Name: Modelo de rata de trasplante cardíaco heterotópico con perfusión ex-situ normotémica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende un modelo de trasplante cardíaco heterotópico con perfusión ex-situ normotérmica en ratas. Este método simplificado permite evaluar intervenciones farmacológicas y genéticas en corazones donantes.

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Este trabajo contó con el apoyo de una subvención B2021-0991 del Instituto de Investigación Biomédica del Hospital Universitario Nacional de Chonnam y NRF-2020R1F1A1073921 de la Fundación Nacional de Investigación de Corea

El comité de ética del Centro de Investigación con Animales de Laboratorio del Hospital Universitario Nacional de Chonnam (aprobación no. CNU IACUC - H - 2022-36) aprobó todos los experimentos con animales. Las ratas macho Sprague-Dawley (350-450 g), utilizadas en este estudio, recibieron cuidados de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de los animales de laboratorio. Las ratas fueron alojadas en habitaciones con temperatura controlada con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, con comida y agua estándar disponibles.
1. Preparación
NOTA: Un solo experimentador puede llevar a cabo todos los procedimientos experimentales.
<ol><li>Ensamble el aparato de Langendorff, incluyendo el oxigenador, la bomba y las líneas de perfusión, antes de la cirugía (Figura 2). Llenar el circuito de perfusión con 20 mL de suero fisiológico y hacerlo circular hasta que se cebe con sangre autóloga. NOTA: El objetivo de este paso es calentar el circuito extracorpóreo.</li>
	<li>Conecte la vía cardiopléjica al circuito a través de la llave de paso conectada a la cánula aórtica y prepare la bomba de jeringa para la infusión cardiopléjica final. NOTA: Asegúrese de eliminar las burbujas de aire del circuito de perfusión y de la vía cardiopléjica.</li>
	<li>Coloque el sensor de temperatura dentro del depósito donde se almacenará el corazón del donante, manteniendo la temperatura del circuito a 37 °C.</li>
	<li>Preparaciones quirúrgicas<ol><li>Prepare un conjunto separado de microinstrumentos y materiales estériles para cada rata donante y receptora.<ol><li>Prepare el set quirúrgico para el donante: par de tijeras quirúrgicas, par de micro pinzas, pinzas afiladas para mosquitos, suturas de seda 5-0, hisopos de algodón, jeringa de 50 ml, línea de perfusión para la solución cardiopléjica (CPS), bomba de jeringa, angiocatéter de 18 G, un juego de catéteres femorales de 5 Fr. y gasas estériles.</li>
			<li>Prepare el set quirúrgico para el receptor: tijeras microquirúrgicas, retractor de heridas, par de micropinzas, pinzas para mosquitos, micropinzas vasculares, jeringa de 1 ml, suturas de polipropileno 5-0 y 9-0, suturas de seda 5-0, bastoncillos de algodón y gasas estériles.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Preservación del corazón del donante y extracción de sangre
<ol><li>Inducir la anestesia en la rata donante con isoflurano (5%) en la cámara de anestesia y registrar el peso de la rata antes de colocarla en la mesa quirúrgica.</li>
	<li>Coloque a la rata en posición supina sobre la mesa quirúrgica y administre anestesia continua administrando isoflurano al 2%-2,5% con oxígeno al 90% a través de un cono nasal.</li>
	<li>Verifique la profundidad de la anestesia verificando la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie y la frecuencia de la respiración, que debe estar entre 50-60 por minuto. NOTA: Un nivel adecuado de anestesia es crucial para evitar estrés y dolor innecesarios a la rata donante.</li>
	<li>Aplique lubricante para los ojos y afeite la región del pubis hasta la clavícula, donde se realizará la cirugía. Limpie el área con un exfoliante a base de yodo y alcohol al 70%.</li>
	<li>Cateterismo<ol><li>Realizar una incisión abdominal de 7 cm en la línea media e incisiones bilaterales de 3 cm desde la apófisis xifoides hasta la mitad de la clavícula. Retire la piel de la región torácica.</li>
		<li>Con hisopos de algodón, movilice los órganos abdominales hacia el lado izquierdo del abdomen. Aislar la aorta abdominal de la fascia retroperitoneal y de los tejidos adiposos.</li>
		<li>Inyectar 1.000 UI de heparina disuelta en 0,3 ml de solución salina isotónica a través de la vena cava inferior (VCI) con una jeringa de 1 ml. Detenga el sangrado del orificio de la aguja comprimiendo suavemente con un hisopo de algodón. NOTA: Tenga cuidado con la embolia gaseosa durante la inyección, ya que puede provocar un paro cardíaco.</li>
		<li>Insertar un catéter femoral de 5 Fr. en la aorta abdominal (Abd. A). Asegúrese de que la punta del catéter llegue al arco aórtico. Confirme la ubicación del catéter evaluando la longitud aproximada de la parte insertada del catéter.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de sangre<ol><li>Recolectar alrededor de 10 ml de sangre a través del catéter insertado en el Abd. A.</li>
		<li>Posteriormente, diluir la sangre de cebado con suero fisiológico isotónico hasta que el volumen total alcance los 12 mL. Añadir 5 mg de cefazolina disuelta en 0,3 mL de suero fisiológico e insulina (20 UI).</li>
	</ol></li>
	<li>Paro cardiaco<ol><li>Conecte la línea de perfusión CPS previamente preparada al catéter abdominal e inicie la administración de CPS con la bomba de jeringa a una velocidad de 800 mL/h.</li>
		<li>Abra la cavidad torácica desde el diafragma y corte la VCI cerca del diafragma para evitar la distensión ventricular. Corta las costillas bilateralmente a lo largo de la columna torácica hasta la entrada torácica. Reflejar la pared torácica ventral movilizada de forma superior con pinzas antimosquitos.</li>
		<li>Retire el timo por completo con micropinzas para visualizar el arco aórtico. Aplique una ligera compresión si las arterias tímicas sangran.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción<ol><li>Después de administrar todo el CPS, aísle el arco aórtico de los tejidos circundantes. Diseccione cuidadosamente justo debajo de la arteria subclavia izquierda.</li>
		<li>Transecte las arterias braquiocefálicas y carótidas comunes izquierdas en una posición distante, dejando los muñones más largos del arco aórtico para facilitar su manipulación durante la canulación de la aorta. Transecte la arteria pulmonar principal (AMP) lo más cerca posible de la bifurcación. Tenga cuidado de no dañar la orejuela auricular izquierda.</li>
		<li>Ligar cuidadosamente la vena cava superior (VCS) y la VCI con suturas de seda 5-0, evitando la obstrucción de la aurícula derecha (AR) y el seno coronario. Cubra los márgenes izquierdos del tórax con una gasa húmeda, coloque el corazón sobre él y retraiga suavemente las ligaduras de la VCS y la VCI para exponer el hilio.</li>
		<li>Ligar las venas pulmonar y ácigos junto con una sutura de seda 5-0. Cortar el tejido dorsal a la ligadura y extraer el corazón. Examina el corazón en busca de cualquier lesión. Por último, pesar el corazón antes de la canulación aórtica.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Perfusión ex situ
<ol><li>Canulación y perfusión de la aorta<ol><li>Antes de la canulación de la aorta, reemplace el circuito preparado con solución salina con cebado sanguíneo.</li>
		<li>Inserte la cánula aórtica en el arco aórtico y asegúrela con una micropinza temporal. Asegúrese de que la punta de la cánula esté colocada en la unión braquiocefálica.</li>
		<li>Confirme la posición correcta de la cánula agarrando suavemente la aorta con micropinzas.</li>
		<li>Inicie la perfusión a un caudal de 2-3 ml/min, permitiendo que la perfusión se filtre desde el sitio de canulación para eliminar las burbujas de aire.</li>
		<li>Controle la presión y la temperatura de perfusión a través del sensor conectado al sistema de monitoreo.</li>
		<li>Masajee suavemente el corazón con los dedos índice e índice hasta que la sangre venosa se filtre de la arteria pulmonar principal (MPA).</li>
		<li>Asegure la aorta con una ligadura de seda 1-0 y retire la pinza después de verificar todos los ajustes (circuito de perfusión, presión de perfusión, temperatura).</li>
		<li>Una vez colocada la ligadura permanente, asegúrese de que el corazón comience a contraerse en unos pocos segundos y alcance el ritmo normal en 60 s. Una presión media de perfusión de 55-65 mmHg con un flujo coronario de 3-4 mL a 37 °C indica una perfusión adecuada.</li>
		<li>Recoger 0,15 ml de sangre del depósito y comprobar la gasometría (BGA) al inicio de la perfusión y cada 20 minutos a partir de entonces. Controle y registre el pH, pCO 2, pO2, glucosa, hematocrito, potasio y lactato durante la perfusión. Después de 120 min de perfusión, administrar 3 mL de Custodiol a través de la bomba de jeringa a una velocidad de 250 mL/h para detener el corazón.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Implantación
<ol><li>Preparación del destinatario<ol><li>Iniciar la preparación del receptor 30 min antes del cese de la perfusión ex situ .</li>
		<li>Anestesiar al animal receptor utilizando el mismo método mencionado en el paso 2.2.</li>
		<li>Coloque a la rata en posición supina sobre la almohadilla térmica e inserte la sonda de temperatura en el recto para mantener la temperatura corporal a 37 °C.</li>
		<li>Aplique lubricante para los ojos, afeite el pubis en el área epigástrica y limpie el área con un exfoliante a base de yodo y alcohol al 70%.</li>
	</ol></li>
	<li>Medicamentos<ol><li>Inyecte 2 ml de solución salina tibia por vía subcutánea para compensar la pérdida de líquido durante la cirugía. Inyectar 200 UI de heparina por vía subcutánea.</li>
		<li>Administrar profilaxis antibiótica inyectando 10 mg/kg de cefazolina disuelta en 0,3 ml de suero fisiológico por vía subcutánea o intramuscular.</li>
		<li>Administrar el control del dolor inyectando 20 mg/kg de diclofenaco por vía subcutánea.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar la laparotomía de línea media e insertar un retractor para ensanchar la cavidad abdominal. Movilice los órganos abdominales hacia el lado izquierdo del receptor con hisopos de algodón para hacer espacio para el procedimiento.</li>
	<li>Evite la deshidratación envolviendo los órganos abdominales con una gasa tibia y húmeda. Esparcir de forma intermitente solución salina tibia con una jeringa de 50 ml durante la cirugía.</li>
	<li>Utilizando un microscopio quirúrgico con un aumento de 10x, movilice el duodeno y el yeyuno proximal mediante disección roma con hisopos de algodón para exponer el Abd. A. y la VCI. Prepara el Abd. A y VCI para la anastomosis e implantar sistemáticamente el corazón del donante, de acuerdo con la Figura 3 o métodos previamente documentados15. NOTA: No separe el Abd. A. y el IVC.<ol><li>Suponiendo que la anastomosis vascular se coloque infrarrenal, prepare una porción suficiente de la aorta y la VCI para el pinzamiento.</li>
		<li>Realice la preparación roma con hisopos de algodón o pinzas dentadas afiladas para eliminar las grasas y la fascia alrededor de los vasos.</li>
		<li>Coloque ligaduras de seda 5-0 en las ramas mesentéricas y en los lados craneal y caudal de los vasos principales. Elevar los vasos abdominales y coagular o ligar las ramas lumbares con suturas de seda 5-0. Recuerde preservar las arterias y venas testiculares y no pinzarlas.</li>
		<li>Use ligaduras para levantar los vasos y coloque las micropinzas en las ramas mesentéricas, los lados caudal y craneal de los vasos principales para detener el flujo sanguíneo en el sitio de la anastomosis. Apague la almohadilla térmica antes de colocar las pinzas, ya que el exceso de calor puede exacerbar la isquemia de las extremidades. Asegúrese de encender la almohadilla térmica después de quitar la abrazadera de los vasos para evitar la hipotermia.</li>
		<li>Punción de la aorta con aguja de 27 G y alargar la incisión con microtijeras hasta una longitud igual o ligeramente mayor que la abertura de la aorta ascendente donante (Asc. A), que es de aproximadamente 5 mm.</li>
		<li>Realice una incisión longitudinal en la VCI de la misma manera que la aortotomía, pero hágala 3 mm más cerca del lado caudal en comparación con la incisión de la aorta.</li>
		<li>Iniciando las anastomosis, se colocó el corazón del donante en el lado derecho del abdomen del receptor y se colocó el Asc del donante. A al Abd. A con una puntada simple interrumpida (polipropileno 9-0) en la esquina craneal de la incisión longitudinal.</li>
		<li>Mover el corazón hacia el lado izquierdo del abdomen del receptor y realizar la anastomosis del Asc del donante. A con el Abd. A utilizando una sutura de polipropileno 9-0 en funcionamiento.</li>
		<li>Fijar la arteria pulmonar donante a la VCI con dos suturas interrumpidas (polipropileno 9-0) en las esquinas caudal y craneal de la incisión longitudinal.</li>
		<li>Realizar la primera mitad de la anastomosis venosa desde el lado intraluminal del vaso y completar la segunda mitad desde el lado extraluminal del vaso. Antes de apretar los nudos, enjuague el campo con solución salina para evitar la embolia gaseosa.</li>
	</ol></li>
	<li>Desaireación y desbloqueo<ol><li>Retire primero la pinza de la vena mesentérica después de completar la anastomosis para permitir que el lado derecho del corazón se llene de sangre venosa.</li>
		<li>Retire el aire en el circuito coronario y Asc. A. aplicando perfusión coronaria retrógrada durante varios segundos.</li>
		<li>Coloque un trozo de gasa a ambos lados de los vasos y retire la pinza caudal y la pinza craneal.</li>
		<li>Aplique una compresión suave con bastoncillos de algodón durante 1-2 minutos. Después de asegurar una hemostasia adecuada, retire los hisopos y lave las anastomosis con solución salina tibia. NOTA: El corazón debe comenzar a latir dentro del primer minuto de la reperfusión. Si la temperatura corporal de la rata receptora es inferior a 35 °C, el ritmo cardíaco se normalizará después de que la temperatura alcance los 36 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Reemplace los órganos abdominales en forma de meandro y cierre las capas de la incisión abdominal con suturas continuas de polipropileno 5-0.</li>
	<li>Después de la cirugía, coloque al animal anestesiado en un área limpia sobre una almohadilla térmica hasta que la temperatura corporal alcance los 37 ° C. NOTA: No inicie los exámenes postoperatorios hasta que la temperatura corporal alcance los 37 ° C. Mantener la anestesia al 2-2,5% de isoflurano hasta el final de los experimentos.</li>
	<li>Monitorizar el ECG del corazón del donante trasplantado durante 3 h. Luego, extirpar el corazón bajo anestesia profunda para estudios histológicos. NOTA: Confirme la profundidad de la anestesia a través de la falta de reflejo pedal antes de extirpar el corazón. El procedimiento quirúrgico y la monitorización del ECG duran menos de 6 h. El diclofenaco, administrado perioperatoriamente (paso 4.2.3.), permite el tratamiento del dolor durante toda la duración de este procedimiento. El régimen de analgesia se puede ajustar según las pautas institucionales de uso de animales.</li>
</ol>

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<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+ex+vivo+heart+perfusion+combined+with+melatonin+enhances+myocardial+protection+in+rat+donation+after+circulatory+death+hearts+via+inhibiting+NLRP3+inflammasome-mediated+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Normothermic ex vivo heart perfusion combined with melatonin enhances myocardial protection in rat donation after circulatory death hearts via inhibiting NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 733183(2021).</li>
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<li>Fu, X., Segiser, A., Carrel, T. P., Tevaearai Stahel, H. T., Most, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+heterotopic+heart+transplantation+model+to+investigate+unloading-induced+myocardial+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rat heterotopic heart transplantation model to investigate unloading-induced myocardial remodeling.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 3, 34(2016).</li>
<li>Niimi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technique+for+heterotopic+cardiac+transplantation+in+mice%3A+experience+of+3000+operations+by+one+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+constant+coronary+artery+flow+versus+constant+coronary+perfusion+pressure+during+normothermic+ex-situ+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The evaluation of constant coronary artery flow versus constant coronary perfusion pressure during normothermic ex-situ heart perfusion.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 41 (12), 1738-1750 (2022).</li>
<li>Okahara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+blood+viscosity+estimation+method+based+on+pressure-flow+characteristics+of+an+oxygenator+during+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">A novel blood viscosity estimation method based on pressure-flow characteristics of an oxygenator during cardiopulmonary bypass.</a> Artificial Organs. 41 (3), 262-266 (2017).</li>
<li>Quader, M., Torrado, J. F., Mangino, M. J., Toldo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+and+flow+rate+limit+the+optimal+ex-vivo+perfusion+of+the+heart+-+an+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Temperature and flow rate limit the optimal ex-vivo perfusion of the heart - an experimental study.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 15 (1), 180(2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Nuestro objetivo al establecer este modelo fue replicar el trasplante de corazón humano normotérmico. Los modelos sin eyección son la técnica comúnmente preferida para preservar el corazón del donante en un ambiente ex situ 16. Si bien los modelos de eyección ofrecen muchas ventajas en la evaluación de la función cardíaca durante la perfusión ex situ 17, no son adecuados para los modelos de trasplante heterotópico. En el trasplante heterotópico, el corazón...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64954">Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation</a>. The Protocol section was updated.
Section 4 of the Protocol was updated from:
4. Implantation
<ol>
	<li>Preparation of recipient
	<ol>
		<li>Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.</li>
		<li>Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.</li>
		<li>Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 &#176;C.</li>
		<li>Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Medications
	<ol>
		<li>Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.</li>
		<li>Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.</li>
		<li>Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.</li>
	<li>Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.</li>
	<li>Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15. 
	NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
	<ol>
		<li>Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.</li>
		<li>Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.</li>
		<li>Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.</li>
		<li>Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.</li>
		<li>Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.</li>
		<li>Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.</li>
		<li>Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient&#39;s abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient&#39;s Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.</li>
		<li>Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor&#39;s Asc. A with the recipient&#39;s Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.</li>
		<li>Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.</li>
		<li>Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>De-airing and de-clamping
	<ol>
		<li>Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.</li>
		<li>Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.</li>
		<li>Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.</li>
		<li>Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline. 
		NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat&#39;s body temperature is below 35 &#176;C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.</li>
</ol>
to:
4. Implantation
<ol>
	<li>Preparation of recipient
	<ol>
		<li>Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.</li>
		<li>Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.</li>
		<li>Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 &#176;C.</li>
		<li>Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Medications
	<ol>
		<li>Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.</li>
		<li>Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.</li>
		<li>Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.</li>
	<li>Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.</li>
	<li>Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15. 
	NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
	<ol>
		<li>Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.</li>
		<li>Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.</li>
		<li>Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.</li>
		<li>Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.</li>
		<li>Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.</li>
		<li>Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.</li>
		<li>Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient&#39;s abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient&#39;s Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.</li>
		<li>Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor&#39;s Asc. A with the recipient&#39;s Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.</li>
		<li>Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.</li>
		<li>Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>De-airing and de-clamping
	<ol>
		<li>Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.</li>
		<li>Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.</li>
		<li>Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.</li>
		<li>Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline. 
		NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat&#39;s body temperature is below 35 &#176;C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.</li>
	<li>After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37&#176;C.&#160; 
	NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37&#176;C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments.</li>
	<li>Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies. 
	NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64954">Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation

El trasplante cardíaco sigue siendo la única terapia viable para la insuficiencia cardíaca refractaria 1,2,3,4. A pesar de un aumento constante en el número de pacientes que necesitan trasplante cardíaco, no se ha observado un aumento proporcional en la disponibilidad de órganos de donantes5. Para abordar este problema, se han desarrollado enfoques novedosos para preservar los corazones de los donantes con el objetivo de mejorar los desafíos y aumentar la disponibilidad de donantes 6,7,8,9.
La perfusión cardíaca nortérmica ex situ (NESHP) mediante máquinas del sistema de cuidado de órganos (OCS) ha surgido como una intervención clínica 1,3. Esta técnica se ha considerado una alternativa adecuada al método convencional de almacenamiento estático en frío (SCS) 2,9. La NESHP reduce eficazmente la duración de la isquemia fría, disminuye la demanda metabólica y facilita el suministro nutricional óptimo y la oxigenación durante el transporte de los órganos del donante10,11. A pesar del claro potencial de este método para mejorar la preservación de órganos de donantes, su aplicación clínica y la investigación posterior se han visto limitadas por los altos costos. Por lo tanto, los modelos animales preclínicos de NESHP son cruciales para identificar los desafíos técnicos clave asociados con esta técnica12,13. Los cerdos y las ratas son los modelos animales preferidos para los estudios preclínicos debido a su tolerancia isquémica9. Aunque el modelo porcino es ideal para la investigación básica y traslacional, está limitado por su alto costo y la mano de obra intensiva requerida para su cuidado y mantenimiento. Por el contrario, los modelos de ratas son menos costosos y más fáciles de manejar14.
En este estudio, introducimos un modelo simplificado de NESHP en ratas, seguido de un trasplante cardíaco heterotópico, para evaluar el impacto de la técnica de preservación en la condición del injerto después de la implantación. Este modelo es sencillo, rentable y puede ser ejecutado por un solo experimentador. La Figura 1 muestra los esquemas del procedimiento.

<table><tbody><tr><td>Sistema de evacuación activa AES</td><td>Smiths medical</td><td>PC-6769-51A</td><td>Utilice CO2 y exceso de isoflurano</td></tr><tr><td>Máquina de anestesia</td><td>Smiths medical</td><td>PC-8801-01A</td><td>Mezcla isoflurano y oxyegn y entrega al animal</td></tr><tr><td>B20 monitor</td><td>de paciente GE medical systems</td><td>B20</td><td>para observar la presión aórtica media y la temperatura</td></tr><tr><td>Sistema de monitoreo homeotérmico</td><td>Aparato de Harvard</td><td>55-7020</td><td>Para controlar y mantener la temperatura de los animales</td></tr><tr><td>Micro-1 Oxigenador de ratas</td><td>Dongguan Kewei Instrumentos médicos</td><td>Micro-MO</td><td>Para el intercambio de gases en el circuito de Langendorff</td></tr><tr><td>Introductor de micropuntura Set</td><td>COOK medical</td><td>G48007</td><td>para administrar solución cardiopléjica al arco a través de la aorta abdominal</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Amscope</td><td>MU1403</td><td>Para zoom quirúrgico campo (Receptor)</td></tr><tr><td>Lupa quirúrgica</td><td>SurgiTel</td><td>L2S09</td><td>Para hacer zoom campo quirúrgico (Donante)</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>AMP all</td><td>SP-8800</td><td>Para administrar solución cardiopléjica</td></tr><tr><td>Sensor de flujo transónico</td><td>Transonic</td><td>ME3PXL-M5</td><td>Sensor de flujo de circuito de perfusión</td></tr><tr><td>Módulo de flujo de tubo transónico Transonic</td><td></td><td>TS410</td><td>sistema de adquisición de flujo</td></tr><tr><td>Watson - Bombas Marlow</td><td>Aparato Harvard</td><td>010.6131.DAO</td><td>Bomba peristáltica utilizada para la recirculación de perfusión</td></tr><tr><td>WBC-1510A</td><td>JEIO TECH</td><td></td> E03056D <td>Baño calefactor</td></tr><tr><td>Ratas Sprague-Dawley</td><td>Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medicamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioHAnce Gel Eye Drops</td><td>SENTRIX Cuidado</td><td></td> de animales<td>Ungüentos húmedos para los ojos</td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>JW farmacéutica</td><td></td><td>Para la profilaxis</td></tr><tr><td>Custodiol</td><td>DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH</td><td></td><td>Para la extracción del corazón</td></tr><tr><td>Diclofenaco</td><td>Myungmoon Pharm. Co. Ltd</td><td></td><td>Para el control del dolor</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>JW farmacéutica</td><td></td><td>Anticoagulante</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>JW farmacéutica</td><td></td> terapia <td>hormonal</td></tr><tr><td>Salina</td><td>JW pharmaceutical</td><td></td><td>Para la terapia de hidratación</td></tr></tbody></table>

modelo de rata de trasplante cardíaco heterotópico con perfusión ex-situ normotémica

Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation

El trasplante de corazón es la terapia más eficaz para la insuficiencia cardíaca terminal. A pesar de las mejoras en los enfoques e intervenciones terapéuticas, el número de pacientes con insuficiencia cardíaca que esperan un trasplante sigue aumentando. La técnica de conservación ex situ normotérmica se ha establecido como un método comparable a la técnica convencional de almacenamiento estático en frío. La principal ventaja de esta técnica es que los corazones de los donantes pueden conservarse hasta 12 h en condiciones fisiológicas. Además, esta técnica permite la reanimación de los corazones del donante después de la muerte circulatoria y aplica las intervenciones farmacológicas necesarias para mejorar la función del donante después de la implantación. Se han establecido numerosos modelos animales para mejorar las técnicas de preservación normotérmica ex situ y eliminar las complicaciones relacionadas con la preservación. Aunque los modelos de animales grandes son fáciles de manejar en comparación con los modelos de animales pequeños, es costoso y desafiante. Presentamos un modelo de rata de preservación normotérmica ex situ del corazón de donante seguido de trasplante abdominal heterotópico. Este modelo es relativamente barato y puede ser realizado por un solo experimentador.

La Figura 1 ilustra el diseño experimental utilizado en un modelo de animal pequeño. La figura 2 muestra el aparato de perfusión de Langendorff modificado, que incluye un oxigenador para animales pequeños. El orden de la anastomosis para el implante abdominal heterotópico se presenta en la Figura 3.
En la figura 4 se muestran los parámetros utilizados para evaluar la viabilid...

En este trabajo se presenta un protocolo de evaluación de un corazón implantado heterotópicamente tras la preservación ex situ normotérmica en el modelo de rata.

Modelo de rata de trasplante cardíaco heterotópico con perfusión ex-situ normotémica

Heart transplantation is the most effective therapy for end-stage heart failure. Despite the improvements in therapeutic approaches and interventions, the ...

Hemos desarrollado un modelo para reducir las complicaciones asociadas con la perfusión normotérmica ex situ y aumentar el tiempo de conservación segura de los corazones de los donantes. En comparación con los modelos animales alternativos, este modelo es simple y rentable, y puede ser ejecutado por un solo experimentador. Este modelo puede ser útil para probar la efectividad a largo plazo de las intervenciones farmacológicas y genéticas en los corazones de los donantes después de los trasplantes.El procedimiento quirúrgico requiere habilidad microquirúrgica. El factor clave para lograr el éxito en este modelo es practicar y centrarse en los pasos críticos descritos en el manuscrito. Para comenzar, ensamble el aparato de Langendorff, incluidas las líneas de oxigenación, bomba y perfusión.Llene el circuito de perfusión con 20 mililitros de solución salina y hágalo circular hasta que se cebe con sangre autóloga. En la rata donante anestesiada, realizar una incisión abdominal de 7 centímetros en la línea media y, a continuación, incisiones bilaterales de 3 centímetros desde la apófisis xifoides hasta la mitad de la clavícula. Retire la piel de la región torácica.Inyecte 1.000 unidades

rat-model-normothermic-ex-situ-perfused-heterotopic-heart

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Se demuestra una técnica para el procedimiento microquirúrgico para el trasplante heterotópico de corazones en ratones, incluyendo métodos simplificados para la recolección de donantes y la anastomosis de los vasos receptores.

Un método modificado para heterotópico Ratón Corazón TRASPLANTE

Hay una escasez de donantes de hígado significativa, y se han ampliado los criterios de los donantes de hígado. Perfusión normotérmica ex vivo hígado (NEVLP) ha sido desarrollada para evaluar y modificar la función del órgano. Este estudio muestra un modelo de rata de NEVLP y pone a prueba la capacidad de pegilado-catalasa, para mitigar la lesión hepática de preservación.

Un pequeño modelo de la perfusión hepática normotérmica Ex Vivo

Normotérmica ex situ corazón perfusión (ESHP), conserva el corazón en un estado semi-fisiológico, paliza. Cuando se realiza en un modo de trabajo, ESHP proporciona la oportunidad de realizar evaluaciones sofisticadas de donantes viabilidad de función y órgano de corazón. Aquí, describimos nuestro método para la evaluación del desempeño miocardio durante ESHP.

Normotérmica Ex Situ corazón perfusión en modo de trabajo: evaluación de la función cardiaca y el metabolismo

Describimos un modelo de trasplante de corazón abdominal heterotópico en ratas, lo que implica modificaciones de las estrategias actuales, que conducen a un enfoque quirúrgico simplificado. Además, describimos un nuevo modelo de rechazo mediante inyección en la oreja de células musculares cardíacas vitales, permitiendo análisis inmunológicos de trasplante adicionales en ratas.

Un modelo inmunológico para el trasplante heterotópico de células musculares cardíacas y cardíacas en ratas

Presentamos un protocolo para la utilización de un sistema de perfusión sanguínea normotérmica ex vivo para la administración de terapias a un aloinjerto cardíaco completo en un modelo de trasplante de corazón heterotópico porcino.

Un protocolo de trasplante de corazón heterotópico porcino para la administración de terapias a un aloinjerto cardíaco

En el presente protocolo, se utiliza un modelo de trasplante cardíaco de ratón para investigar el mecanismo del rechazo del aloinjerto cardíaco. En este modelo heterotópico de trasplante cardíaco, se mejora la eficiencia de la operación y la supervivencia de los injertos cardíacos se garantiza mediante una anastomosis cervical de extremo a extremo de la implantación cardíaca utilizando una técnica de manguito modificado.

Una técnica de manguito modificado para el modelo de trasplante cardíaco heterotópico cervical de ratón

El protocolo describe un modelo de donación de animales grandes (porcinos) después de la muerte circulatoria, seguido de perfusión regional normotérmica toracoabdominal que simula de cerca el escenario clínico en el trasplante cardíaco y tiene el potencial de facilitar estudios y estrategias terapéuticas.

Modelo animal grande de donación después de la muerte circulatoria y perfusión regional norterámica para la evaluación cardíaca

Este estudio demuestra una técnica de trasplante de corazón abdominal heterotópica reproducible en ratas que los principiantes pueden aprender y realizar. Además, se genera un nuevo modelo de regurgitación aórtica en ratas mediante la realización de un trasplante de corazón abdominal heterotópico y el daño de la válvula aórtica del donante utilizando un alambre guía después de la recolección.

Trasplante de corazón abdominal heterotópico modificado y un nuevo modelo de regurgitación aórtica en ratas

Se creó un sistema normotérmico de perfusión hepática ex vivo (NEVLP) para hígados de ratón. Este sistema requiere experiencia en microcirugía, pero permite resultados de perfusión reproducibles. La capacidad de utilizar hígados de ratón facilita la investigación de vías moleculares para identificar nuevos aditivos de perfusión y permite la ejecución de experimentos centrados en la reparación de órganos.

Normothermic ex vivo liver machine perfusión en ratón

El protocolo describe un modelo porcino de alta fidelidad de trasplante cardíaco después de la donación después de la muerte circulatoria utilizando la perfusión ex vivo del aloinjerto.

Un modelo porcino de alta fidelidad de trasplante ortotópico de corazón después de la donación después de la muerte circulatoria

Aprende un modelo de trasplante cardíaco heterotópico con perfusión ex-situ normotérmica en ratas. Este método simplificado permite evaluar intervenciones farmacológicas y genéticas en corazones donantes.

Modelo de rata de trasplante cardíaco heterotópico con perfusión ex-situ normotémica

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