Ensayo de punto vacío en tiempo real

El método descrito en este informe se puede utilizar para comprender los aspectos fisiológicos y neuroconductuales de la micción voluntaria en estados de salud y enfermedad. Esta técnica nos permite monitorear el comportamiento del volumen del mouse en las fases claras y oscuras del día, y proporciona información temporal, espacial y volumétrica sobre eventos de micción. Para preparar un ensayo de punto vacío en tiempo real o una cámara de grabación RT-VSA, coloque un papel de filtro delgado o grueso, dependiendo de la hora del día, en la parte inferior de la jaula de grabación RT-VSA.

Encima del papel de filtro, coloque un iglú de plástico para dormir; un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml para enriquecimiento; y un plato de plástico de 60 mm x 15 mm que contenga dos o tres piezas de comida seca de ratón; y de 14 a 16 gramos de agua en forma de paquete de gel. Una vez que la cámara de grabación esté lista, coloque suavemente el mouse sobre el papel de filtro. Asegúrese de que la transferencia del ratón de la jaula de alojamiento a la jaula de grabación se produce con un estrés mínimo.

Una vez que el ratón esté dentro de la jaula de grabación, coloque la tapa y cubra la parte superior de la tapa con una almohadilla azul absorbente para minimizar los reflejos directos de la luz ambiental en la superficie de la tapa de plexiglás. Encienda las luces ultravioletas en la cámara inferior. Para grabar vídeo RT-VSA desde las cámaras superior e inferior, utilice un software de grabación de videovigilancia configurado para grabar simultáneamente desde varias cámaras web o cámaras en red.

Inicie la grabación presionando Cmd R en la ventana del programa. Realice grabaciones de vídeo a un fotograma por segundo. Inmediatamente después de iniciar las grabaciones, salga de la habitación y cierre la puerta suavemente.

Asegúrese de que la habitación permanezca en silencio durante todo el experimento. Detenga las grabaciones presionando Cmd T.Apague las luces ultravioletas. Después de detener la grabación, el software genera automáticamente un archivo de película en formato m4v para cada cámara y lo guarda bajo el nombre de la cámara en una carpeta de destino previamente seleccionada.

Verifique que dentro de la carpeta de cada cámara los experimentos estén organizados en carpetas por fecha. En cada carpeta de fecha o experimento, compruebe que hay un archivo m4v y todos los archivos jpeg individuales que corresponden a cada fotograma de película. Cree una carpeta en el escritorio con el nombre y la fecha del experimento y transfiera los archivos m4v a esta carpeta.

Copie la carpeta de la película en una unidad flash para analizarla en un equipo externo. Abra un archivo de película recopilado por la cámara inferior durante la fase de luz o la cámara superior durante la fase oscura para su análisis. Después de evaluar la calidad de la película, analice los experimentos moviéndose a la ventana de tiempo correcta usando el comando de avance rápido o el control deslizante de la barra de tiempo.

La actividad miccional durante la fase de luz se registra entre las 11:00 a.m. y las 5:00 p.m., y durante la fase oscura, entre la medianoche y las 6:00 a.m. Reproduzca la película en modo de avance rápido haciendo clic en el icono de avance rápido o desplácese manualmente por la película, buscando evidencia de que el mouse se está anulando. Busque la aparición repentina de manchas brillantes de orina en el papel de filtro o los cambios de comportamiento, incluido el movimiento hacia las esquinas de la jaula y un breve período de inactividad cuando el ratón está orinando. Registre la hora a la que se produce cada vacío.

Como convención, el tiempo del vacío se registra a la primera señal de que se detecta la orina. Para tomar medidas del vacío, primero use la barra de desplazamiento para avanzar o retroceder en el tiempo, buscando el punto en que se ha producido la difusión máxima de la mancha de orina. Detenga la película en este punto y coloque la flecha del mouse de la computadora en el lugar bajo análisis para marcar el punto de interés en la captura de pantalla.

Asigne un nombre al archivo de captura de pantalla utilizando números correlativos para tener en cuenta el orden de aparición en la película. Una vez que se hayan analizado todos los puntos vacíos, mida el área total del papel de filtro capturando una captura de pantalla y delineando el borde del papel de filtro. Calcula el área porcentual de cada una de las manchas urinarias.

Transforme los valores del área porcentual en el volumen de orina para cada punto de vacío utilizando las curvas de calibración y la función interpolar en el software de gráficos. El comportamiento miccional de ratones Piezo1, 2, knockout y control hembra y macho se registró durante la fase oscura y clara del día. Durante su fase de luz inactiva, no se observaron diferencias significativas en ningún parámetro analizado para ratones knockout hembra o macho en comparación con el control.

Sin embargo, en la fase oscura activa, los ratones knockout hembra y macho mostraron un fenotipo miccional alterado, caracterizado por un aumento significativo en el número y volumen total de pequeñas manchas vacías. No hubo diferencias significativas en los puntos de vacío primario o el número de PVS, el volumen promedio por PVS o el volumen total de PVS en ratones knockout hembra o macho en comparación con los ratones control. El comportamiento miccional de ratones hembra se probó en condiciones basales y después del tratamiento con ciclofosfamida.

En comparación con las condiciones basales, la cantidad de liberación de orina por micción es menor después del tratamiento con ciclofosfamida y los eventos miccionales son mucho más frecuentes. Un aspecto clave para la reproducibilidad del ensayo es manipular a los animales lo más suavemente posible y mantenerlos bajo un estrés mínimo durante todo el período de prueba. Como este es un ensayo no invasivo, se pueden realizar procedimientos adicionales después, incluida la citometría y la electromiografía para evaluar las funciones del esfínter de la vejiga y la uretra externa, respectivamente.

La implementación de esta técnica permitirá a los investigadores definir la contribución de vías específicas al comportamiento miccional en estados de salud y enfermedad.