Name: Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos dérmicos primarios a partir de tejido queloide humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Aprende a aislar y cultivar fibroblastos dérmicos primarios a partir de tejido queloide humano. Este protocolo optimizado proporciona células viables y puras para avanzar en la investigación de queloides y comprender su biología celular.

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Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 81903189 y 82073418) y de la Fundación de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (subvención número 202102020025).

Este estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional del Hospital de Dermatología de la Universidad Médica del Sur (2020081). Se obtuvo el consentimiento informado del paciente antes de que se recolectaran tejidos de los individuos.
1. Preparación
NOTA: Los siguientes procedimientos deben realizarse en un ambiente estéril bajo una cabina de seguridad biológica.
<ol><li>Prepare un medio de cultivo completo añadiendo suero fetal bovino (FBS) al 10 % y solución de penicilina, estreptomicina y anfotericina B (PSA) al medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa.</li>
	<li>Prepare una solución salina tamponada con fosfato (PBS) con PSA agregando PSA al 1% en 1x PBS. Prepare PBS con FBS agregando 1% de FBS a 1x PBS.</li>
	<li>Prepare varias tijeras, pinzas y bisturíes esterilizados en autoclave.</li>
</ol>2. Obtención de tejidos extraídos
<ol><li>Obtener tejidos de pacientes queloides a través de cirugía. Recoja los tejidos queloides frescos en una bolsa de embalaje estéril o en un tubo de centrífuga estéril y transfiéralos a un gabinete de seguridad biológica en el laboratorio lo antes posible. NOTA: En este protocolo, el tamaño del tejido queloide adquirido fue de aproximadamente ~20 x 20 x 10 mm3, y el tamaño puede variar dependiendo de la cirugía.</li>
</ol>3. Aislamiento
<ol><li>Extraiga el tejido queloide con pinzas estériles y colóquelo en un tubo de centrífuga estéril de 50 ml que contenga 10-25 ml de PBS con PSA al 1% durante 10 min. Luego, prepare una placa de 6 pocillos y agregue 4 ml de PBS suplementado con PSA al 1% a cada pocillo. Saque el pañuelo con pinzas esterilizadas y lávelo dos veces con PBS suplementado con PSA al 1%. Con pinzas estériles, transfiera el tejido secuencialmente de un pocillo a otro.</li>
	<li>Retire las capas adiposas y de la epidermis con unas tijeras quirúrgicas o un bisturí quirúrgico y deje intacta la capa de la dermis. Recorte y diseccione la capa dérmica en 2 piezas de 3-5 mm con unas tijeras, transfiera estas piezas conpinzas estériles al siguiente pocillo y lávelas en PBS con una solución de PSA al 1% nuevamente.</li>
</ol>4. Cultura
<ol><li>Coloque los trozos de tejido dérmico en placas de Petri con pinzas esterilizadas; Asegúrese de que el número de piezas esté entre 10 y 30 y que la distancia entre cada pieza sea de >5 mm. Coloque las placas de Petri boca abajo en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 30-60 min hasta que los trozos de tejido se sequen un poco y se peguen a la placa de Petri. A continuación, añadir DMEM suplementado con un 10% de FBS y un 1% de PSA, y colocar con cuidado las placas de Petri en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C. NOTA: Los fibroblastos son una población celular morfológica y funcionalmente heterogénea. Teniendo en cuenta esta complejidad, los pasos de aislamiento y cultivo deben realizarse con cuidado; seleccione las piezas de tejido dérmico queloide de manera uniforme y mezcle bien estas piezas antes de colocarlas en la placa de Petri.</li>
	<li>Después de 3 días, reemplace la mitad del sobrenadante con un medio de cultivo completo. Cambie el medio de cultivo cada 2-3 días. Observe los fibroblastos bajo un microscopio con un aumento de 40x todos los días. NOTA: Todos los pasos deben realizarse suavemente. No mueva la placa de Petri durante 2 días después del aislamiento, ya que las piezas de tejido tardan en adherirse a las placas de Petri.</li>
	<li>Cuando los fibroblastos que crecen alrededor de las piezas de tejido alcancen aproximadamente el 90% de confluencia, retire las piezas de tejido y el medio de cultivo. Lave los fibroblastos con 1x PBS estéril y agregue 2 ml de solución estéril de tripsina-EDTA 1x a las placas. Incubar las células durante aproximadamente ~3-5 min a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 . Golpee suavemente la placa de cultivo y obsérvela bajo un microscopio. Cuando la mayoría de las células se desprendan de la placa, agregue 2 ml de medio completo para finalizar el proceso de digestión.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y centrifugue el tubo a 300 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender el gránulo celular en medio completo. Siembre los fibroblastos en una placa de cultivo celular de 9 cm e incube a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 .</li>
</ol>5. Mantenimiento y conservación
<ol><li>Aproximadamente 3-4 días después, cuando los fibroblastos hayan crecido hasta el 80% de confluencia, repita los pasos 4.2-4.4 y pase los fibroblastos en una proporción de 1:3. Utilice los fibroblastos pasados para realizar más experimentos. NOTA: El cultivo de fibroblastos debe detenerse después de 10 pasadas, ya que las células pueden comenzar a mostrar características modificadas en comparación con las células originales.</li>
	<li>Criopreservar las células transitadas de P1-P3 en nitrógeno líquido para su uso posterior.<ol><li>Repita los pasos 4.2-4.3. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y centrifugue el tubo durante 3 minutos a 300 × g. Deseche el sobrenadante con cuidado, vuelva a suspender el gránulo celular en 1 ml de medio de congelación celular que contenga 90% de FBS y 10% de DMSO, y transfiera la suspensión a criotubos celulares.</li>
		<li>Mueva las células a una caja congelada y luego coloque la caja congelada en un congelador a -80 °C. Después de 1 día, transfiera las células a nitrógeno líquido para su conservación a largo plazo.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Identificación de fibroblastos mediante tinción de inmunofluorescencia
<ol><li>Coloque cubreobjetos redondos en una placa de 24 pocillos y cultive los fibroblastos pasados a una concentración de 1 × 104 células/pocillo. Cuando los fibroblastos alcancen el 60% de confluencia, retire el medio de cultivo. Agregue 1 ml de paraformaldehído al 4% para fijar los fibroblastos durante 20 minutos a temperatura ambiente y lave 3 veces con PBS durante 1 minuto cada vez. NOTA: Cuente el número de células utilizando un portaobjetos de hemocitómetro bajo un microscopio o un contador automático de células.</li>
	<li>Retire el PBS, incube con Triton X-100 al 0,5% durante 20 minutos para la permeabilización de las membranas celulares y luego lave 3 veces con PBS durante 1 minuto cada vez. Añadir PBS con albúmina sérica bovina al 0,5% y remojar durante 30 min. A continuación, retíralo y añade el anticuerpo PDGFR-α/vimentina diluido en diluyente de anticuerpos a 1:1.000. Incubar durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, retire el anticuerpo primario, lave las células 3 veces con PBS durante 3 minutos y agregue el anticuerpo secundario Alexa Fluor-555 cabra anti-conejo IgG diluido con diluyente de anticuerpos a 1:200 para remojar durante 1 h.</li>
	<li>Retire el anticuerpo secundario y lave las células 3 veces con PBS. Saque los cubreobjetos redondos con fórceps, colóquelos en portaobjetos de vidrio y agregue 50 μL de solución de 5 μg/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para teñir los núcleos celulares. Mantenga las muestras en una caja húmeda y oscura y obsérvelas bajo un microscopio láser de fluorescencia confocal. NOTA: Agregue un grupo de control negativo sin un anticuerpo primario pero con un anticuerpo secundario para excluir la tinción inespecífica.</li>
</ol>7. Identificación de fibroblastos por citometría de flujo
<ol><li>Recoja el gránulo de celda en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml y vuelva a suspender con 50 μl de PBS que contenga 1% de FBS. Incubar con anti-CD90 durante 30 min en la oscuridad y añadir un control de isotipo anti-IgG al grupo de control. A continuación, añadir 200 μL de PBS que contenga un 1% de FBS y centrifugar el tubo durante 10 min a 300 × g a 4 °C.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y agregue 200 μL de PBS que contenga 1% de FBS. Vuelva a suspender y filtre la suspensión a través de un colador de celdas (malla 70). Agregue una solución madre de 5 μg/mL de DAPI a 1:100 al filtrado y luego adquiera los resultados por citometría de flujo. Establezca la dispersión directa (FSC) como la abscisa y la dispersión lateral (SSC) como la ordenada, y encierre en un círculo la población de células principal. Seleccione la población celular y establezca la ficoeritrina como la abscisa y el recuento como la ordenada para el análisis.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).</li>
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<li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733(2022).</li>
<li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li>
<li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+regulates+cell+growth%2C+apoptosis%2C+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+%28TGF-beta%29%2FSMAD+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li>
<li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+explant+culture%3A+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815(2021).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+PDGFR%CE%B1+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).</li>
<li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).</li>
<li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li>
</ol>

No hay conflictos de intereses que declarar.

La obtención de fibroblastos primarios a partir de tejidos queloides es una base fundamental para futuras investigaciones. Hasta el momento, existen dos métodos para la adquisición de fibroblastos primarios: la digestión enzimática y el cultivo de explantes11,12,13,14. Sin embargo, ambos métodos tradicionales tienen limitaciones, como la susceptibilidad a la contaminación, la mezcla con otros t...

El queloide, una enfermedad fibroproliferativa, se manifiesta como el crecimiento continuo de placas que a menudo invaden la piel normal circundante sin autolimitación y causan diversos grados de picazón, dolor y cargas cosméticas y psicológicas para los pacientes1. Los fibroblastos, las principales células implicadas en los queloides, desempeñan un papel esencial en la formación y desarrollo de esta enfermedad a través de la proliferación excesiva, la producción redundante de matriz extracelular y el desorden de los colágenos 2,3. Sin embargo, la patogenia subyacente sigue sin estar clara y aún no existe un método terapéutico eficaz para el queloide; Por lo tanto, existe una necesidad urgente de más investigación 4,5.
Dado que no existe un modelo animal ideal para la investigación de queloides in vivo 6,7, la construcción de un modelo in vitro mediante la adquisición de fibroblastos primarios de tejidos queloides puede ofrecer viabilidad y fiabilidad para la investigación de queloides 2,6. Las células primarias son aquellas derivadas directamente de tejidos vivos, y generalmente se reconoce que estas células pueden parecerse más al estado fisiológico y al fondo genético de múltiples individuos en comparación con las líneas celulares 8,9. El cultivo de células primarias proporciona un medio poderoso para estudiar el crecimiento y el metabolismo de las células, así como otros fenotipos celulares.
En la actualidad, existen dos métodos para la adquisición de fibroblastos primarios: la digestión enzimática y el cultivo de explantes. Sin embargo, se han identificado varios obstáculos para la obtención de fibroblastos primarios, como el riesgo de contaminación por diversas bacterias u hongos, la mezcla con otros tipos de células que no se eliminan fácilmente, el largo período del ciclo de cultivo, los cambios posteriores en las características celulares en comparación con las células originales, etc.9. Por lo tanto, el desarrollo de un proceso factible y eficaz para la obtención de fibroblastos primarios es la base para futuros estudios y aplicaciones. Este estudio describe un protocolo optimizado para extraer fibroblastos primarios de tejidos queloides que pueden proporcionar fibroblastos puros y viables de manera efectiva y constante.

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL</td><td>JETBIOFIL</td><td>CFT002015</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga estéril de 15 mL</td><td>JETBIOFIL</td><td>8076</td><td></td></tr><tr><td>4% de poliformaldehído</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0099</td><td>Fijación celular</td></tr><tr><td>tubo de centrífuga estéril de 50 mL</td><td>JETBIOFIL</td><td>8081</td><td>Poner tejido queloide</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-555 cabra anti-conejo IgG&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>Alexa&nbsp; Fluor&nbsp; 555 y nbsp;</td><td>Segundo anticuerpo para el ensayo de tinción de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Anti humano CD90</td><td>BioLegend</td><td>B301002</td><td>Identificar la pureza de los fibroblastos Diluyente de</td></tr><tr><td>anticuerpos</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0262</td><td></td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 serie A2</td><td>Células de aislamiento y cultivo</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>B265993</td><td></td><td>Bloqueo para el ensayo de tinción de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Incubadora de dióxido de carbono</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td>Uso para el cultivo de células</td></tr><tr><td>Criotubos celulares</td><td>Corning</td><td>43513</td><td>Almacene las células en la</td></tr><tr><td>máquina centrífuga</td> de baja temperatura <td>Thermo Fisher</td><td>ST 16R</td><td>Descartar sobrenadante&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C1006</td><td>Teñir el núcleo celular</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP Biomedicals</td><td>196055</td><td>Uso para la conservación</td></tr><tr><td>de células Medio de águila modificado de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Solución de medio de cultivo</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>BI</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD</td><td>BD FACSCelesta</td><td>Observación la identidad de las células</td></tr><tr><td>caja congelada</td><td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp; 5100-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal láser</td><td>Nikon</td><td>AIR-HD25</td><td>Observación del ensayo de tinción de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>PDGFR-&alpha; anticuerpo</td><td>CST</td><td>3174T</td><td>Primer anticuerpo para el ensayo de tinción de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina-Am</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td>Añadir en la solución del medio de cultivo para evitar la contaminación</td></tr><tr><td>placa de Petri</td><td>JETBIOFIL</td><td>7556</td><td>Fibroblastos</td></tr><tr><td>de cultivo Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Solución de medio de cultivo</td></tr><tr><td>Conejo (DAIE) mAB IgG XR (R) Control de isotuge (PE)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>5742S</td><td>Como control para citometría</td></tr><tr><td>de flujo Cubreobjetos redondos</td><td>Biosharp</td><td>801007</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td>Perforaciones en la membrana celular</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Se utiliza para el paso de células</td></tr><tr><td>Anticuerpo de vimentina</td><td>Abcam</td><td>ab8978</td><td>Primer anticuerpo para el ensayo de tinción de inmunofluorescencia</td></tr></tbody></table>

aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos dérmicos primarios a partir de tejido queloide humano

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Los fibroblastos, el principal tipo de célula en el tejido queloide, juegan un papel esencial en la formación y desarrollo de los queloides. El aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios derivados del tejido queloide son la base para futuros estudios de la función biológica y los mecanismos moleculares de los queloides, así como nuevas estrategias terapéuticas para su tratamiento. El método tradicional de obtención de fibroblastos primarios tiene limitaciones, como el mal estado celular, la mezcla con otros tipos de células y la susceptibilidad a la contaminación. En este trabajo se describe un protocolo optimizado y fácilmente reproducible que podría reducir la aparición de posibles problemas a la hora de obtener fibroblastos. En este protocolo, los fibroblastos se pueden observar 5 días después del aislamiento y alcanzan casi el 80% de confluencia después de 10 días de cultivo. A continuación, los fibroblastos se hacen pasar y se verifican utilizando anticuerpos PDGFRα y vimentina para ensayos de inmunofluorescencia y anticuerpos CD90 para citometría de flujo. En conclusión, los fibroblastos del tejido queloide se pueden adquirir fácilmente a través de este protocolo, lo que puede proporcionar una fuente abundante y estable de células en el laboratorio para la investigación de queloides.

La cronología del protocolo se resume en la Figura 1A. En la Figura 2 se muestran algunas imágenes representativas del proceso de aislamiento; las capas de epidermis y adiposa se eliminaron cuidadosamente, y la capa de dermis se separó en pequeños fragmentos de 3-4mm2, que se inocularon en las placas de Petri.
Como se muestra en la Figura 3A, se observaron varias excrecencias de fibroblasto...

Este estudio describe un protocolo optimizado para establecer fibroblastos primarios a partir de tejidos queloides que puedan proporcionar fibroblastos puros y viables de manera efectiva y constante.

Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos dérmicos primarios a partir de tejido queloide humano

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

El aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios derivados del tejido queloide son la base para futuros estudios de queloides. Los fibroblastos del tejido queloide se pueden adquirir fácilmente a través de este protocolo, que puede proporcionar una fuente abundante y estable de células en el laboratorio para la investigación de queloides. Comience usando pinzas estériles para colocar el tejido queloide en un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros que contenga de 10 a 25 mililitros de PBS suplementado con PSA al 1%.Mientras tanto, agregue cuatro mililitros de solución de PBS PSA a cada pocillo de una placa de seis pocillos. Ahora saque el pañuelo del tubo y lávese dos veces con la solución PBS PSA. Con un par de pinzas estériles, transfiera el tejido secuencialmente de un pocillo a otro.A continuación, retire las capas adiposa y de la epidermis con unas tijeras quirúrgicas, dejando la dermis intacta. Use un par de tijeras para diseccionar la dermis recortada en trozos de tres a cinco milímetros cuadrados y transfiera los trozos al siguiente pocillo con un par de pinzas estériles. Lave las piezas en una solución de PSA de PBS.Con pinzas esterilizadas, coloque de 10 a 30 piezas

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Una forma rápida y robusta de aislar células viables de adultos epiteliales madre de la piel humana se describe. El método utiliza la digestión enzimática de la matriz de colágeno la piel, seguido por el punteo de los folículos pilosos y el aislamiento de las suspensiones de células individuales o fragmentos de tejido para el cultivo celular.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas epiteliales de la piel humana

El explante protocolo de cultivo de fibroblastos humanos de biopsias punch de piel es una manera técnicamente robusta y sencilla de obtener células de la piel dentro de 4-8 semanas para la banca de unos 15-20 millones de células en un número bajo pasaje.

Piel biopsia en sacabocados explante cultura para Derivación de fibroblastos humanos primarios

Este video muestra un protocolo para aislar y cultivar células de Schwann de tejidos de dermis humana. La dermis humana contiene varios tipos de células, incluidos fibroblastos y células de Schwann. Después del aislamiento, las células se tratan con un agente antimitótico para eliminar los fibroblastos proliferantes, lo que da como resultado un cultivo puro de células de Schwann.

Aislamiento y cultivo de células primarias de Schwann a partir de una dermis humana

Se presenta un método para aislar precursoras derivadas de la piel (SKP) células multipotentes ingenuos de cultivos de fibroblastos humanos primarios. Se demuestra que estos SKPs derivados de cultivos de fibroblastos comparten propiedades de células madre similares a los obtenidos directamente a partir de biopsias de piel humana. Estas células expresan el marcador de la cresta neural, nestina, además de los marcadores multipotentes, tales como Oct4 y Nanog.

Naïve Adult Stem Cells Aislamiento de Primaria cultivos de fibroblastos humanos

El comportamiento de los fibroblastos subyace en un espectro de entidades clínicas, pero siguen estando mal caracterizadas, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. La investigación tradicional de fibroblastos se basa en la manipulación in vitro, enmascarando el comportamiento de los fibroblastos in vivo. Describimos un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de piel de ratón que no requiere cultivo celular.

Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

Aquí presentamos un protocolo para aislar eficientemente keratinocytes humanos primarios de tejidos de la piel adulta. Este método simplifica el procedimiento convencional mediante el uso de la Y-27632 del inhibidor de la roca en el medio de inoculación separar espontáneamente las células epidérmicas de las células cutáneas.

Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel

Este manuscrito describe un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana. Elude la cultura in vitro que era inevitable con el protocolo de aislamiento de uso común a través de culturas explantes. Los subconjuntos de fibroblastos que emanan son funcionalmente distintos y muestran la expresión génica diferencial y la localización dentro de la dermis.

Aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana mediante la clasificación celular activada por fluorescencia

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de queratinocitos orales derivados del paladar del ratón adulto. También se informa de un método de evaluación mediante inmunotinción.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos orales primarios del paladar del ratón adulto

Este artículo describe un método basado en el cultivo de explantes para el aislamiento y cultivo de células primarias del músculo liso aórtico humano específico del paciente y fibroblastos dérmicos. Además, se presenta un nuevo método para medir la contracción celular y el análisis posterior, que se puede utilizar para estudiar las diferencias específicas del paciente en estas células.

Aislamiento de células primarias del músculo liso aórtico específicas del paciente y mediciones semicuantitativas de contracción en tiempo real in vitro

El estudio de la cicatrización de heridas asociada con la lesión musculoesquelética a menudo requiere la evaluación de las interacciones in vitro entre las células de Schwann (SC), los queratinocitos y los fibroblastos. Este protocolo describe el aislamiento, cultivo y caracterización de estas células primarias del prepucio humano.

Aislamiento, cultivo y caracterización de células primarias de Schwann, queratinocitos y fibroblastos del prepucio humano

Aprende a aislar y cultivar fibroblastos dérmicos primarios a partir de tejido queloide humano. Este protocolo optimizado proporciona células viables y puras para avanzar en la investigación de queloides y comprender su biología celular.

Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos dérmicos primarios a partir de tejido queloide humano

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