generar células como células T, células B y eritrocitos.