Name: Evaluación in vitro e in vivo de compuestos biológicamente activos fotocontrolados: posibles candidatos a fármacos para la fotofarmacología del cáncer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Aprende a evaluar péptidos anticancerígenos fotoconmutables mediante ensayos de citotoxicidad en cultivos 2D y 3D, fotoisomerización e imagen fluorescente automatizada. Este protocolo establece métodos para la investigación preclínica en fotofarmacología del cáncer.

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Los autores reconocen la financiación de la UE por parte del programa H2020-MSCA-RISE a través de los proyectos PELICO (#690973) y ALISE (#101007256). Este trabajo fue apoyado por el DFG-GRK 2039 (SA, TS y ASU), el programa NACIP de la Sociedad Helmholtz (SA y ASU) y el VIP + de la BMBF (OB y ASU). Reconocemos al Dr. Serhii Koniev, del Instituto de Tecnología de Karlsruhe, quien sintetizó el compuesto LMB002, lo purificó y amablemente proporcionó el compuesto para el estudio. Los autores también agradecieron a Chupryna Maksym, quien filmó y compiló el video en Ucrania, y a todos los valientes defensores de Ucrania que hicieron posible el trabajo experimental, la escritura y la filmación de esta publicación.

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</ol>

IVK, OB, SA y ASU son inventores de la familia de patentes emitidas: "Peptidomimetics possessing photocontrolled biological activity" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) con licencia de Lumobiotics GmbH. IVK, OB, TS y SA son fundadores y accionistas de Lumobiotics GmbH. IVK es asesor científico, HK, TM, IP y PB son empleados de Enamine LLC. Los autores no tienen otras afiliaciones relevantes o participación financiera con ninguna organización o entidad con un interés financiero o conflicto financiero con el tema o los materiales discutidos en la publicación, aparte de los divulgados.

Los compuestos fotocontrolados no tienen precedentes en el desarrollo de fármacos; sin embargo, no se han establecido métodos para su evaluación preclínica y clínica. El análogo de monoterapia más cercano, la terapia fotodinámica (TFD), es la modalidad de tratamiento de uso clínico adoptada por muchos países contra el cáncer y está en desarrollo para otras indicaciones19,20. Similar a la fotofarmacología, la TFD también se basa en el uso de la luz para activar la sustancia bioactiva (oxígeno singlete). Por lo tanto, algunos métodos experimentales utilizados para estudios preclínicos y clínicos en TFD pueden adoptarse para la fotofarmacología. Por ejemplo, las fuentes de luz, los enfoques de suministro de luz y los dispositivos médicos están bien desarrollados y aprobados para PDT; Se pueden utilizar directamente para la evaluación de fármacos fotocontrolados. Sin embargo, la TFD y la fotofarmacología tienen muchas distinciones entre sí4, lo que justifica la necesidad de establecer métodos específicos para esta última.
En primer lugar, la sustancia no activada en la TFD (oxígeno) siempre está presente en los tejidos vivos en concentraciones no tóxicas. Por el contrario, los compuestos biológicamente activos fotocontrolados no activados pueden tener actividad residual y toxicidad no deseada. Por lo tanto, los fármacos fotofarmacología ideales deben haber minimizado la actividad biológica en su forma administrada y deben ser altamente activos en su forma generada por la luz, la "ventana fototerapéutica"21 debe ser lo más grande posible. Encontrar el golpe y realizar la optimización de golpe a plomo requiere la identificación de compuestos adecuados y la selección de bibliotecas relativamente grandes, ya en las primeras etapas del desarrollo de fármacos. Aquí, propusimos una microscopía fluorescente confocal automatizada de alto rendimiento para identificar compuestos de fotoconmutación eficientes.
El método elegido de evaluación de citotoxicidad permite una fácil implementación del requisito más crítico: el mantenimiento del PSS o la estabilidad del fotoisómero sensible a la luz visible. Esto se debe a que, tras su implementación, la exposición a la luz se minimiza. Por lo tanto, si se seleccionan métodos alternativos, se deben preferir los automatizados. Este enfoque es confiable e informativo. El uso de cultivos celulares 3D (esferoides) en esta etapa proporciona una comprensión holística de la respuesta de la célula al tratamiento en un microambiente similar a un tejido más realista. Además, se pueden obtener valiosos conocimientos sobre el mecanismo de acción de los compuestos utilizando la microscopía como método directo. La microscopía fluorescente confocal con protocolo de tinción adecuado permite la evaluación visual de la morfología de las células y esferoides; También se pueden detectar detalles importantes sobre la muerte celular y los cambios dentro de las células.
En segundo lugar, la aplicación de luz requiere una elección cuidadosa de la dosis de luz. En la TFD, la sobredosis leve es extremadamente dañina para los tejidos22. La terapia fotofarmacológica puede ser ventajosa bajo irradiación excesiva de luz. El límite superior del principio activado se define por la dosis administrada del principio no activado y su farmacocinética. Sin embargo, la dosis de luz sigue siendo un problema en fotofarmacología. Se debe tener cuidado para garantizar que la densidad de potencia de irradiación y el tiempo de exposición no sean inferiores a los requisitos para la terapia. En principio, la generación de la sustancia activada puede controlarse in vivo. Sin embargo, por razones bioéticas, propusimos un experimento con un tejido modelo (carne picada fresca) mezclado con el compuesto no activado15. Este experimento es simple y se puede modificar para usar diferentes fuentes de luz. También se puede adaptar para la estimación fotofísica de la dosis de luz y la medición de influencias térmicas. Una vez más, mediante el uso de tejidos modelo, la exposición a la luz es posible minimizar, en comparación, por ejemplo, con la determinación más precisa de la eficiencia de fotoconmutación en las condiciones in vivo , una alternativa que siempre puede ser interesante considerar.
Finalmente, los compuestos que demuestran características superiores en las pantallas de toxicidad in vitro y están fotoconmutando eficientemente al menos 1-1.5 cm de profundidad en el tejido modelo se pueden seleccionar para estudios in vivo costosos, laboriosos y largos. En este protocolo, utilizamos la misma línea celular (LLC) que en la evaluación in vitro para generar el modelo de cáncer de aloinjerto. La dinámica del crecimiento tumoral, la mortalidad y el recuento de metástasis son los parámetros más adecuados para evaluar la eficacia anticancerosa. En comparación con la quimioterapia convencional, se aplica un factor adicional en el tratamiento fotofarmacológico: la luz. Por lo tanto, se necesitan dos grupos de animales de control: uno que reciba solo el vehículo y el otro que reciba el vehículo y la irradiación. Esta configuración permite la evaluación del impacto de la luz en los parámetros medidos. En nuestro experimento, los animales de los dos grupos experimentales recibieron el compuesto no activado, y los tumores de los ratones en un grupo fueron irradiados. El régimen de irradiación fue idéntico para los grupos control y tratamiento. La comparación con la quimioterapia de referencia no es necesaria en esta etapa porque el objetivo principal del experimento es demostrar el efecto combinado de la aplicación de luz y compuesto. Los compuestos de mejor rendimiento que exhiben este efecto pueden seleccionarse para un estudio adicional sobre su toxicidad in vivo y la comparación con puntos de referencia para tomar decisiones importantes sobre su desarrollo. Técnicamente, el experimento in vivo que describimos se puede adaptar fácilmente a estudios farmacocinéticos o farmacodinámicos, por ejemplo, de un compuesto que ya está seleccionado como líder del fármaco.

Los compuestos biológicamente activos fotocontrolados han surgido en las últimas décadas como un componente prometedor de quimioterapias seguras para enfermedades humanas y para erradicar específicamente tumores sólidos malignos1. Estos compuestos contienen fragmentos reversiblemente fotoisorizables (fotointerruptores moleculares) y pueden alternar entre fotoisómeros inactivos y activos tras la irradiación con luz de diferentes longitudes de onda.
En comparación con sus análogos no fotocontrolables, los medicamentos fotocontrolados pueden ser más seguros porque pueden introducirse sistémicamente en el cuerpo del paciente en formas menos activas y esencialmente no tóxicas, y luego se activan con luz solo cuando es necesario, como en tumores, úlceras y heridas. Aunque se pueden encontrar múltiples demostraciones emocionantes de tales prototipos de fármacos moleculares en documentos académicos recientes 2,3,4,5,6,7, el campo de la fotofarmacología clínica, una aplicación de combinaciones aprobadas de medicamentos / dispositivos médicos / enfermedades, no existe. La fotofarmacología aún se encuentra en la etapa de descubrimiento de fármacos, y se desconocen los estudios preclínicos sistemáticos.
Recientemente demostramos la ventaja de seguridad in vivo para algunos péptidos anticancerígenos fotocontrolados, a saber, los análogos del antibiótico peptídico gramicidina S8. Estos derivados fotocontrolados contienen un fotointerruptor de diarileteno (DAE), que sufre transformaciones fotoinducidas reversibles entre las llamadas fotoformas "anillo abierto" generadas por luz roja y "anillo cerrado" generadas por UV (ilustrado en la Figura 1 para uno de los derivados, el compuesto LMB002).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig01.jpg"> Figura 1: Péptido citotóxico fotocontrolado LMB002 y su fotoisomerización. El fragmento de diarileteno se muestra en rojo. Abreviatura: DAE = diarylethene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La búsqueda de aciertos y la realización de la optimización de hit-to-lead a menudo requieren un cribado in vitro e in vivo de bibliotecas de compuestos apropiadas 9,10. Aquí, demostramos una metodología adecuada para el cribado sistemático de alto rendimiento de la citotoxicidad de compuestos fotocontrolados. También determinamos la eficiencia de fotoisomerización, estimamos la dosis de luz en tejidos modelo y evaluamos la eficacia in vivo de los candidatos de mejor rendimiento. El enfoque cumple con las consideraciones de bioética y cuidado de los animales.
En este trabajo, los métodos preclínicos tradicionales se modifican para evitar la fotoisomerización no controlada de los compuestos probados. El objetivo general de aplicar estos métodos modificados en este documento es desarrollar una estrategia general que sea directa y rápida y que produzca datos estadísticamente significativos para comparar de manera confiable las actividades in vitro y racionalizar las pruebas de eficacia in vivo de compuestos fotoconmutables para la identificación y el desarrollo posterior.
La estrategia consta de tres pasos consecutivos. El primer paso implica la determinación de IC 50 (viabilidad celular aparente del50 %) en diluciones seriadas para las fotoformas activas e inactivas de compuestos biológicamente activos fotocontrolados seleccionados utilizando cultivos celulares bidimensionales (2D, monocapa) y tridimensionales (3D, esferoides) y microscopía de fluorescencia automatizada confocal de alto rendimiento. Las ventanas fototerapéuticas se comparan con respecto a la diferencia IC50 entre las dos fotoformas, y se seleccionan los candidatos con mejor rendimiento. No existe ninguna ventaja específica en la evaluación de la toxicidad por microscopía automatizada y otras plataformas de cribado de citotoxicidad (ensayos)11; Los modelos tumorales basados en células más complejos12 podrían implementarse fácilmente en esta etapa.
Para los compuestos seleccionados en el paso 1, el segundo paso es estimar de manera realista su eficiencia de fotoconmutación dentro de los tejidos en función de la profundidad de la superficie del tejido irradiado cuantificando la eficiencia de fotoconmutación de las fotoformas menos activas en un sustituto tisular utilizando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) detectada por UV de extractos de muestras irradiadas. In vivo , se podría estudiar la eficiencia del fotocambio, pero proponemos utilizar un sustituto de tejido simple: carne de cerdo picada. Hemos probado la validez de este enfoque. Medimos la conversión de nuestros compuestos fotoconmutables in vivo en un modelo de cáncer de ratones y observamos aproximadamente la misma fotoconversión a una profundidad medida en experimentos previos con ratones8. Se podría utilizar cualquier tejido artificial alternativo adecuado13, tejido/órgano bioimpreso en 3D14, materiales de biopsia u otro material animal exento. Sin embargo, esta configuración es un buen compromiso, ya que es económica, rápida y ética.
El tercer paso es la determinación de la eficacia anticancerígena in vivo en un modelo de cáncer murino. Para este experimento se seleccionan los compuestos que demuestran características superiores en los experimentos in vitro y fotoconmutación eficiente a una profundidad de al menos 1-1.5 cm en los tejidos modelo.
Este protocolo se puede aplicar a compuestos que poseen diferentes tipos de fotointerruptores, siempre que sus fotoformas (o sus estados fotoestacionarios, PSS) sean estables durante un tiempo razonable (unos pocos días o más). A modo de ilustración, se utiliza un LMB002 derivado de DAE descrito anteriormente15. Las fotoformas LMB002 son térmicamente estables y pueden almacenarse a -20 °C durante al menos un año sin una degradación sustancial. Las células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) se eligen para esta demostración in vitro e in vivo, pero no se imponen restricciones en el tipo de célula. Las células LLC son adherentes, fácilmente cultivables en 3D y utilizadas para generar tumoroides (como se describe en la referencia16). In vivo Las células LLC se utilizan para modelar procesos metastásicos y pueden generar fácilmente tumores sólidos en ratones inmunocompetentes después de la inyección subcutánea. Esta metodología in vivo puede ser aplicada universalmente a otros modelos de cáncer17,18. A continuación se describe la aplicación detallada de esta estrategia.

<table><tbody><tr><td>Sistema de LC capilar de la serie 1100</td><td>de Agilent ALSI-Chrom (distribuidor de Agilent)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Línea celular de carcinoma de pulmón de Lewis</td><td>ECACC</td><td>90020104</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6NCrl ratones, hembras, endogámicas</td><td>Charles River</td><td>Código de cepa: 027</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture, incubadora de CO2</td><td>Esco Micro</td><td>CCL-170B</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matriz de membrana basal</td><td>Merck</td><td>CLS354234</td><td></td></tr><tr><td>Corning, microplacas esferoides de 384 pocillos</td><td>Merck</td><td>CLS3830</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Merck</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600044</td><td></td></tr><tr><td>Gramicidin S</td><td>Lumobióticos</td><td></td><td>Síntesis personalizada</td></tr><tr><td>HyClone, DMEM/glucosa alta</td><td>Cytiva</td><td>SH30003.04</td><td></td></tr><tr><td>IN Cell Analyzer 6500HS, sistema de imagen</td><td>Cytiva</td><td>29240358</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia de isoflurano</td><td>ASA</td><td>S/N ASA 1305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, solución de 200 mM</td><td>Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>LIKA-surgeon, láser</td> <td>para cirugía de diodoFotonika</td><td></td> plus-LMB002 <td></td></tr><tr><td></td><td>Lumobiotics</td><td></td><td>Síntesis personalizada</td></tr><tr><td>Penicilina&ndash; Estreptomicina, estabilizada en solución</td><td>Merck</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate, placas de 96 pocillos</td><td>Fotómetro de 6055302</td><td></td><td></td>PerkinElmer</tr><tr><td>PCE-LED 20</td><td>Instrumentos</td><td>PCE-LED 20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, yoduro de propidio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J66764-MC</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano, solución al 0,4%</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&ndash; EDTA, 10 x solución</td><td>Merck</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz Matraces de cultivo celular con tapones ventilados, 75 cm2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200263</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz, filtros de tapa de botella, PES, 0.22 &mu; m</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-360882</td><td></td></tr><tr><td>Vydac 218TP, C18 Columna de HPLC (4,6 mm y veces; 250 mm, 5 y micro; m)</td><td>Altmann Analytik (distribuidor de Avantor)</td><td>GR5103827</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación in vitro e in vivo de compuestos biológicamente activos fotocontrolados: posibles candidatos a fármacos para la fotofarmacología del cáncer

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

Los compuestos fotocontrolados y biológicamente activos son una clase emergente de candidatos a fármacos "inteligentes". Proporcionan seguridad adicional en la quimioterapia sistémica debido a su activación espaciotemporal precisa al dirigir una luz benigna no ionizable a una ubicación específica dentro del cuerpo del paciente. Este artículo presenta un conjunto de métodos para evaluar la potencia in vitro y la eficiencia ex vivo de la fotoactivación de compuestos fotocontrolados biológicamente activos, así como la eficacia in vivo en las primeras etapas del desarrollo de fármacos. La metodología se aplica a péptidos citotóxicos anticancerosos, a saber, los análogos que contienen diarileteno de un antibiótico conocido, la gramicidina S. Los experimentos se realizan utilizando cultivos celulares 2D (células adherentes) y 3D (esferoides) de una línea celular de cáncer (carcinoma de pulmón de Lewis, LLC), sustitutos de tejido vivo (carne picada de cerdo) y un modelo de cáncer de aloinjerto (LLC subcutánea) en ratones inmunocompetentes. La selección de los compuestos más efectivos y la estimación de ventanas fototerapéuticas realistas se realizan mediante microscopía de fluorescencia automatizada. La eficiencia de fotoactivación en diferentes regímenes de iluminación se determina a diferentes profundidades en un tejido modelo, y la dosis óptima de luz se aplica en el experimento terapéutico final in vivo .

En este trabajo, se realizaron experimentos de células 2D y 3D para determinar el IC50 para las formas de LMB002 "anillo cerrado" y "anillo abierto" (ver Figura 1) en diferentes momentos de incubación. Estos valores se compararon con los obtenidos para el péptido prototipo, gramicidina S (utilizado como control positivo). En la Figura 5 se muestra un conjunto típico de imágenes de la incubación en cultivo de LLC cultivado en 2D después de la tinción. La cotinción con Hoechst 33342 (azul) y yoduro de propidio (rojo) que resulta en diferentes tonos de púrpura en una fracción mayor de células en el caso del tratamiento con forma "anillo abierto" en comparación con "anillo cerrado" indica una diferencia notable en la citotoxicidad entre dos formas que pueden cuantificarse fácilmente. El ejemplo demostrado de un experimento exitoso se basa en los datos recopilados utilizando el formato de placa de 96 pocillos, donde se agregaron las variantes peptídicas a concentraciones variables, como se muestra en la Figura 2. Se pueden adquirir datos similares con placas de 384 pocillos y de alta densidad. Sin embargo, dado que se reducen los volúmenes por pozo, los errores técnicos y sistemáticos y, como resultado, la precisión de la determinación IC50 disminuirán con el aumento de la densidad del pozo.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig05.jpg"> Figura 5: Imágenes representativas del ensayo de citotoxicidad en el LLC monocapa. Las células se tiñeron con Hoechst 33342 (azul) y yoduro de propidio (rojo). Los tiempos mostrados: 10 min, 60 min, 24 h y 72 h son tiempos de incubación con compuestos. Barras de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La fotoconversión de LMB002 por irradiación de luz láser en un tejido modelo - carne picada fresca de cerdo - se determinó utilizando una muestra compuesta de carne picada mezclada con LMB002 forma "anillo cerrado" (inactivo) disuelta en PBS y midiendo la conversión de esta forma inactiva a la forma LMB002 "anillo abierto" (activado) en la dirección de propagación de la radiación. La muestra se colocó en una jeringa y se irradió desde un lado con un haz plano de radiación láser durante el tiempo de exposición de ~ 10 min (generalmente utilizado en experimentos in vivo ), como se muestra en la Figura 3. Después de la exposición, el cilindro de muestra se dividió en partes presionando el pistón de la jeringa y cortando las rodajas de la misma altura con un bisturí. La concentración de LMB002 "anillo abierto" en los extractos de los cortes se determinó mediante RP HPLC.
La Figura 6 ilustra las curvas dosis-efecto que la Figura 6A-D obtuvo del análisis de datos. Para identificar el porcentaje de células muertas con co-tinción nuclear de colorantes Hoechst 33342 y PI, utilizamos una herramienta clasificadora incorporada que establece umbrales numéricos en parámetros medidos seleccionados para dividir todos los recuentos de células en varias categorías. Por ejemplo, cuando la señal del canal rojo (yoduro de propidio) en el control estaba en el umbral (aproximadamente 110-130 unidades), las células podrían clasificarse como PI-positivas, consideradas como muertas, o PI-negativas, consideradas como no afectadas por los compuestos. Para LMB002, se pueden observar dependencias sigmoidales del porcentaje de células positivas para yoduro de propidio en la concentración del compuesto. A partir de estos datos, se pueden determinar los valores de IC50.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig06.jpg"> Figura 6: Análisis de citotoxicidad en cultivo 2D. Los ajustes sigmoides se obtuvieron en el cultivo LLC para (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 h y (D) intervalos de tiempo de 72 h tomados para la incubación con compuestos. El ajuste permite la determinación precisa de los valores de IC50 (no se muestra). Las barras de error son SEM. Abreviaturas: LLC = carcinoma de pulmón de Lewis; IP = yoduro de propidio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Teniendo en cuenta los valores obtenidos deIC 50 , podemos concluir que la toxicidad de los tres compuestos aumentó con el tiempo de incubación. Nuestro experimento reveló que la forma "anillo-abierta" de LMB002 es aproximadamente un paso de dilución menos tóxica que el péptido prototipo, gramicidina S. Mientras que la forma "anillo cerrado" demuestra tres o cuatro pasos de dilución menor toxicidad, que aumenta con el tiempo de incubación. La diferencia entre los dos pasos de dilución no se ve afectada por el aumento en el tiempo de incubación y puede usarse numéricamente como una ventana fototerapéutica determinada experimentalmente6 para la comparación con otros compuestos en un posible cribado de biblioteca. El valor de IC50 para la gramicidina S se estableció como punto de referencia para corregir errores experimentales o salidas diferenciales en réplicas biológicas.
Los experimentos de células 3D produjeron el mismo tipo de datos sin procesar: las imágenes esferoides de una sola célula resueltas por pozo. La inclusión de calceína como tercer colorante de tinción permite la cuantificación de la fracción de células metabólicamente activas (observada en el canal verde). Mediante el uso de placas de 384 pocillos, el aumento del número de réplicas técnicas, la exclusión de los puntos de tiempo de coincubación redundantes y el cambio del pliegue de dilución, pudimos comparar directamente varios compuestos en una sola ejecución de prueba (utilizando una sola placa) como se ilustra en el mapa de placas de la Figura 7.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig07.jpg"> Figura 7: Mapa de placas para el experimento de cultivo 3D con dos compuestos. Se indican los códigos de color para los compuestos y el control. Los números en los pozos son concentraciones en μM. 10 min, 24 h y 72 h son tiempos de incubación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La Figura 8 muestra las imágenes de réplicas técnicas seleccionadas de esferoides LLC cultivados a una densidad de 1 esferoide/pocillo en presencia de compuestos probados y esferoides de control capturados después de la tinción.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig08.jpg"> Figura 8: Imágenes representativas del ensayo de citotoxicidad de cultivo 3D. Las imágenes muestran esferoides LLC de 48 h de edad teñidos con Hoechst 33342 (azul), calceína AM (verde) y yoduro de propidio (rojo) después de 10 min, 24 h y 72 h de co-incubación con fotoformas LMB002 y gramicidina S. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Usando el software del instrumento, las curvas dosis-efecto, como las del experimento 2D, se obtuvieron de las pilas de imágenes apiladas en z (Figura 9A). Además, los esferoides compactos y no deformados en los cultivos 3D podrían caracterizarse por el diámetro total del esferoide (Figura 9B). También se observó que el diámetro total del esferoide varía con la concentración del compuesto.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig09.jpg"> Figura 9: Evaluación de citotoxicidad con cultivos 3D. (A) Curvas de ajuste de citotoxicidad dependientes de la concentración y (B) diagramas de diámetro de esferoide dependientes de la concentración obtenidas en los cultivos 3D de LLC co-incubados con gramicidina S durante 10 min, 24 h y 72 h y capturados antes de la tinción. Las barras de error son SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El experimento para el Paso 2 permite la determinación de las concentraciones de LMB002 en ambas fotoformas mediante el uso de cromatografía líquida de alta resolución detectada por UV. La eficiencia de la fotoconversión en tejidos modelo se evaluó y cuantificó fácilmente utilizando esta configuración (Figura 3). Los datos se obtuvieron del análisis cuantitativo de los cromatogramas de los extractos de la muestra. En estos experimentos de prueba, los cromatogramas LMB002 se detectaron espectroscópicamente a 270 nm y 570 nm. A 270 nm, se observaron muchas señales adicionales y se atribuyeron a los compuestos co-extraídos del tejido modelo (verificado a partir del extracto de control sin el compuesto). Ambas fotoformas fueron suficientemente diferentes en tiempos de retención y absorbancia. Sin embargo, la señal LMB002 "anillo abierto" estaba separada de estas señales de fondo (ver un cromatograma representativo en la Figura 10A). Por lo tanto, esta señal se puede integrar sin problemas. A 570 nm, los cromatogramas contenían sólo la señal de forma LMB002 "anillo cerrado" (Figura 10B). Aquí, realizamos la determinación de la concentración utilizando RP HPLC. Sin embargo, se podría lograr una precisión aún mayor y límites de detección más bajos utilizando LC / MS como método analítico.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig10.jpg"> Figura 10: Cromatogramas representativos de LMB002 extraídos de tejidos modelo. (A) Muestra a 2 mm de la superficie irradiada, registrada a 270 nm (la forma LMB002 "anillo abierto" está integrada); (B) muestra a 38 mm de la superficie irradiada, registrada a 570 nm (el pico de LMB002 "anillo cerrado" está integrado). Los valores de tiempo de retención (indicados) confirmaron adicionalmente la identidad del compuesto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los datos obtenidos después de integrar las señales correspondientes de todas las muestras recogidas se utilizaron para construir los gráficos de concentración-profundidad, como se muestra en la Figura 11. Sobre la base de estos gráficos, se evaluó fácilmente la eficiencia de la fotoconversión a diferentes profundidades del tejido modelo. Confirma que nuestra fuente de luz roja induce la fotoconversión LMB002 "cerrada con anillo" a una profundidad de hasta 1 c, en el sustituto del tejido, carne picada (a aproximadamente 103 mW / cm2).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig11.jpg"> Figura 11: Evaluación de la eficiencia de fotoconversión. Concentración (A, mg/kg) de LMB002 "anillo cerrado" (no activado, puntos azules) y formas "anillo abierto" (activado, puntos naranjas) a diferentes distancias de la superficie irradiada del tejido modelo (L, mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los resultados del experimento in vivo - Paso 3 de nuestra metodología realizada de acuerdo con el esquema presentado en la Figura 4 - fueron representados por gráficos que muestran el crecimiento tumoral en función del tiempo (Figura 12) y las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (Figura 13).
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig12.jpg"> Figura 12: Dinámica de crecimiento tumoral en animales. Animales tratados con LMB002 en comparación con los animales tratados con vehículo (modelo de aloinjerto LLC subcutáneo en ratones C57BL/6NCrl, dosis compuesta 7 mg/kg, IV, incubación de 2 h 40 min, luego irradiación a 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig12large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig13.jpg"> Figura 13: Curvas de mortalidad de los animales. Animales tratados con LMB002 en comparación con los animales tratados con vehículo (modelo de aloinjerto LLC subcutáneo en ratones C57BL/6NCrl, dosis compuesta 7 mg/kg, IV, incubación de 2 h 40 min, luego irradiación a 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig13large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo presenta un conjunto de experimentos adoptados para la evaluación de péptidos anticancerígenos fotoconmutables, que pueden ser utilizados en el cribado preclínico de dichos compuestos. Esto incluye la evaluación de citotoxicidad en cultivos celulares 2D y 3D, la evaluación de la eficiencia de fotoisomerización ex vivo (tejido modelo) y la eficacia in vivo .

Evaluación in vitro e in vivo de compuestos biológicamente activos fotocontrolados: posibles candidatos a fármacos para la fotofarmacología del cáncer

Photocontrolled, biologically active compounds are an emerging class of &#34;smart&#34; drug candidates. They provide additional safety in systemic ...

Los compuestos fotocontrolados biológicamente activos contienen fragmentos reversiblemente fotoisorizables, fotointerruptores en sus moléculas. Los compuestos son péptidos cíclicos modificados por un fragmento de diarileteno que sufre transformaciones electrocíclicas reversibles inducidas por la luz. Pueden fotocambiar, es decir, alternar entre una forma biológicamente inactiva generada por UV y una forma biológicamente activa generada por luz roja.Se cree que los medicamentos fotoconmutables son más seguros que los medicamentos no fotoconmutables. Esto se debe a que puede administrar una forma no tóxica y desactivada al cuerpo humano y activarla localmente con luz solo donde la necesite, que es, por ejemplo, tumores, sinfines o heridas. No existen métodos o protocolos estándar para el desarrollo preclínico o clínico de tales medicamentos fotofarmacología, por lo que aquí queremos mostrarle experimentos que pueden usarse para esta investigación preclínica temprana.Kateryna Horbatok y Tetiana Makhnii demostrarán los procedimientos. El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Comisión de Bioética de la Empresa Bienta. Comience preparando los búferes utilizando procedimientos estándar.Alternativamente, utilice soluciones disponibles comercialmente. Preparar soluciones stock de compuestos. Para cada compuesto, pesar dos lotes de 5,12 miligramos del compuesto en la fotoforma cerrada con anillo en dos tubos Eppendorf de 1,5 mililitros, uno con paredes transparentes y otro con paredes negras no transparentes.Como control positivo, pesar 2,28 miligramos del péptido padre, no fotocontrolado, en un tubo adicional. Agregue 100 microlitros de DMSO puro a cada muestra y vórtice durante 30 segundos. Fotoisomerizar la solución madre en el tubo de paredes transparentes irradiando la solución con un láser de 650 nanómetros, densidad de potencia de luz de 6 vatios por centímetro cuadrado, con vórtice para garantizar la mezcla.Continúe hasta que el color cambie de púrpura oscuro a marrón claro. Proteger de la luz con papel de aluminio. Semilla de 5, 000 a 10, 000 células por pocillo.Utilizamos alrededor de 8, 000 células de carcinoma de pulmón de Lewis en 200 microlitros de DMEM en los 60 pocillos centrales de una placa estéril de 96 pocillos con un fondo transparente y paredes negras no transparentes. Llene los 36 pozos restantes con DMEM puro. Incubar las placas a 37 grados centígrados en una atmósfera de 5% de CO2 durante la noche.Al día siguiente, prepare diluciones seriadas de compuestos y el control positivo en placas transparentes en autoclave de polipropileno. Comience con las existencias en DMSO y diluya con DMEM, pero no exceda el 1% de volumen de DMSO en la concentración final más alta. Para evitar la fotoisomerización incontrolada de los compuestos estudiados, apague las luces del gabinete estéril.Transfiera 100 microlitros de las diluciones a 56 pocillos con 100 microlitros de DMEM previamente agregado para alcanzar la concentración final requerida de los compuestos en los pozos, típicamente dentro del rango de cinco a 150 micromolares. A continuación, agregue 100 microlitros de DMEM a cuatro pocillos, que sirven como control negativo. Cubra las placas con papel de aluminio o una cubierta de plástico no transparente para evitar el fotocambio incontrolado.Coloque las placas en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados durante el tiempo de incubación elegido. Después de las incubaciones, agregue 50 microlitros de solución de tinción por pocillo a las placas. Utilice Hoechst 33342 de cinco micromolares y yoduro de propidio de un micromolar como soluciones de tinción finales para este experimento.Incubar de nuevo a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Realice imágenes de fluorescencia automatizadas utilizando una lente objetiva de aumento de 20X. Las operaciones de laboratorio para esta parte del método son idénticas a las descritas para el experimento 2D: preparación del cultivo celular, incubación con los compuestos probados e imágenes.Sin embargo, en este caso, las células se preparan como esferoides compactos y maduros en una placa de fondo en U de adhesión ultra baja de 384 pocillos con paredes negras no transparentes. El uso de una placa de este tamaño permite comparar dos compuestos en un experimento. En este experimento, utilizamos además calceína AM como un tercer componente de la solución de tinción multicolor.Las imágenes obtenidas de los experimentos 2D y 3D se analizan utilizando el software de análisis automatizado de imágenes de los instrumentos. Las células costadas con colorantes de yoduro de Hoechst y propidio se consideran necróticamente muertas, y su fracción en función de la concentración se utiliza para calcular el valor de IC50. Montar el tren óptico para la irradiación de la muestra.Consiste en un cable óptico de la fuente de luz láser, una lente con una distancia focal variable, una jeringa con una cubierta no transparente y un extremo de corte plano. Todas las operaciones posteriores deben realizarse en una habitación oscura con una iluminación mínima en el lugar de trabajo. Preparar una muestra de tejido modelo cargada con los compuestos fotoformales inactivos.En una carrera típica, cinco gramos de carne de cerdo fresca picada se mezclan mecánicamente con la solución PBS del compuesto para alcanzar la concentración final de 50 miligramos por kilogramo. Llene la jeringa con la muestra cargada. Irradiar la muestra en el tren óptico para la exposición requerida y el tiempo de dosificación de luz.Después de la exposición, haga rodajas de cuatro milímetros de espesor de la muestra empujando la masa fuera de la jeringa con el pistón y cortándola con un bisturí. Pese y extraiga el compuesto con un acetonitrilo, agua, mezcla de TFA, 70% de acetonitrilo y 01% de ácido trifluoroacético en un tubo de Eppendorf de 1,5 mililitros. Centrifugar a 20XG durante 30 minutos dos veces para eliminar el material insoluble y recoger el sobrenadante.Grabe cromatogramas detectados UV con una detección de 570 nanómetros de su forma cerrada y una detección de 270 nanómetros de la forma abierta en anillo. Utilice las muestras de control no irradiadas e irradiadas preparadas de manera similar a las soluciones madre en los experimentos celulares para determinar los tiempos de retención específicos y calibrar el método. Repita el experimento tres veces y trace el porcentaje normalizado de cada fotoforma en la gráfica, porcentaje versus distancia desde la superficie del tejido irradiado.En el día cero, inocular los ratones C57 negros 6 hembras adultas que pesan aproximadamente 20 gramos cada uno por vía subcutánea con una suspensión de alrededor de medio millón de células de carcinoma de pulmón de Lewis en aproximadamente 100 microlitros de DMEM y mezcla de Matrigel en la pata trasera derecha. Este procedimiento se realiza bajo sedación con isoflurano al 5%. Los animales están listos para el tratamiento en los días cinco a ocho, cuando los tumores son palpables.Todas las operaciones que impliquen ser probado deben realizarse en condiciones de semioscuridad. Esta condición también se mantiene cuando se trata a los animales después de recibir la dosis compuesta durante un período de dos días. Reúna al azar cuatro grupos de ocho animales y retire el pelaje del área del tumor.Los dos grupos de control reciben una inyección intravenosa del vehículo. 100 microlitros de solución salina por animal de 20 gramos, y los animales de los dos grupos experimentales recibieron el compuesto probado en la fotoforma inactiva en una solución de un miligramo por mililitro de solución salina. Administrar el bolo compuesto en la vena de la cola a cinco mililitros por kilo.Dos horas, 45 minutos después de que se haya inyectado el compuesto, irradie el área del tumor durante 20 minutos bajo anestesia con isoflurano con un láser de 650 nanómetros, utilizando una densidad de potencia de luz de 100 milivatios por centímetro cuadrado. Observe cuidadosamente las condiciones de los animales durante los próximos 30 minutos. Observar a los animales diariamente, y medir su peso y las dimensiones de sus tumores.Mida los volúmenes tumorales y observe la progresión de la necrosis. Determinar la tasa de supervivencia mediante el procedimiento estándar. Los resultados de nuestro protocolo para el paso uno en el caso de experimentos de cultivo celular 2D se pueden presentar como imágenes, como se ilustra aquí en una imagen representativa de células de carcinoma de pulmón de Lewis incubadas con LMB002 a diferentes concentraciones y durante diferentes períodos de la incubación.Costaining con Hoechst y yoduro de propidio permite la visualización de núcleos celulares en el canal azul, dando así un recuento total de células. Se observaron células con integridad comprometida de la membrana plasmática en el canal rojo. Suponiendo que este último esté necrosóticamente muerto, la citotoxicidad aparente de un compuesto en estudio puede cuantificarse como un porcentaje de las células positivas para yoduro de propidio.Los resultados de la cuantificación de datos obtenidos a través del análisis automatizado de imágenes se muestran aquí. Para LMB002, se pueden observar dependencias sigmoidales del porcentaje de células positivas para yoduro de propidio en la concentración del compuesto. A partir de estos datos, se pueden determinar los valores de IC50.Nuestro experimento reveló que la forma abierta de LMB002 es aproximadamente un paso de dilución menos tóxica que el péptido prototipo, gramicidina S, mientras que la forma cerrada demuestra de tres a cuatro pasos de dilución menor toxicidad, que aumenta con el tiempo de incubación. Los experimentos de células 3D produjeron el mismo tipo de datos sin procesar, las imágenes esferoides resueltas de una sola célula por pared. La inclusión de calceína como tercer colorante de tinción permite cuantificar la fracción de células metabólicamente activas observadas en el canal verde.Las curvas de efecto de dosis, como las del experimento 2D, se obtuvieron de las pilas de imágenes de la pila Z. El panel A ilustra tales curvas, corroborando los resultados 2D. Como se muestra en el panel B, el diámetro total del esferoide varía con la concentración del compuesto.El experimento para el paso dos permite la determinación de las concentraciones de LMB002 en ambas fotoformas mediante el uso de cromatografía líquida de alta resolución detectada por UV. Ambas fotoformas fueron suficientemente diferentes en tiempos de retención y absorbancia, mostradas integradas en los paneles A y B de la figura. Los datos obtenidos se resumen en la figura, confirmando que nuestra fuente de luz roja induce la fotoconversión LMB002 cerrada con anillo a una profundidad de hasta un centímetro en la madre sustituta tisular, carne picada a aproximadamente 103 milivatios por centímetro cuadrado.Los resultados del experimento in vivo, paso tres de nuestra metodología, fueron representados por gráficos que muestran el crecimiento tumoral en función del tiempo en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. La estrategia representada aquí para evaluar candidatos a fármacos fotoconmutables es práctica y adecuada para compuestos con fotointerruptores de tipo diariletén. Paso uno, la cuantificación de citotoxicidad se puede utilizar para el cribado inicial de las bibliotecas de los compuestos fotocontrolados.Paso dos, la evaluación de la eficiencia de la fotoconmutación es fácil de configurar y ética. No requiere animales vivos. Paso tres, modelos de fotofarmacología in vivo, la terapia se puede aplicar a animales pequeños.

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