Production de cellules tueuses naturelles à partir de cellules souches humaines à potentiel élargi

En parlant d’importance, la génération de cellules NK à partir d’une source extensible est essentielle pour des applications telles que l’immunothérapie du cancer. L’avantage de cette technologie est que des cellules souches à potentiel élargi possédant une capacité de différenciation plus large peuvent être utilisées à la place des cellules IP ordinaires. Pour la prédifférenciation des CSEPH, retirer le milieu hEPSC dans lequel les cellules ont été maintenues et ajouter un millilitre de milieu DFK.

Incuber pendant deux à trois jours à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour vérifier la formation de corps embryoïdes, après avoir retiré le milieu DFK épuisé, lavez les cellules une fois avec un millilitre de PBS. Ajouter 500 microlitres de trypsine 0,05% et incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois à sept minutes, en fonction de la morphologie.

Une fois la trypsine éliminée, et deux millilitres de milieu DFK pour récolter les cellules. Faites tourner les cellules à 300 g pendant trois minutes à température ambiante. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez un millilitre de milieu DFK et un microlitre de Y-27632 et remettez les cellules en suspension en les effleurant.

Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et diluer la suspension cellulaire avec le milieu DFK et Y-27632 pour obtenir 4 000 cellules par 25 microlitres de milieu. Placez 30 à 40 gouttes de suspension cellulaire sur le capuchon d’une boîte de Petri de 10 centimètres et versez un peu de PBS dans la boîte inférieure pour empêcher l’évaporation des gouttelettes. Retourner doucement le bouchon pour couvrir le plat et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours.

Pour recueillir les corps embryoïdes de la gouttelette, à l’aide d’une pipette d’un millilitre contenant du PBS, pompez un peu de PBS dans la gouttelette et aspirez le milieu, y compris les corps embryoïdes. Ensuite, transférez ces corps embryoïdes dans un tube de 15 millilitres et faites-les tourner à 100 G pendant une minute à température ambiante. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez un millilitre de milieu A.Transférez les corps embryoïdes collectés dans une plaque non adhérente de 24 puits et considérez-le jour zéro.

Pour effectuer la structuration mésodermique des corps embryoïdes, incuber la plaque pendant trois jours à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le deuxième jour, remplacez 500 microlitres de milieu A usagé par un milieu A frais du même volume. Pour effectuer la spécification hématoendothéliale du corps embryoïde, retirer 700 microlitres du milieu A du puits et ajouter le même volume de milieu B.Culture pendant sept jours, en changeant le demi-milieu tous les deux jours.

Pour transférer les corps embryoïdes à motifs sur une interface air/liquide, inclinez légèrement la plaque de sorte que les corps embryoïdes s’agrègent au fond et, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, retirez autant de milieu B que possible. Maintenant, ramassez les corps embryonnaires avec une pipette en aspirant le milieu restant et transférez-les dans un puits trans dans une plaque de 24 puits, Pour effectuer l’expansion des progéniteurs lymphoïdes, ajoutez 500 microlitres de milieu NK-1 au compartiment inférieur du puits trans, cultivez pendant 14 jours et effectuez un changement de milieu tous les deux jours. Pour recouvrir la plaque, diluez le matériau de revêtement dans du PBS, ajoutez un millilitre de solution de revêtement diluée à chaque puits d’une plaque de 12 puits et couvrez l’ouverture de la plaque avec un film d’emballage.

Incuber la plaque à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ajoutez 200 microlitres de PBS dans le puits trans et pipette lentement de haut en bas environ cinq à six fois pour récolter les cellules libérées par les organoïdes. Transférer la suspension cellulaire récoltée dans un tube de deux millilitres et faire tourner les cellules à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante.

Après avoir retiré le surnageant, remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu NK-1. Retirez toute la solution de revêtement du puits et lavez deux fois chaque puits d’une plaque de 12 puits avec un millilitre de PBS. Ensuite, divisez les cellules récoltées dans un rapport de 1:2 et transférez la suspension cellulaire sur une plaque enduite de 12 puits.

Ajoutez un millilitre de milieu NK-1 pour que chaque puits contienne 1,5 millilitre de milieu. Pour changer le milieu, laissez les cellules couler au fond pendant une à deux minutes. Ensuite, aspirez soigneusement 750 microlitres de milieu et faites-le tourner vers le bas comme démontré précédemment.

Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille obtenue dans 750 microlitres de milieu NK-1 en pipetant cinq à six fois et transférez-la dans le puits d’origine. Dans la présente étude, les produits dérivés de l’hEPSC au critère d’évaluation ont été analysés. Environ 15% des cellules dissociées du système de culture 3D de deux lots induits à des moments différents étaient CD3 négatif, CD56 positif, et 16% des cellules étaient CD45-positives, CD-56-positives, ce qui est conforme aux pourcentages de cellules CD3-négatives et CD56-positives observées dans les essais antérieurs.

Les pourcentages de cellules CD3 négatives et CD56 positives dans les cellules récoltées à partir du système de culture 2D variaient de 30 à 6 %Les produits dérivés de l’hEPSC au cours de la culture du jour 18 à partir du système 2D ont montré une expression de CD56 et CD107a ectopiques dans 12 % des cellules après deux heures de stimulation des anticorps, et environ 28 % des cellules récoltées étaient CD94-positives. CD159a-positif. Les produits de différenciation in vitro ont été testés pour la cytotoxicité contre les cellules érythroleucémiques humaines K562. Lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cibles tumorales pendant trois heures, les produits différenciés présentent une légère cytotoxicité par rapport à une lignée cellulaire permanente indépendante de l’interleukine 2 cellules NK92mi.

En suivant cette méthode, des cellules telles que les cellules T, les cellules B et les érythrocytes peuvent être générées.