Name: Medición del diámetro de los vasos retinianos a partir de imágenes de angiografía fluorescente de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: Aprende a medir el diámetro de vasos retinianos en ratones anestesiados mediante angiografía fluorescente y un programa MATLAB personalizado. Este método automatizado permite estudiar enfermedades vasculares oculares y evaluar tratamientos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por una beca postdoctoral del Fondo de Investigación de Islandia (217796-052) (A.G.L.) y el Fondo Conmemorativo Helga Jónsdóttir y Sigurlidi Kristjánsson (A.G.L y T.E.). Los autores agradecen al Prof. Eiríkur Steingrímsson por proporcionar los ratones.

Todos los experimentos fueron aprobados por la Autoridad Alimentaria y Veterinaria de Islandia (licencia MAST Nº 2108002). Todos los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. En este estudio se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6J y Mitfmi-vga9/+ . Se utilizaron ratones C57BL/6J (n = 7) como control. Los tipos silvestres se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de Materiales), pero todos los ratones mutantes (n = 7) fueron criados y criados en instalaciones para animales en el Centro Biomédico de la Universidad de Islandia. En el presente estudio se utilizaron animales de 3 meses de edad; Sin embargo, el protocolo se aplica incluso a animales de 1 mes o más.
1. Preparación experimental
<ol><li>Prepara la mezcla de anestesia. Tome una ampolla de una solución madre de ketamina de 2 ml (25 mg/ml) y una solución madre de xilacina de 250 μl (2%) para preparar una solución de trabajo de la mezcla de ketamina y xilacina (25 mg/ml de ketamina y 20 mg/ml de xilacina) (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de la mezcla de ketamina y xilacina, con un volumen de líquido que es cuatro veces el peso corporal del ratón; por ejemplo, un ratón de 20 g de peso necesita 35 μL de solución de trabajo de xilacina/ketamina para obtener una dosis de trabajo de la mezcla de xilacina (4 mg/kg de peso corporal) y ketamina (40 mg/kg de peso corporal).</li>
	<li>Dilatar las pupilas con un colirio de clorhidrato de fenilefrina al 10% y tropicamida al 1% inmediatamente después de la anestesia.</li>
	<li>Espere hasta que el animal esté completamente anestesiado y sus pupilas estén ampliamente dilatadas.</li>
	<li>Prepara la solución de sal de fluoresceína. Añadir 9 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS; 1x) a 1 mL de solución de fluoresceína (concentración de stock de 100 mg/mL) (ver Tabla de Materiales). La solución de trabajo de concentración final es de 10 mg/mL.</li>
</ol>2. Obtención de imágenes in vivo de la vasculatura de la retina mediante un sistema de imágenes de la retina de roedores
<ol><li>Administrar solución de trabajo con fluoresceína por vía intraperitoneal (5 μL/g de peso corporal) al animal anestesiado.</li>
	<li>Aplique una gota de gel de metilcelulosa al 2% en la superficie de la córnea y luego coloque al animal en la etapa de posicionamiento del sistema de imágenes (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Coloque la lente de la cámara de fondo de ojo para tocar la córnea del ratón directa y suavemente. Para colocar la cabeza del nervio óptico en el centro del campo visual, ajuste ligeramente la alineación.</li>
	<li>Cambie al canal fluorescente verde de la cámara de fondo de ojo.</li>
	<li>Concéntrese en los vasos de la retina para tomar imágenes.</li>
	<li>Para encontrar el punto de tiempo ideal, tome varias fotos a 1, 3, 5 y 10 minutos (pero no más de 10 minutos) después de la inyección de fluoresceína. NOTA: El tratamiento con AF debe completarse dentro de los 10 minutos, ya que después de ese tiempo la fluoresceína puede difundirse demasiado y los vasos se vuelven indetectables.</li>
	<li>Al finalizar la toma de imágenes, mientras el ratón aún está anestesiado, se le practica la eutanasia mediante una dislocación cervical.</li>
</ol>3. Análisis del diámetro de los vasos retinianos
<ol><li>Abra el programa MATLAB (consulte Tabla de materiales).</li>
	<li>Descargue y guarde el código "fundusDiameter.m" (consulte Archivo de codificación complementaria 1, Archivo de codificación complementaria 2 y Archivo de codificación complementaria 3).</li>
	<li>Abra la carpeta donde se guardó el código. Arrastre el código y suéltelo sobre la carpeta actual de MATLAB.</li>
	<li>Arrastre y suelte la imagen FFA (imagen de angiografía por fluorescencia de fondo de ojo) o las imágenes que desee analizar sobre la carpeta actual de MATLAB.</li>
	<li>Pulse la herramienta Run en la barra de herramientas de MATLAB.</li>
	<li>Aparecerá una ventana emergente. Escriba el nombre de archivo de la imagen de interés en el cuadro Introducir nombre de archivo y pulse OK. NOTA: No cambie ni modifique el resto de los parámetros.</li>
	<li>Seleccione el centro del disco óptico y, a continuación, seleccione el borde del disco óptico. El software ahora calcula la intensidad de los píxeles en las imágenes del fondo de ojo del ratón en un círculo con un radio que es el doble que el del disco óptico, en el sentido de las agujas del reloj desde el centro del disco óptico (Figura 1).</li>
	<li>A continuación, asegúrese de que el software traza el diámetro medio de los vasos (en píxeles) de cada vaso en el fondo de ojo en función del número de vasos (Figura 2).</li>
	<li>A continuación, asegúrese de que el software transfiera los datos de medición de cada recipiente a un documento de Excel, donde se calculan la media, la mediana y la desviación estándar de estos valores (Tabla 1 y Tabla 2).</li>
	<li>Mueva los valores de la tabla de resultados a un programa de hoja de cálculo seleccionando todos los valores de la tabla. Pega los valores en la hoja de cálculo.</li>
	<li>Traza los gráficos y realiza análisis estadísticos utilizando los datos pegados en un programa de hoja de cálculo de tu elección (ver Tabla de Materiales).</li>
</ol>

<ol><li>Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+retina+to+study+dementia+and+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging retina to study dementia and stroke.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 57, 89-107 (2017).</li>
<li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+retinal+vessel+attenuation+in+eyes+with+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of retinal vessel attenuation in eyes with retinitis pigmentosa.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 4306-4314 (2012).</li>
<li>Eysteinsson, T., Hardarson, S. H., Bragason, D., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vessel+oxygen+saturation+and+vessel+diameter+in+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Retinal vessel oxygen saturation and vessel diameter in retinitis pigmentosa.</a> Acta Ophthalmologica. 92 (5), 449-453 (2014).</li>
<li>Al-Latayfeh, M., Silva, P. S., Sun, J. K., Aiello, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+therapy+for+ischemic+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic therapy for ischemic retinopathies.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (6), 006411(2012).</li>
<li>Wang, S., Villegas-Perez, M. P., Vidal-Sanz, M., Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+optic+axon+dystrophy+and+vacuslar+changes+in+rd+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Progressive optic axon dystrophy and vacuslar changes in rd mice.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (2), 537-545 (2000).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+cells+influence+retinal+vascular+degeneration+in+mouse+models+of+retinal+degeneration+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor cells influence retinal vascular degeneration in mouse models of retinal degeneration and diabetes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4272-4281 (2016).</li>
<li>Steingrimsson, E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocytes+and+the+microphthalmia+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network.</a> Annual Review of Genetics. 38, 365-411 (2004).</li>
<li>Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+of+the+microphthalmia+locus+and+its+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mitf.+Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">The discovery of the microphthalmia locus and its gene.</a> Mitf. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (6), 729-735 (2010).</li>
<li>Garcia-Llorca, A., Aspelund, S. G., Ogmundsdottir, M. H., Steingrimsson, E., Eysteinsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microphthalmia-associated+transcription+factor+%28Mitf%29+gene+and+its+role+in+regulating+eye+function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene and its role in regulating eye function.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15386(2019).</li>
<li>Bharti, K., Liu, W., Csermely, T., Bertuzzi, S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+promoter+use+in+eye+development%3A+the+complex+role+and+regulation+of+the+transcription+factor+MITF%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Alternative promoter use in eye development: the complex role and regulation of the transcription factor MITF.</a> Development. 135 (6), 1169-1178 (2008).</li>
<li>Lu, S. Y., Li, M., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitf+induction+by+RANKL+is+critical+for+osteoclastogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitf induction by RANKL is critical for osteoclastogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1763-1771 (2010).</li>
<li>Pillaiyar, T., Manickam, M., Jung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+development+of+signaling+pathways+inhibitors+of+melanogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Recent development of signaling pathways inhibitors of melanogenesis.</a> Cellular Signalling. 40, 99-115 (2017).</li>
<li>Danielsson, S. B., Garcia-Llorca, A., Reynisson, H., Eysteinsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+microphthalmia-associated+transcription+factor+%28Mitf%29+mutations+affect+the+structure+of+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Mouse microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) mutations affect the structure of the retinal vasculature.</a> Acta Ophthalmologica. 100 (8), 911-918 (2022).</li>
<li>Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging the retinal vasculature.</a> Annual Review of Vision Science. 7, 129-153 (2021).</li>
<li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+vessel+diameter+quantification+and+vessel+tracing+for+OCT+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Automated vessel diameter quantification and vessel tracing for OCT angiography.</a> Journal of Biophotonics. 13 (12), e202000248(2020).</li>
<li>Salas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+akinetic+swept+source+optical+coherence+tomography+angiography+at+1060+nm+supporting+a+wide+field+of+view+and+adaptive+optics+imaging+modes+of+the+posterior+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Compact akinetic swept source optical coherence tomography angiography at 1060 nm supporting a wide field of view and adaptive optics imaging modes of the posterior eye.</a> Biomedical Optics Express. 9 (4), 1871-1892 (2018).</li>
<li>Albanna, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+evaluation+of+neurovascular+coupling+in+the+murine+retina+by+dynamic+retinal+vessel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Non-invasive evaluation of neurovascular coupling in the murine retina by dynamic retinal vessel analysis.</a> PLoS One. 13 (10), e0204689(2018).</li>
<li>Moult, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+anesthetic+protocols+for+functional+blood+flow+imaging+in+the+rat+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Evaluating anesthetic protocols for functional blood flow imaging in the rat eye.</a> Journal of Biomedical Optics. 22 (1), 16005(2017).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existen intereses contrapuestos.

El presente artículo es el primero en presentar un método para analizar el diámetro de los vasos retinianos y la vasculatura retiniana a partir de imágenes de AF de ratón. Dado que solo se utilizaron imágenes de fondo de ojo para capturar imágenes de la vasculatura de la retina, el método tiene varios inconvenientes, uno de los cuales es que solo se pueden inferir alteraciones en las capas superficiales de la vasculatura de la retina en los ratones examinados en este estudio; Todavía se desconocen las diferencias en las ...

Posiblemente el lecho vascular más investigado en el cuerpo es la vasculatura retiniana. Con una sofisticación técnica cada vez mayor, la vasculatura de la retina se puede fotografiar fácilmente en pacientes vivos y se utiliza en muchos campos de investigación1. Además, la vasculatura de la retina del ratón durante el desarrollo ha demostrado ser un sistema modelo muy eficaz para la investigación de la biología fundamental del crecimiento vascular. El objetivo principal de la vasculatura retiniana es proporcionar apoyo metabólico a la parte interna de la retina a través de una malla capilar laminar que impregna el tejido neural2. Sin embargo, el estado de la retina y, en consecuencia, cualquier disfunción o atrofia, puede tener efectos significativos tanto en las bifurcaciones de la vasculatura retiniana como en el diámetro de las arterias, demostrando una interacción entre las células de la retina y la vasculatura 3,4. Se sabe que numerosas afecciones oculares, como la retinopatía del prematuro (ROP), la retinopatía diabética (RD), la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), el glaucoma y la neovascularización de la córnea, pueden dar lugar a una angiogénesis ocular anormal5. En el caso de la vasculatura retiniana, los modelos murinos de degeneración retiniana a menudo exhiben cambios comparables a los observados en las enfermedades vasculares humanas 6,7. La familia de supergenes Myc de factores de transcripción fundamentales de hélice-bucle-hélice-cremallera incluye el gen del factor de transcripción asociado a la microftalmia (Mitf) expresado en el epitelio pigmentario de la retina (EPR)8,9,10.
Se ha demostrado que numerosos órganos, incluidos el ojo, el oído, el sistema inmunológico, el sistema nervioso central, el riñón, los huesos y la piel, están regulados por Mitf 9,11,12,13. Hemos descubierto que la estructura y la función del EPR se ven afectadas en ratones portadores de diversas mutaciones en el gen Mitf, lo que da lugar a algunos casos de degeneración de la retina y, en última instancia, a la pérdida de visión10. Recientemente, se ha demostrado que el número de vasos y el diámetro de los vasos difieren significativamente entre los ratones mutantes Mitf y los ratones de tipo salvaje14. Los investigadores y los médicos ahora pueden cuantificar con precisión la vasculatura de la retina in vivo gracias a los avances en las imágenes de la retina. Desde el siglo XIX, los investigadores y los médicos han aprovechado el beneficio de visualizar la vasculatura de la retina, y la angiografía con fluoresceína (AF) ha demostrado tanto el flujo sanguíneo de la retina como la degradación de la barrera hematorretiniana15.
En este artículo se muestra cómo analizar el diámetro de los vasos de la retina a partir de imágenes de AF de ratón con un código escrito a medida en el software de MATLAB.

<table><tbody><tr><td>1% Tropicamida (midriacil)</td><td>Alcon Inc Laboratories</td><td></td><td>Agente midriático</td></tr><tr><td>2% Methocel</td><td>OmniVision Eye Care</td><td></td><td>Gel de hidroxipropril metilcelulosa</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Ratones de tipo salvaje</td></tr><tr><td>Excel para Microsoft 365</td><td>Paquete de software de Microsoft Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28803-100G</td><td>Angiografía fluorescente</td></tr><tr><td>Matlab 8.0</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td>Paquete de software</td></tr><tr><td>Cámara de fondo de ojo para roedores Micron-IV</td><td>Phoenix-Micron</td><td>40-2200</td><td>Fotografía de fondo de ojo</td></tr><tr><td>Fenilefrina 10% c/v</td><td>Bausch & Lomb</td><td></td><td>Agente midriático</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato - 100 comprimidos</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>Dilución</td></tr><tr><td>Sigmaplot 13</td><td>Jandel Scientific Software</td><td></td><td>Paquete</td></tr><tr><td>de software S-Ketamina, 25 mg/mL</td><td>Pfizer Inc.</td><td>PAA104470</td><td>Anesthesia IP</td></tr></tbody></table>

medición del diámetro de los vasos retinianos a partir de imágenes de angiografía fluorescente de ratón

Measuring Retinal Vessel Diameter from Mouse Fluorescent Angiography Images

Es importante estudiar el desarrollo de la vasculatura de la retina en las retinopatías en las que el crecimiento anormal de los vasos puede conducir en última instancia a la pérdida de la visión. Las mutaciones en el gen del factor de transcripción asociado a la microftalmia (Mitf) muestran hipopigmentación, microftalmia, degeneración de la retina y, en algunos casos, ceguera. La obtención de imágenes in vivo de la retina del ratón por medios no invasivos es vital para la investigación ocular. Sin embargo, dado su pequeño tamaño, la obtención de imágenes del fondo de ojo del ratón es difícil y puede requerir herramientas especializadas, mantenimiento y capacitación. En este estudio, hemos desarrollado un software único que permite el análisis del diámetro de los vasos de la retina en ratones con un programa automatizado escrito en MATLAB. Las fotografías del fondo de ojo se obtuvieron con un sistema comercial de cámara de fondo de ojo después de una inyección intraperitoneal de una solución de sal de fluoresceína. Las imágenes se modificaron para mejorar el contraste, y el programa MATLAB permitió extraer automáticamente el diámetro vascular medio a una distancia predefinida del disco óptico. Los cambios vasculares se examinaron en ratones de tipo salvaje y ratones con varias mutaciones en el gen Mitf mediante el análisis del diámetro de los vasos de la retina. El programa MATLAB desarrollado aquí es práctico, fácil de usar y permite a los investigadores analizar el diámetro medio y el diámetro total medio, así como el número de vasos de la vasculatura de la retina del ratón, de forma cómoda y fiable.

La Figura 1 muestra el proceso utilizado para analizar la vasculatura de la retina, que se aplica a las imágenes de FFA de ratón de todos los ratones probados. Se utiliza un radio dos veces más grande que el disco óptico para medir la intensidad de los píxeles en una dirección circular en el sentido de las agujas del reloj desde el centro del disco óptico. Marca los píxeles con un punto inicial o final cuando se encuentra con puntos por encima y por debajo de un umbral especificado por el us...

La vasculatura de la retina del ratón es particularmente interesante para comprender los mecanismos de formación de patrones vasculares. Este protocolo mide automáticamente el diámetro de los vasos de la retina del ratón a partir de imágenes de fondo de ojo de angiografía fluorescente a una distancia fija del disco óptico.

Medición del diámetro de los vasos retinianos a partir de imágenes de angiografía fluorescente de ratón

It is important to study the development of retinal vasculature in retinopathies in which abnormal vessel growth can ultimately lead to vision loss. ...

Este protocolo proporciona un método fácil y fiable para medir automáticamente el diámetro de los vasos de la retina en ratones anestesiados debido a mutaciones genéticas o enfermedades de la retina. La principal ventaja de esta técnica es que el programa MATLAB escrito a medida es práctico, fácil de usar, cómodo y fiable. Los cambios en el diámetro de los vasos de la retina ocurren comúnmente en enfermedades degenerativas como la RP y otras afecciones vasculares de la retina.Los modelos de ratón ofrecen información sobre la eficacia del tratamiento y su impacto en los vasos de la retina. El método puede ser potencialmente útil como marcadores clínicos cuantificables tras la progresión de los trastornos vasculares en el ojo, y para el seguimiento de posibles tratamientos. Para comenzar, prepare una jeringa con solución de trabajo de fluoresceína y adminístrela por vía intraperitoneal al animal anestesiado y aplique una gota de gel de metilcelulosa al 2% en la superficie corneal.A continuación, coloque al animal en la platina de posicionamiento del sistema de imágenes. Coloque la lente de la cámara del fondo de ojo de la retina para tocar directa y suavemente la córnea del ratón, y ajuste ligeramente la alineación para colocar la cabeza del nervio óptico en el centro del campo visual. A continuación, cambie al canal de fluorescencia verde de la cámara de fondo de ojo y concéntrese en los vasos de la retina para tomar las imágenes.Capture imágenes en los puntos de tiempo deseados después de la inyección de fluoresceína para determinar el punto de tiempo ideal y visualizar la imagen del fondo de ojo con fluoresceína. En primer lugar, abra el programa MATLAB. A continuación, descargue y guarde el diámetro del fondo de ojo.Código M. A continuación, abra la carpeta de análisis de imágenes de fondo de ojo y arrastre y suelte el diámetro del fondo de ojo. m en la carpeta de análisis.Arrastre y suelte una imagen FFA en la carpeta de análisis de imagen. En el programa MATLAB, haga clic dos veces en el archivo de código para activarlo. Seleccione la opción Ejecutar.Aparecerá un menú emergente para seleccionar la imagen. Seleccione la imagen y aparecerá en la pantalla un menú emergente para los parámetros de análisis. Establezca los parámetros de análisis en el menú emergente y pulse OK. Seleccione el centro del disco óptico y, a continuación, seleccione el borde del disco óptico.El análisis se realizará en segundo plano y los resultados del análisis aparecerán en la pantalla. La tabla contiene los valores de media, desviación estándar y error estándar para cada recipiente. Guarde la tabla.Y luego guarde la figura con el grosor medio establecido. Abra la carpeta de análisis con los archivos guardados y, a continuación, abra la figura guardada. Abra la tabla guardada, copie los valores y péguelos en un archivo de Excel.Después de la inyección de fluoresceína, se obtuvieron imágenes de un ratón de control y un ratón MITFMI-VGA9/mutante, para los cuales se midió la distancia más corta desde el centro del disco óptico hasta los puntos finales de los vasos en el sentido de las agujas del reloj. El diámetro medio de los vasos se obtuvo en función del número de vasos para los ratones de tipo salvaje y mutantes. Lo más importante que hay que recordar es la posición de la cámara del fondo de ojo y el centrado del disco óptico en la imagen del fondo de ojo.Además de esta técnica, se pueden realizar técnicas moleculares para explorar nuevos fármacos, diagnosticar diferentes afecciones vasculares en el ojo y comprender mejor el funcionamiento de la vasculatura retiniana.

measuring-retinal-vessel-diameter-from-mouse-fluorescent-angiography

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

La microscopía intravital se puede utilizar en animales para visualizar y medir los diámetros vasculares de la retina, las velocidades del torrente sanguíneo y el flujo sanguíneo total de la retina.

Mediciones de videomicroscopía intravital del flujo sanguíneo de la retina en ratones

El protocolo describe el microensayo corneal como desarrollado en ratones.

El microbolsa Ensayo corneal: un modelo de angiogénesis en el ojo del ratón

Para investigar la permeabilidad de la barrera hematorretiniana y la integridad de la membrana limitante interna en modelos animales de enfermedad de la retina, utilizamos varias variantes de virus adenoasociados (AAV) como herramientas para etiquetar las neuronas de la retina y la glía. La expresión génica reportera mediada por virus se utiliza como indicador de la permeabilidad de la barrera retiniana.

Utilizando adeno-asociado virus como una herramienta para estudiar las barreras de retina en la enfermedad

La retina comparte similitudes importantes con el cerebro y por lo tanto representa una ventana única para el estudio de vasculatura y estructura neuronal en el cerebro no invasiva. Este protocolo describe un método para estudiar la demencia con técnicas de imagen retinianas. Este método puede potencialmente ayudar en la evaluación diagnóstico y riesgo de demencia.

Usando proyección de imagen retiniana para el estudio de la demencia

Muchas enfermedades oculares visión-que amenaza se asocian a microvasos retiniana disfuncional. Por lo tanto, la medición de las respuestas de la arteriola retiniana es importante investigar los mecanismos fisiopatológicos subyacentes. Este artículo describe un protocolo detallado para ratón arteriola retiniana aislamiento y preparación para evaluar los efectos de sustancias vasoactivas en el diámetro vascular.

Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo

Aquí, discutimos un protocolo de método que permita un fácil análisis de la vasculatura retiniana del pez cebra adulto tg(fli:EGFP) como una lectura rápida en entornos de patologías vasculares a largo plazo vinculados a la neoangiogénesis y cambios estructurales.

Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP)

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

Este protocolo describe un método detallado para la preparación y tinción de inmunofluorescencia de ratones montados planos de retina y análisis. El uso de la angiografía con fondo de ojo de fluoresceína (FFA) para crías de ratones y el procesamiento de imágenes también se describen en detalle.

Monitoreo del crecimiento dinámico de los vasos retinianos en un modelo de ratón con retinopatía inducida por oxígeno

Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.

Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Aquí, presentamos tres protocolos de análisis de datos para imágenes de angiografía fluoresceínica (AF) y tomografía de coherencia óptica (OCT) en el estudio de la oclusión de la vena retiniana (OVR).

In vivo Lecturas de lesiones vasculares en la retina del ratón para promover la reproducibilidad

Los pericitos de la vasculatura de la retina se examinaron mediante tinción inmunofluorescente con receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β después de la inyección retroorbitaria de lectina fluorescente de tomate. La retina marcada se trató posteriormente con el método de limpieza de tejidos y se montó completa para visualizar las vistas tridimensionales de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina bajo un microscopio confocal.

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción 

Aprende a medir el diámetro de vasos retinianos en ratones anestesiados mediante angiografía fluorescente y un programa MATLAB personalizado. Este método automatizado permite estudiar enfermedades vasculares oculares y evaluar tratamientos.

Medición del diámetro de los vasos retinianos a partir de imágenes de angiografía fluorescente de ratón

Explorar más videos