Implantación de cánula intracraneal para infusiones seriadas de células T con receptor de antígeno quimérico locorregional (CAR) en ratones

Este protocolo replica un sistema de catéter intraventricular utilizado en ensayos clínicos en curso para probar la administración regional local de terapia de células T con CAR dirigida contra tumores del sistema nervioso central. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de proporcionar múltiples dosis repetidas de terapia regional local de células T con CAR sin realizar múltiples procedimientos quirúrgicos invasivos. Este sistema podría usarse para investigar diferentes terapias en diferentes sitios de administración y, por lo tanto, puede proporcionar información sobre una gran cantidad de áreas de investigación en neurociencia.

Para comenzar, coloque el ratón anestesiado con la cabeza afeitada en la mesa de operaciones y abra suavemente la parte inferior del brazo estereotáctico con una espátula. Inserte la cánula con pinzas y asegúrela apretando el tornillo en el brazo hasta que la mitad a dos tercios de la porción de plástico blanco y cinco milímetros de la cánula sobresalgan de la parte inferior de la abertura. Inserte y asegure los dientes superiores del ratón en la barra de mordida del aparato estereotáxico.

Tire del cono de la nariz hacia adelante y apriételo, asegurándose de que el ratón inhale isoflurano. Luego, monte el mouse en el aparato estereotáxico calentado usando manguitos o barras para los oídos, evitando una presión excesiva. Desinfecte el sitio quirúrgico y haga un corte paralelo al cráneo como se describe en el manuscrito.

Use hisopos de punta de algodón para alejar la fascia. Identifique los puntos de referencia, bregma y lambda en el cráneo correspondientes a las marcas anteriores y posteriores donde se encuentran las placas craneales. Para crear una superficie para unir el acrílico, haga suavemente varias hendiduras a través del cráneo con un bisturí.

Usando el brazo estereotáxico, localice la cánula al punto de referencia de interés. Levante la punta de la cánula de uno a dos milímetros por encima de la superficie del cráneo y muévase a las coordenadas deseadas. Usando una aguja de calibre 18 o un taladro quirúrgico, haga dos orificios de tornillo en el cráneo expuesto lejos de donde entra la cánula, asegurando suficiente espacio para la cánula.

Gire el taladro a través del orificio del tornillo hasta que se adhiera al cráneo. Con un destornillador de punta plana, inserte y sujete dos tornillos en los orificios. Luego, tire suavemente del tornillo hacia arriba para asegurarse de que esté asegurado.

Para insertar una cánula, cree un agujero en el cráneo en las coordenadas identificadas usando una aguja de calibre 18 o un taladro quirúrgico. Usando el brazo estereotáctico, baje la cánula a la coordenada DV deseada. Con aproximadamente 0,3 gramos de polvo de resina acrílica y de 10 a 15 gotas de líquido en una placa de porcelana de 12 pocillos, cargue el material viscoso de color blanco preparado en una jeringa de un mililitro.

Cubra el cráneo y rellene los espacios alrededor de la cánula y el tornillo. Afloje el tornillo del brazo estereotáctico mientras el cemento sea flexible. Use suavemente una espátula para liberar la cánula del soporte en la abertura inferior y retraiga el brazo estereotáxico lejos del mouse.

Una vez que el cemento esté seco, inserte la cánula ficticia en la cánula guía y gírela en el sentido de las agujas del reloj para asegurarla firmemente. Una vez que se complete el procedimiento, devuelva el mouse a su jaula casera calentada para su recuperación. Para preparar la cánula de tratamiento, inserte su parte superior en el tubo de PKG.

Luego, llene la jeringa de tratamiento con suspensión de células T con CAR e insértela a través del otro extremo del tubo PKG, cubriendo la parte superior de la cánula de tratamiento. Después de anestesiar el ratón, fije la cánula guía en la base con fórceps. Desenrosque y retire la cánula ficticia, permitiendo el acceso a la cánula guía.

Infunda las células T con CAR durante un minuto y mantenga la cánula de tratamiento en su lugar durante un minuto adicional. Después de quitar la cánula de tratamiento, vuelva a atornillar una cánula ficticia con fuerza. Luego, administre meloxicam por vía subcutánea para controlar el dolor.

La terapia de células T con CAR dirigida a GPC2 indujo una regresión tumoral significativa en el meduloblastoma y una supervivencia significativamente prolongada en el modelo de glioma talámico difuso de línea media. Al insertar la cánula guía en una ubicación intratumoral, es importante comprender que las coordenadas dorsal-ventrales pueden ser más superficiales que la inyección tumoral para tener en cuenta las longitudes de proyección de la cánula ficticia y de tratamiento.