Visualización de metabolitos identificados en el metaboloma espacial de la medicina tradicional china utilizando DESI-MSI

Este artículo describe principalmente un método rentable para preparar muestras de plantas e imágenes utilizando DESI-MSI, y puede superar las desventajas asociadas con los tejidos secos, que se fracturan fácilmente cuando se sopla nitrógeno. La raíz se crioseccionó en el micrótomo criostato, mientras que la hoja se preparó mediante impresión, lo que requiere una máquina costosa o pierde intensidad de señal. Nuestro método puede superar estas limitaciones.

Este método se puede utilizar en la metabolómica espacial de las plantas, como la distribución y el movimiento de sustancias tóxicas en plantas bajo estrés abiótico y biótico. Para comenzar, tome raíces y hojas limpias de una planta de salvia miltiorrhiza de dos años y corte directamente en un grosor de sección transversal de aproximadamente tres a cinco milímetros. Luego, pegue la muestra en un portaobjetos de vidrio de microscopio de adhesión con cinta adhesiva de doble cara.

Coloque otro portaobjetos de vidrio de microscopio sobre la muestra y envuélvalos con una película de sellado como un sándwich. A continuación, congele la muestra de sándwich a menos 80 grados centígrados durante al menos cuatro horas, luego sométala a un vacío de aire durante dos horas con la temperatura atrapada a menos 75 a menos 82 grados centígrados y el medidor de vacío a 2.5 a 3.7 pascal. Para el análisis, después de retirar las muestras del almacenamiento en frío, llévelas a temperatura ambiente en un desecador para evitar la condensación en la superficie de la muestra antes de someter la muestra a la aplicación de la matriz.

Implemente la configuración del detector de instrumentos y la calibración de masa en ionización por electrospray, o modo ESI. Lleve a cabo la configuración del detector utilizando leucina y cefalina en acetonitrilo de agua en una proporción de uno a uno, y realice la calibración de masa con formiato de sodio e isopropanol de agua en una proporción de uno a uno. Saque la fuente ESI y monte la unidad DESI en el espectrómetro de masas.

Conecte el suministro de gas nitrógeno a la unidad DESI y ajuste la presión del gas a alrededor de 0,5 megapascales. Llene una jeringa de cinco mililitros con leucina y cefalina y ácido fórmico en metanol de agua en una proporción de uno a nueve, y conecte la jeringa a la bomba de jeringa de alto rendimiento para proporcionar disolvente para la ionización de los productos químicos en la muestra. A continuación, conecte un capilar que proporcione disolvente a la jeringa y al pulverizador DESI.

El disolvente que proporciona capilar es un capilar estándar de dimensiones con un diámetro interno de 75 micrómetros y un diámetro exterior de 375 micrómetros. Encienda la bomba de la jeringa y ajuste la velocidad de infusión a dos microlitros por minuto para obtener un flujo constante y una pulverización del disolvente. Apague la válvula de gas nitrógeno y luego enciéndala después de unos 15 segundos.

Una pequeña gota de disolvente sopla sobre el escenario y se puede ver un aerosol si el flujo de disolvente está en un estado constante. A continuación, ajuste la posición del pulverizador en términos del ángulo de pulverización, el eje XYZ, la protuberancia y la altura. Utilice marcadores rojos y negros como referencias para optimizar la señal de espectrometría de masas para obtener una intensidad de señal de alrededor de una vez 10 a la quinta en modo de sensibilidad.

Como la protuberancia del pulverizador es el factor más importante que afecta la intensidad de la señal, ajuste la protuberancia cambiando el protector de gas nitrógeno con una llave de cinco milímetros. La dirección de pulverización influye en la calidad de la imagen de masa. Por lo tanto, gire el pulverizador hasta que el aerosol esté recto.

Después de todos estos pasos, la configuración está lista para experimentos y normalmente es estable durante aproximadamente tres semanas de usabilidad después de la configuración inicial. Para las imágenes DESI-MS, no se requiere tratamiento previo de la muestra. Sin embargo, elimine el exceso de medios en las diapositivas si es posible.

Tome una imagen de la muestra en la diapositiva. Sin tocar la superficie de la muestra para evitar impurezas, coloque la diapositiva en la posición de la placa en la platina DESI, que tiene dos posiciones de placa, A y B.Utilice portaobjetos estándar o una corredera completa para encajar en la posición. Una diapositiva completa puede acomodar hasta cuatro diapositivas y, por lo tanto, tiene un área mucho más grande para experimentos.

Abra el software de procesamiento masivo de imágenes de alta definición. Establezca una nueva placa en la ficha Adquirir y seleccione la posición correcta de la placa, A o B, y el tipo de placa. En la página Seleccionar imagen, seleccione las cuatro esquinas de la diapositiva y, a continuación, la imagen se ajusta automáticamente a la orientación correcta.

Para establecer los parámetros MS, seleccione el tipo de experimento como modo DESI-MS que se usa comúnmente en el que solo se detectará el ion padre. A continuación, seleccione la polaridad como positiva o negativa, ya que el instrumento puede usar solo una polaridad en un experimento. Luego aplique el modo de sensibilidad para obtener más información sobre productos químicos en pequeñas cantidades.

A continuación, dibuje un rectángulo para definir el área de escaneo en la pestaña Patrón y establezca el tamaño de píxel manteniendo iguales los tamaños X e Y del píxel. Establezca la velocidad de escaneo en no más de cinco veces el tamaño del píxel. Guarde el proyecto y exporte una hoja de trabajo para el software de adquisición de MS.

A continuación, importe la hoja de trabajo en el software de adquisición de MS y guárdela como una nueva lista de muestra. Presione Start Run para comenzar el escaneo de imágenes de MS, y se pueden agregar varias imágenes a la cola del experimento importando más hojas de trabajo. Cargue el archivo de datos de la muestra en el software de procesamiento masivo de imágenes y establezca los parámetros para el procesamiento de imágenes DESI.

Como la leucina y la cefalina se utilizaron para la masa de bloqueo interna, y la masa de bloqueo es el único punto para identificar la polaridad del experimento, es crucial establecer la masa de bloqueo correcta. Establezca 556.2772 para el modo positivo y 554.2620 para el modo negativo. Para crear una lista de productos químicos objetivo, cargue el archivo de datos procesados para visualizar la imagen DESI de la muestra.

Haga clic en el botón Normalización para normalizar los datos por cromatografía iónica total para obtener la intensidad relativa de una sustancia química específica a la referencia, y luego se pueden comparar diferentes muestras entre sí. Dibuje una región de interés, o ROI, y copie varias copias en la imagen de muestra. Luego seleccione todos los ROI y exporte el análisis multivariante para extraer información de MS de todos los ROI.

Las imágenes de espectrometría de masas de la raíz y las secciones de hojas enteras muestran la distribución espacial de los compuestos seleccionados. El color de cada píxel representa la intensidad relativa de la relación masa/carga y, por lo tanto, puede asociarse con la distribución natural y la abundancia del ion metabolito en toda la muestra. La distribución de los compuestos objetivo, tanshinone IIA y ácido rosmarínico, es visible en diferentes áreas de la raíz.

El compuesto tanshinol A se detectó en las secciones foliares Como protocolo que apunta a la reproducibilidad, lo más importante es optimizar la intensidad de la señal ajustando la posición del pulverizador en varias dimensiones.