Name: Ensayo de punto vacío en tiempo real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprenda a realizar el ensayo de punto vacío en tiempo real para estudiar el comportamiento miccional en ratones mediante monitoreo por video. Este método proporciona datos temporales, espaciales y volumétricos sobre los eventos de micción en fases de luz y oscuridad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por una subvención de los NIH R01DK119183 (a G.A. y M.D.C.), una subvención de proyecto piloto a través de P30DK079307 (a M.G.D.), un premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana de Urología y una subvención de la Fundación Winters (a N.M.), y por los Núcleos de Imágenes Renales de Fisiología Celular y Organismos Modelo del Centro de Investigación Renal de Pittsburgh (P30DK079307).

<ol><li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urothelium%3A+life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The urothelium: life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621(2020).</li>
<li>de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+control+of+the+lower+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neural control of the lower urinary tract.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 327(2015).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> JCI Insight. 6 (19), (2021).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+infection+with+uropathogenic+Escherichia+coli+increases+the+excitability+of+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1(2022).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070(2015).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+tight+junction+barrier+dysfunction+sensitizes+bladder+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li>
<li>Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+K%2B+promotes+irritative+voiding+symptoms+and+pain+in+the+face+of+urothelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5509(2019).</li>
<li>Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urological+complications+of+obesity+and+diabetes+in+males+and+females+of+three+mouse+models%3A+temporal+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160(2020).</li>
<li>Bartolone, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micturition+defects+and+altered+bladder+function+in+the+klotho+mutant+mouse+model+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).</li>
<li>de Rijk, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging-associated+changes+in+oxidative+stress+negatively+impacts+the+urinary+bladder+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22International+Neurourology+Journal%22%5BJournal%5D)">Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium.</a> International Neurourology Journal. 26 (2), 111(2022).</li>
<li>Coyne, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+lower+urinary+tract+symptoms+%28LUTS%29+and+overactive+bladder+%28OAB%29+by+racial%2Fethnic+group+and+age%3A+results+from+OAB-POLL%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL.</a> Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230(2013).</li>
<li>Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+bladder+dysfunction%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Diabetic bladder dysfunction: a review.</a> Urology. 123, (2019).</li>
<li>Irwin, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+survey+of+urinary+incontinence%2C+overactive+bladder%2C+and+other+lower+urinary+tract+symptoms+in+five+countries%3A+results+of+the+EPIC+study%5BTitle%5D)+AND+%22European+Urology%22%5BJournal%5D)">Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study.</a> European Urology. 50 (6), 1314(2006).</li>
<li>Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symptoms+of+interstitial+cystitis%2C+painful+bladder+syndrome+and+similar+diseases+in+women%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review.</a> The Journal of Urology. 177 (2), 450(2007).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+tract+infection+syndromes%3A+occurrence%2C+recurrence%2C+bacteriology%2C+risk+factors%2C+and+disease+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disease+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1(2014).</li>
<li>Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+cystitis+is+bladder+pain+syndrome+with+Hunner%27s+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion.</a> International Journal of Urology. 21, 79(2014).</li>
<li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+bladder%2C+cystitis+and+nerve%2Furothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+%26+Clinical%22%5BJournal%5D)">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89(2014).</li>
<li>Rosen, J. M., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+pain+from+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Urology.+21+Suppl%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of pain from urinary tract infection.</a> International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26(2014).</li>
<li>Birder, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+control+of+the+lower+urinary+tract%3A+peripheral+and+spinal+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms.</a> Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128(2010).</li>
<li>Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+rank+in+house+mice%3A+differentiation+revealed+by+ultraviolet+visualization+of+urinary+marking+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns.</a> Science. 182 (4115), 939(1973).</li>
<li>Sugino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voided+stain+on+paper+method+for+analysis+of+mouse+urination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">Voided stain on paper method for analysis of mouse urination.</a> Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548(2008).</li>
<li>Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Void+spot+assay%3A+recommendations+on+the+use+of+a+simple+micturition+assay+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).</li>
<li>Rajandram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+urothelial+barrier+function+in+a+mouse+model+of+ketamine-induced+voiding+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).</li>
<li>Ruetten, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+uropathogenic+E.+coli+UTI89+model+of+prostatic+inflammation+and+collagen+accumulation+for+use+in+studying+aberrant+collagen+production+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31(2021).</li>
<li>Wegner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Void+spot+assay+procedural+optimization+and+software+for+rapid+and+objective+quantification+of+rodent+voiding+function%2C+including+overlapping+urine+spots%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).</li>
<li>Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+noninvasive+measurement+of+cyclophosphamide-induced+changes+in+murine+voiding+frequency+and+volume%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume.</a> The Journal of Urology. 165 (2), 653(2001).</li>
<li>Dmochowski, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+outlet+obstruction%3A+etiology+and+evaluation.+Reviews+in+Urology%5BTitle%5D)+AND+%227+%28Suppl+6%29%2C+S3%E2%80%93S13%22%5BJournal%5D)">Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology.</a> 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).</li>
<li>Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+high+fat+diet+feeding+for+20+weeks+on+lower+urinary+tract+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lower+Urinary+Tract+Symptoms%22%5BJournal%5D)">Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice.</a> Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101(2013).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Void+sorcerer%3A+an+open+source%2C+open+access+framework+for+mouse+uroflowmetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170(2019).</li>
<li>Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micturition+video+thermography+in+awake%2C+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Micturition video thermography in awake, behaving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449(2020).</li>
<li>Keller, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voluntary+urination+control+by+brainstem+neurons+that+relax+the+urethral+sphincter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter.</a> Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).</li>
<li>Hou, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+control+circuit+for+context-dependent+micturition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Central control circuit for context-dependent micturition.</a> Cell. 167 (1), 73(2016).</li>
<li>Negoro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+urinary+bladder+Connexin43+and+the+circadian+clock+in+coordination+of+diurnal+micturition+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm.</a> Nature Communication. 3, (2012).</li>
<li>Montalbetti, N., Carattino, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-sensing+ion+channels+modulate+bladder+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).</li>
<li>Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+voiding+spot+assay+in+mice%3A+a+simple+method+with+complex+environmental+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+distribution+of+PIEZO1+in+the+mouse+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303(2019).</li>
<li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+modelling+of+interstitial+cystitis%2Fbladder+pain+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22International+Neurourology+Journal%22%5BJournal%5D)">Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome.</a> International Neurourology Journal. 22, (2018).</li>
<li>Okinami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+detrusor+gap+junction+communications+induce+storage+symptoms+in+bladder+inflammation%3A+a+mouse+cyclophosphamide-induced+model+of+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis.</a> PLoS One. 9 (8), (2014).</li>
<li>Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Behavior+Tracker%3A+An+economical+method+for+tracking+behavior+in+home+cages%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages.</a> Biotechniques. 63 (5), (2017).</li>
<li>Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronobiology+of+micturition%3A+putative+role+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock.</a> The Journal of Urology. 190 (3), (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La incorporación de la videomonitorización es una modificación rentable que presenta varias ventajas sobre el VSA clásico. En el VSA clásico, que se usa típicamente como un ensayo de punto final, es difícil distinguir puntos vacíos superpuestos. Esta no es una preocupación trivial, ya que los ratones tienden a orinar varias veces en la misma área cuando el ensayo se prolonga durante varias horas, generalmente en las esquinas de su jaula. Por lo tanto, la primera ventaja de RT-VSA es que el investigador puede identificar ...

El almacenamiento de orina y la micción están coordinados por un circuito central (sistema nervioso central) que recibe información sobre el estado de llenado de la vejiga a través de los nervios pélvico e hipogástrico. El urotelio, el epitelio que recubre el tracto urinario desde la pelvis renal hasta la uretra proximal, forma una barrera estrecha contra los productos de desecho metabólicos y patógenos presentes en la orina. Es un componente integral de una red sensorial, que detecta y comunica el estado de llenado de la vejiga a los tejidos subyacentes y nervios aferentes 1,2. La ruptura de la barrera urotelial, o alteraciones en las vías de mecanotransducción urotelial, puede conducir a una disfunción miccional junto con síntomas del tracto urinario inferior como frecuencia, urgencia, nicturia e incontinencia 3,4,5,6,7. Del mismo modo, se sabe que el envejecimiento, la diabetes, las infecciones del tracto urinario inferior, la cistitis intersticial y otros procesos de enfermedades que afectan la vejiga urinaria, o el circuito asociado que controla su función, causan disfunción de la vejiga 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Una mejor comprensión del comportamiento miccional normal y anormal depende del desarrollo de métodos que puedan discriminar de manera confiable entre diferentes patrones de micción.
Tradicionalmente, el comportamiento de micción voluntaria de ratones ha sido estudiado utilizando el ensayo de punto vacío (VSA), desarrollado por Desjardins y colegas 20, y ampliamente adoptado debido a su simplicidad, bajo costo y enfoque no invasivo 8,21,22,23,24. Este ensayo se realiza típicamente como un ensayo de punto final, en el que un ratón pasa una cantidad definida de tiempo en una jaula forrada por un papel de filtro, que posteriormente se analiza contando el número y evaluando el tamaño de las manchas de orina cuando el papel de filtro se coloca bajo luz ultravioleta (UV) (las manchas de orina fluorescen en estas condiciones)20. A pesar de estas muchas ventajas, el VSA tradicional presenta algunas limitaciones importantes. Debido a que los ratones a menudo orinan en las mismas áreas, los investigadores tienen que restringir la duración del ensayo a un período de tiempo relativamente corto (≤4 h)25. Incluso cuando el VSA se realiza durante períodos de tiempo más cortos, es casi imposible resolver pequeños puntos vacíos (SVS) que caen sobre grandes puntos vacíos o discriminar SVS del arrastre de orina adherida a colas o patas. También es muy difícil distinguir si las SVS son consecuencia de eventos miccionales frecuentes pero individuales (fenotipo que a menudo se observa en respuesta a la cistitis 4,26), o debido al goteo postmiccional (fenotipo asociado a la obstrucción de la salida de la vejiga 27). Además, el deseo de completar el ensayo durante las horas de trabajo, junto con las dificultades para acceder a las instalaciones de vivienda cuando se apagan las luces, a menudo limita estos ensayos al período de luz del ciclo circadiano de 24 h. Por lo tanto, estas limitaciones de tiempo impiden la evaluación del comportamiento miccional del ratón durante su fase nocturna activa, disminuyendo la capacidad de analizar genes específicos o tratamientos que se rigen por ritmos circadianos.
Para superar algunas de estas limitaciones, los investigadores han desarrollado métodos alternativos para evaluar el comportamiento miccional en tiempo real 26,28,29,30,31,32. Algunos de estos enfoques implican el uso de equipos costosos como jaulas metabólicas26,28,29, o el uso de cámaras térmicas30; Sin embargo, estos también tienen limitaciones. Por ejemplo, en las jaulas metabólicas, la orina tiende a adherirse a los cables del piso de malla y a las paredes del embudo, reduciendo la cantidad de orina que se recolecta y se mide. Por lo tanto, puede ser difícil recopilar con precisión datos sobre pequeños vacíos. Además, las jaulas metabólicas no proporcionan información sobre la distribución espacial de los eventos miccionales (es decir, micción en las esquinas frente al centro de la cámara). Dado que la radiación infrarroja de longitud de onda larga utilizada por las cámaras termográficas no penetra en los sólidos, la actividad miccional evaluada por termografía de video debe realizarse en un sistema abierto, lo que puede ser un desafío con ratones activos, ya que pueden saltar varias pulgadas en el aire. Otro sistema es el enfoque automatizado de tinción en papel (aVSOP)33, que consiste en papel de filtro enrollado que se enrolla a una velocidad constante debajo del piso de malla de alambre de una jaula para ratones. Este enfoque evita el daño del papel y la superposición de manchas de orina que ocurren en el VSA clásico, y su implementación permite al investigador realizar experimentos durante varios días. Sin embargo, no proporciona al investigador el momento preciso de los eventos de micción, y no hay capacidad para examinar el comportamiento y cómo se correlaciona con la detección. Para obtener esta información, los investigadores han incorporado la videomonitorización a los ensayos de micción, un enfoque que permite la evaluación simultánea de la actividad del ratón y los eventos de micción31,32. Un enfoque consiste en colocar un diodo emisor de luz azul (LED) y una cámara de video con un filtro de proteína de fluorescencia verde colocado debajo de la jaula experimental para visualizar los eventos de micción, y un LED infrarrojo y una cámara de video sobre la jaula para capturar la posición32 del ratón. Esta configuración se ha utilizado para monitorear el comportamiento de micción mientras se realiza la fotometría de fibra; Sin embargo, el ambiente brillantemente iluminado de este sistema requirió que los investigadores trataran a sus ratones con un agente diurético para estimular la micción. En otro diseño experimental, se colocaron cámaras gran angular por encima y por debajo de la jaula experimental para visualizar la actividad motora del ratón y los eventos de micción, respectivamente. En este caso, las manchas de orina depositadas en un papel de filtro que recubre el piso de la jaula se revelaron iluminando el papel de filtro con luces UV colocadas debajo de la jaula31. Esta configuración fue utilizada en ensayos cortos, de 4 min de duración, durante la fase ligera del día para estudiar las neuronas del tronco encefálico involucradas en el comportamiento de micción voluntaria31. No se informó la idoneidad de este sistema para su uso durante la fase oscura o por períodos de tiempo >4 min.
En este artículo, se describe un método que mejora el VSA tradicional al permitir el monitoreo de video a largo plazo del comportamiento de vaciado del mouse. Este enfoque rentable proporciona información temporal, espacial y volumétrica sobre eventos miccionales durante largos períodos de tiempo durante las fases de luz y oscuridad del día, junto con detalles relacionados con el comportamiento del ratón 3,4,34. Se proporciona información detallada para la construcción de las cámaras de vaciación, la implementación de un VSA EN TIEMPO REAL (RT-VSA) y el análisis de los datos. El RT-VSA es valioso para los investigadores que buscan comprender los mecanismos fisiológicos que controlan la función del sistema urinario, desarrollar enfoques farmacológicos para controlar la micción y definir las bases moleculares de los procesos de enfermedad que afectan el tracto urinario inferior.

<table><tbody><tr><td>1.00" X 1.00" Perfil con ranuras en T: cuatro ranuras en T abiertas &ndash; &nbsp; corte a 10 pulgadas</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>Cantidad: 20</td></tr><tr><td>1.00" X 1.00" Perfil con ranuras en T: cuatro ranuras en T abiertas &ndash; &nbsp; corte a 12 pulgadas</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>Cantidad: 6</td></tr><tr><td>1.00" X 1.00" Perfil con ranuras en T: cuatro ranuras en T abiertas &ndash; &nbsp; corte a 40 pulgadas</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>Cantidad: 4</td></tr><tr><td>1.00" X 1.00" Perfil con ranuras en T: cuatro ranuras en T abiertas &ndash; corte a 14.75 pulgadas</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>Cantidad: 12</td></tr><tr><td>1.00" X 1.00" Perfil con ranuras en T: cuatro ranuras en T abiertas &ndash; Corte a 32 pulgadas</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>Cantidad: 5</td></tr><tr><td>1/4-20 Tuerca en T Económica Deslizante Doble 80</td><td>/20</td><td>3280</td><td>Cantidad: 16</td></tr><tr><td>1/4-20 Tuerca en T Económica Deslizante Triple</td><td>80/20</td><td>3287</td><td>Cantidad: 18</td></tr><tr><td>10 & 25 Series 2 Orificios - Soporte de esquina interior ranurado de 18 mm con soporte doble</td><td>80/20</td><td>14061</td><td>Cantidad: 6</td></tr><tr><td>10 Serie 3 Orificios - Placa plana recta</td><td>80/20</td><td>4118</td><td>Cantidad: 8</td></tr><tr><td>10 Serie 5 Agujero - Placa Plana "L"</td><td>80/20</td><td>4081</td><td>Cantidad: 8</td></tr><tr><td>10 Serie 5 Agujero - Placa Plana "T"</td><td>80/20</td><td>4080</td><td>Cantidad: 8</td></tr><tr><td>10 Serie 5 Agujero - Placa Plana en T</td><td>80/20</td><td>4140</td><td>Cantidad: 2</td></tr><tr><td>Bisagra de desmontaje estándar de la serie 10 - Montaje a la derecha</td><td>80/</td><td>20 2064</td><td>Cantidad: 2</td></tr><tr><td>10 a 15 Serie 2 Orificios - Transición Lite Soporte de esquina interior</td><td>80/20</td><td>4509</td><td>Cantidad: 6</td></tr><tr><td>luces de tubo UV de 24" de largo</td><td>ADJ Products LLC</td><td>T8-F20BLB24</td><td>Cantidad: 2 bombilla de 20W &ndash; 24" Longitud de onda: 365nm</td></tr><tr><td>Lámina de espejo acrílico</td><td>Plástico Profesional</td><td>Cantidad: 1 82,5 cm x 26,5 cm</td>Lámina de espejo acrílico Plásticos profesionales Cantidad: 2 26,5 cm X 30,5 cm Lámina de espejo acrílico Plásticos profesionales Cantidad: 2 82,5 cm x 30,5 cm Policarbonato AR (resistencia a los rayos UV)80/20 65-2641 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Cantidad: 2 4,5 mm de grosor, transparente, 38,5 cm x 26,5 cm</td></tr><tr><td>Policarbonato AR (resistencia a los rayos UV)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>Cantidad: 4 4,5 mm de grosor, transparente, 38,5 cm x 21,5 cm</td></tr><tr><td>Policarbonato AR (resistente a los rayos UV)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>Cantidad: 4 4,5 mm de grosor, transparente, 26,5 cm x 21,5 cm</td></tr><tr><td>Policarbonato AR (resistencia a los rayos UV)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>Cuantía: 4 4,5 mm de grosor, transparente 37,5 cm x 23,9 cm</td></tr><tr><td>Policarbonato AR (resistencia a los rayos UV)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>Cantidad: 4 4,5 mm de grosor, transparente, 24,4 cm x 23,9 cm</td></tr><tr><td>Papel de cromatografía (papel fino)</td><td>&nbsp; Thermo Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Cosmos papel secante (papel grueso)</td><td>Blick Art Materials</td><td>10422-1005</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma</td><td>GraphPad Software</td><td>versión 9.4.0</td><td>software de gráficos y estadísticas</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>FIJI NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td></td><td>película transparente</td></tr><tr><td>Quick Time Player 10.5 software&nbsp;</td><td>Reproductor multimedia</td> <td>Apple</td><td></td></tr><tr><td>Espía de seguridad</td><td>Ben software</td><td></td> sistema <td>de software de videovigilancia</td></tr><tr><td>Cierre de extremo estándar, 1/4-20</td><td>80/20</td><td>3381</td><td>Cantidad: 80</td></tr><tr><td>Acrílico de transmisión UV</td><td>Spartech</td><td>Polycast Solacryl SUVT</td><td>Cantidad: 2 38.5 cm x 26.5 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Gel de agua: HydroGel</td><td>ClearH2O&nbsp;</td><td>&nbsp; 70-01-5022</td><td>(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)</td></tr><tr><td>Webcam</td><td>Logitech</td><td>C930e</td><td>Cantidad: 4</td></tr></tbody></table>

ensayo de punto vacío en tiempo real

Real-Time Void Spot Assay

El comportamiento miccional normal es el resultado de la función coordinada de la vejiga, la uretra y los esfínteres uretrales bajo el control adecuado del sistema nervioso. Para estudiar el comportamiento de micción voluntaria en modelos de ratón, los investigadores han desarrollado el ensayo de punto vacío (VSA), un método que mide el número y el área de manchas de orina depositadas en un papel de filtro que recubre el piso de la jaula de un animal. Aunque técnicamente simple y barato, este ensayo tiene limitaciones cuando se usa como un ensayo de punto final, incluida la falta de resolución temporal de los eventos miccionales y las dificultades para cuantificar las manchas de orina superpuestas. Para superar estas limitaciones, desarrollamos un VSA monitoreado por video, que llamamos VSA EN TIEMPO REAL (RT-VSA), y que nos permite determinar la frecuencia de micción, evaluar el volumen vaciado y los patrones de micción, y realizar mediciones durante las ventanas de tiempo de 6 h durante las fases oscura y clara del día. El método descrito en este informe se puede aplicar a una amplia variedad de estudios basados en ratones que exploran los aspectos fisiológicos y neuroconductuales de la micción voluntaria en estados de salud y enfermedad.

Comportamiento miccional de ratones picos piezo1/2 uroteliales
Durante la fase de almacenamiento del ciclo miccional, se plantea la hipótesis de que el urotelio detecta la tensión ejercida por la orina acumulada en la vejiga y transduce este estímulo mecánico en respuestas celulares como la liberación de ATP seroso 1,3. Hemos demostrado previamente que los canales PIEZO1 y PIEZO2 activados mecánicamente se exp...

Este artículo describe un nuevo método para estudiar el comportamiento de micción del ratón mediante la incorporación de la supervisión de vídeo en el ensayo convencional de micción de la micción. Este enfoque proporciona información temporal, espacial y volumétrica sobre los eventos de micción y detalles del comportamiento del mouse durante las fases de luz y oscuridad del día.

Ensayo de punto vacío en tiempo real

Normal voiding behavior is the result of the coordinated function of the bladder, the urethra, and the urethral sphincters under the proper control of the ...

El método descrito en este informe se puede utilizar para comprender los aspectos fisiológicos y neuroconductuales de la micción voluntaria en estados de salud y enfermedad. Esta técnica nos permite monitorear el comportamiento del volumen del mouse en las fases claras y oscuras del día, y proporciona información temporal, espacial y volumétrica sobre eventos de micción. Para preparar un ensayo de punto vacío en tiempo real o una cámara de grabación RT-VSA, coloque un papel de filtro delgado o grueso, dependiendo de la hora del día, en la parte inferior de la jaula de grabación RT-VSA.Encima del papel de filtro, coloque un iglú de plástico para dormir; un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml para enriquecimiento; y un plato de plástico de 60 mm x 15 mm que contenga dos o tres piezas de comida seca de ratón; y de 14 a 16 gramos de agua en forma de paquete de gel. Una vez que la cámara de grabación esté lista, coloque suavemente el mouse sobre el papel de filtro. Asegúrese de que la transferencia del ratón de la jaula de alojamiento a la jaula de grabación se produce con un estrés mínimo.Una vez que el ratón esté dentro de la jaula de grabación, coloque la tapa y cubra la parte superior de la tapa con una almohadilla azul absorbente para minimizar los reflejos directos de la luz ambiental en la superficie de la tapa de plexiglás. Encienda las luces ultravioletas en la cámara inferior. Para grabar vídeo RT-VSA desde las cámaras superior e inferior, utilice un software de grabación de videovigilancia configurado para grabar simultáneamente desde varias cámaras web o cámaras en red.Inicie la grabación presionando Cmd R en la ventana del programa. Realice grabaciones de vídeo a un fotograma por segundo. Inmediatamente después de iniciar las grabaciones, salga de la habitación y cierre la puerta suavemente.Asegúrese de que la habitación permanezca en silencio durante todo el experimento. Detenga las grabaciones presionando Cmd T.Apague las luces ultravioletas. Después de detener la grabación, el software genera automáticamente un archivo de película en formato m4v para cada cámara y lo guarda bajo el nombre de la cámara en una carpeta de destino previamente seleccionada.Verifique que dentro de la carpeta de cada cámara los experimentos estén organizados en carpetas por fecha. En cada carpeta de fecha o experimento, compruebe que hay un archivo m4v y todos los archivos jpeg individuales que corresponden a cada fotograma de película. Cree una carpeta en el escritorio con el nombre y la fecha del experimento y transfiera los archivos m4v a esta carpeta.Copie la carpeta de la película en una unidad flash para analizarla en un equipo externo. Abra un archivo de película recopilado por la cámara inferior durante la fase de luz o la cámara superior durante la fase oscura para su análisis. Después de evaluar la calidad de la película, analice los experimentos moviéndose a la ventana de tiempo correcta usando el comando de avance rápido o el control deslizante de la barra de tiempo.La actividad miccional durante la fase de luz se registra entre las 11:00 a.m. y las 5:00 p.m., y durante la fase oscura, entre la medianoche y las 6:00 a.m. Reproduzca la película en modo de avance rápido haciendo clic en el icono de avance rápido o desplácese manualmente por la película, buscando evidencia de que el mouse se está anulando. Busque la aparición repentina de manchas brillantes de orina en el papel de filtro o los cambios de comportamiento, incluido el movimiento hacia las esquinas de la jaula y un breve período de inactividad cuando el ratón está orinando. Registre la hora a la que se produce cada vacío.Como convención, el tiempo del vacío se registra a la primera señal de que se detecta la orina. Para tomar medidas del vacío, primero use la barra de desplazamiento para avanzar o retroceder en el tiempo, buscando el punto en que se ha producido la difusión máxima de la mancha de orina. Detenga la película en este punto y coloque la flecha del mouse de la computadora en el lugar bajo análisis para marcar el punto de interés en la captura de pantalla.Asigne un nombre al archivo de captura de pantalla utilizando números correlativos para tener en cuenta el orden de aparición en la película. Una vez que se hayan analizado todos los puntos vacíos, mida el área total del papel de filtro capturando una captura de pantalla y delineando el borde del papel de filtro. Calcula el área porcentual de cada una de las manchas urinarias.Transforme los valores del área porcentual en el volumen de orina para cada punto de vacío utilizando las curvas de calibración y la función interpolar en el software de gráficos. El comportamiento miccional de ratones Piezo1, 2, knockout y control hembra y macho se registró durante la fase oscura y clara del día. Durante su fase de luz inactiva, no se observaron diferencias significativas en ningún parámetro analizado para ratones knockout hembra o macho en comparación con el control.Sin embargo, en la fase oscura activa, los ratones knockout hembra y macho mostraron un fenotipo miccional alterado, caracterizado por un aumento significativo en el número y volumen total de pequeñas manchas vacías. No hubo diferencias significativas en los puntos de vacío primario o el número de PVS, el volumen promedio por PVS o el volumen total de PVS en ratones knockout hembra o macho en comparación con los ratones control. El comportamiento miccional de ratones hembra se probó en condiciones basales y después del tratamiento con ciclofosfamida.En comparación con las condiciones basales, la cantidad de liberación de orina por micción es menor después del tratamiento con ciclofosfamida y los eventos miccionales son mucho más frecuentes. Un aspecto clave para la reproducibilidad del ensayo es manipular a los animales lo más suavemente posible y mantenerlos bajo un estrés mínimo durante todo el período de prueba. Como este es un ensayo no invasivo, se pueden realizar procedimientos adicionales después, incluida la citometría y la electromiografía para evaluar las funciones del esfínter de la vejiga y la uretra externa, respectivamente.La implementación de esta técnica permitirá a los investigadores definir la contribución de vías específicas al comportamiento miccional en estados de salud y enfermedad.

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Identificación de objetivos microbiana de la inmunidad adaptativa en las enfermedades idiopáticas se puede lograr mediante el uso de la prueba de inmunoensayo enzimático.

Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

Se describe un método para la determinación cuantitativa, medida en tiempo real de ADN glicosilasa y actividades AP endonucleasas en lisados ​​de células nucleares. El ensayo proporciona tasas de actividad ADN Reparación susceptibles de análisis cinético y es adaptable para la cuantificación de la actividad del ADN en el tejido de reparación y lisados ​​tumorales o con proteínas purificadas.

Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons

Este video demuestra la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligandos, una técnica para el cribado sistemático de alto rendimiento de proteínas de unión a segundo mensajero de nucleótidos intracelulares. Esta técnica permite la unión directa de los mensajeros a la proteína diana sobreexpresada en el lisado celular, evitando la necesidad de purificación de la proteína.

Acción capilar radial diferencial del ensayo de ligando: una técnica de alto rendimiento para identificar proteínas intracelulares de unión a segundo mensajero de nucleótidos bacterianos

Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

Se desarrolló un método no etiquetados, radio-isotópico para la corrección de la polimerasa de la DNA y un ensayo de reparación del ADN mediante espectrometría de masas MALDI-TOF alta resolución y una estrategia de extensión de un solo nucleótido. El ensayo demostró ser muy específico, simple, rápido y fácil de realizar para corregir y reparar los parches menor 9 nucleótidos.

Revisión y análisis de la reparación de ADN usando análisis de extensión de un solo nucleótido y MALDI-TOF espectrometría de masa

Aquí, describimos un método para purificar enzimas pyrophosphokinase etiqueta histidina y utilizando cromatografía en capa fina de sustratos marcados radiactivamente y productos para análisis de la actividad enzimática in vitro. El ensayo de actividad de la enzima es ampliamente aplicable a la quinasa, ciclasa de nucleótidos o reacción de transferencia de fósforo cuyo mecanismo incluye la hidrólisis de nucleótidos trifosfato.

Una purificación y análisis de actividad In Vitro de una (p) ppGpp sintetasa de Clostridium difficile

Aquí, representamos un protocolo para el marcado radioeléctrico totalmente automatizado de [11C]SNAP-7941 y el análisis de la cinética en tiempo real de este PET-tracer en células de expresión y no expresión de P-gp.

Aspecto técnico de la síntesis automatizada y evaluación cinética en tiempo real de [11C]SNAP-7941

Introducimos un protocolo para medir la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral orgatípico. La estrategia experimental descrita aquí proporciona una plataforma para llevar a cabo pantallas de fármacos de rendimiento medio-alto en rodajas de tejido derivadas de tumores clínicos o de ratón en condiciones ex vivo.

Medición de la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral organotípico

Este protocolo presenta un ensayo rápido de prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) dentro de las 2,5 h mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas por células individuales del metabolismo de D2O. Este método se aplica a las bacterias en la orina o en el entorno sanguíneo completo, que es transformador para la AST fenotípica unicelular rápida en la clínica.

Pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas de la incorporación de deuterio en una sola bacteria

Se desarrolló un método no radioisotópico no marcado para evaluar la actividad de la uracilo-ADN glicosilasa utilizando la espectrometría de masas MALDI-TOF para el análisis directo de productos que contienen sitios apurínicos/apirimidínicos. El ensayo demostró ser bastante simple, específico, rápido y fácil de usar para la medición de la GLICosilasa de ADN.

Ensayo de uracilo-ADN glicosilasa mediante desorción láser asistida por matriz/análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Describimos una plataforma de inmunoensayo recientemente desarrollada basada en los principios de la biología sintética libre de células y la técnica dot-blot para la detección personalizable de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales.

Cell-free dot blot como plataforma de inmunoensayo práctica y adaptable para la detección de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales

Aprenda a realizar el ensayo de punto vacío en tiempo real para estudiar el comportamiento miccional en ratones mediante monitoreo por video. Este método proporciona datos temporales, espaciales y volumétricos sobre los eventos de micción en fases de luz y oscuridad.

Ensayo de punto vacío en tiempo real

Explorar más videos