Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos dérmicos primarios a partir de tejido queloide humano
28 de julio de 2023
Este estudio describe un protocolo optimizado para establecer fibroblastos primarios a partir de tejidos queloides que puedan proporcionar fibroblastos puros y viables de manera efectiva y constante.
El aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios derivados del tejido queloide son la base para futuros estudios de queloides. Los fibroblastos del tejido queloide se pueden adquirir fácilmente a través de este protocolo, que puede proporcionar una fuente abundante y estable de células en el laboratorio para la investigación de queloides. Comience usando pinzas estériles para colocar el tejido queloide en un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros que contenga de 10 a 25 mililitros de PBS suplementado con PSA al 1%.
Mientras tanto, agregue cuatro mililitros de solución de PBS PSA a cada pocillo de una placa de seis pocillos. Ahora saque el pañuelo del tubo y lávese dos veces con la solución PBS PSA. Con un par de pinzas estériles, transfiera el tejido secuencialmente de un pocillo a otro.
A continuación, retire las capas adiposa y de la epidermis con unas tijeras quirúrgicas, dejando la dermis intacta. Use un par de tijeras para diseccionar la dermis recortada en trozos de tres a cinco milímetros cuadrados y transfiera los trozos al siguiente pocillo con un par de pinzas estériles. Lave las piezas en una solución de PSA de PBS.
Con pinzas esterilizadas, coloque de 10 a 30 piezas de tejido dérmico espaciadas a menos de cinco milímetros de distancia en placas de Petri. Coloque los platos boca abajo en una incubadora hasta que los trozos se sequen y se peguen al plato. A continuación, agregue siete mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de PSA, e incube las placas como antes.
Después de tres días, reemplace la mitad del sobrenadante con medio de cultivo completo. Observe los fibroblastos diariamente con un aumento microscópico de 40X. Retirar los trozos de tejido en el medio de cultivo cuando los fibroblastos alcancen el 90% de confluencia.
Lavar los fibroblastos en PBS y añadir dos mililitros de solución estéril de tripsina EDTA. Después de incubar las células en una incubadora humidificada, golpee suavemente la placa de cultivo y obsérvela bajo el microscopio. Agregue dos mililitros de medio completo para terminar la digestión una vez que la mayoría de las células se hayan desprendido.
Ahora transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros y centrifugue el tubo a 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender el gránulo celular en medio completo. Siembre los fibroblastos en una placa de cultivo celular de nueve centímetros e incube en una incubadora humidificada.
Para realizar el análisis inmunofluorescente después de cultivar los fibroblastos en cubreobjetos redondos e incubarlos en anticuerpos primarios y secundarios, agregue 50 microlitros de solución de DAPI al portaobjetos de vidrio para teñir los núcleos celulares. Coloque los cubreobjetos lavados en portaobjetos de vidrio con pinzas. Finalmente, transfiera las muestras a una caja oscura húmeda para microscopía fluorescente.
Se observaron excrecencias de fibroblastos en el tejido a los cinco días después del procesamiento. Los fibroblastos mostraron altas tasas de proliferación y alcanzaron la confluencia después de 10 días. Los fibroblastos tenían cuerpos celulares alargados y fusiformes, que estaban alineados en haces a alta confluencia.
La tinción inmunofluorescente arrojó resultados positivos para la inmunofluorescencia roja de los fibroblastos y la inmunofluorescencia azul del núcleo celular. Los ensayos de citometría de flujo mostraron positividad para CD90 en casi todos los fibroblastos. Este estudio ha descrito un método optimizado y ha proporcionado instrucciones claras para resolver los desafíos existentes y aumentar las posibilidades de éxito para el aislamiento y cultivo de fibroblastos queloides.
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Descripción general
Este estudio describe un protocolo optimizado para establecer fibroblastos primarios a partir de tejidos queloides que puede proporcionar de forma eficaz y estable fibroblastos puros y viables. El aislamiento y cultivo de estos fibroblastos es esencial para avanzar en la investigación sobre queloides.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Cultivo celular
- Aislamiento de fibroblastos
- Investigación sobre queloides
Antecedentes
- Los queloides son cicatrices anormales que pueden ser difíciles de estudiar.
- Los fibroblastos primarios son fundamentales para comprender la biología de los queloides.
- Los protocolos existentes pueden no proporcionar viabilidad celular suficiente.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar el proceso de aislamiento.
Objetivo del estudio
- Establecer un método confiable para aislar fibroblastos de tejidos queloides.
- Proporcionar una fuente estable de fibroblastos para la investigación en laboratorio.
- Mejorar la comprensión de la formación y el tratamiento de las queloides.
Métodos Utilizados
- Uso de pinzas estériles y tubos de centrífuga para el manejo de tejidos.
- Lavado del tejido queloidal con PBS suplementado con 1% de PSA.
- Transferencia secuencial del tejido entre pocillos en una placa de seis pocillos.
- Establecimiento de condiciones de cultivo para el crecimiento de fibroblastos.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de fibroblastos viables a partir de tejidos queloides.
- El protocolo proporciona una fuente abundante de células para la investigación.
- Los fibroblastos mantuvieron estabilidad y viabilidad a lo largo del tiempo.
- Posibilitó estudios adicionales sobre la biología de los queloides.
Conclusiones
- El protocolo optimizado es eficaz para el aislamiento de fibroblastos.
- Proporciona una base para futuras investigaciones sobre queloides.
- Mejora el potencial de avances terapéuticos en el tratamiento de queloides.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento y cultivo confiable de fibroblastos dérmicos primarios a partir de tejido queloide aborda una necesidad crítica de modelos celulares relevantes para la enfermedad en la fase inicial del descubrimiento de fármacos. Este protocolo permite un acceso constante a poblaciones puras y validadas de fibroblastos, apoyando estudios mecanicistas y la validación de dianas terapéuticas para trastornos dérmicos fibrosos. El enfoque mejora la confianza predictiva y la continuidad traslacional en las pruebas de hipótesis terapéuticas dentro de las carteras de investigación sobre queloides.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las vías impulsadas por fibroblastos implicadas en la patogénesis de los queloides.
- Apoya la desestimación biológica al proporcionar células primarias validadas funcionalmente.
- Facilita estudios mecanicistas para aclarar la relevancia del blanco en enfermedades fibróticas.
- Mejora la confianza predictiva para decisiones tempranas de triaje de cartera.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una fuente reproducible de fibroblastos primarios para la estandarización de ensayos.
- Permite el desarrollo de ensayos cuantitativos basados en células para la evaluación de compuestos.
- Facilita la reproducibilidad y escalabilidad en los flujos de trabajo de cribado.
- Reduce la variabilidad al minimizar la contaminación y la mezcla de células no fibroblásticas.
Investigación Translacional y Preclínica
- Alinea modelos in vitro con tipos celulares humanos relevantes para enfermedades en estudios traslacionales.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica en la investigación de queloides.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de candidatos anti-fibróticos.
- Proporciona una plataforma para el descubrimiento y validación de biomarcadores cuando se cuenta con estudios posteriores de apoyo.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
Este protocolo sitúa el aislamiento de fibroblastos queloides primarios en la intersección entre el descubrimiento inicial y la investigación preclínica, permitiendo una validación sólida de dianas y el desarrollo de ensayos para líneas de investigación de enfermedades dérmicas fibróticas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis y la aclaración de vías en la patogénesis del queloide.
- Selección: Proporciona sistemas celulares validados y reproducibles para el desarrollo de ensayos cuantitativos.
- Análisis: Permite la caracterización basada en inmunofluorescencia y citometría de flujo para confirmar la identidad celular.
- Investigación Traducional: Ofrece modelos celulares relevantes para la enfermedad, útiles en la evaluación preclínica de terapias candidatas.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo estandarizado adaptable entre equipos de investigación y proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de queloides.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los protocolos con células primarias.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital en programas de fase inicial.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos anti-fibróticos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo estéril de tejidos y técnicas de cultivo celular primario.
- Necesita acceso a instalaciones de cultivo celular, inmunofluorescencia y equipos de citometría de flujo.
- Exige estandarización entre equipos para el aislamiento y caracterización reproducible de células.
- Puede requerir adaptaciones para otras fuentes de tejido fibrotico o dérmico.
- Entre las limitaciones potenciales se incluyen la variabilidad entre donantes y la disponibilidad de tejido.
