Name: En imágenes in situ del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Aprende a realizar imágenes in situ del timo de ratón mediante microscopía de dos fotones para estudiar la migración celular y los mecanismos de selección de linfocitos T en investigación inmunológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Damos las gracias a Matt Pablo y Jimmy Wu para la asistencia técnica.

Transferencia adoptiva Inyectar los recién nacidos con 50 100 ul de la médula ósea con una jeringa de insulina 4.2 veces durante los primeros 3-7 días de vida, con un final de donantes-a-host proporción de 1:1. Aspirar a un sitio de la inyección por debajo del esternón y las costillas, pero por encima de los intestinos y el estómago. Inserte la aguja lo suficiente como para penetrar en el peritoneo, cuidado de no perforar la membrana. No es raro que algunos de la médula ósea que se pierde durante la inyección. Usted puede reducir la pérdida al aflojar el control sobre el cachorro a medida que se inyecta con el fin de permitir que la piel se expanda y, a continuación, extraer lentamente la aguja. La disección del timo Hacer una incisión a través de la línea media y cortar o rasgar la piel dejando al descubierto la caja torácica. Mantenerse en el esternón y el corte a través del peritoneo y el diafragma. Corte a los lados de la caja torácica para revelar la cavidad torácica. El timo se encuentra en la parte superior del corazón. A fin de preservar la estructura del timo, se aferran a los tejidos circundantes como diseccionar el timo. Enjuague el timo con PBS para evitar que se seque durante la disección. Suavemente se burlan de lejos el exceso de tejido en la superficie de la cápsula del timo y dividir en dos los dos lóbulos. Preparación de tejidos para imágenes Use adhesivo tisular veterinaria para pegar el timo no a un cubreobjetos cuadrado. Use un pipetteman poner una fracción de un microlitro de adhesivo. Separar el pegamento a la duración aproximada y el ancho de la timo. Constante el timo contra el cubreobjetos y se arrastra en su lugar. De dos fotones de imágenes El tejido se sumerge en DMEM sin rojo fenol que es perfundido con un 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono y se calienta a 37 ° C. Excitación de dos fotones se logró mediante una Spectra-Physics Maitai láser sintonizado a 900 nm, y de la PPC, GFP, YFP y Texas luz roja de emisión se separan mediante un 495, 515, 560 espejos dicroicos y recolectados a través de detectores de PMT.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Imágenes de dos fotones en el timo que nos permite examinar en la vida, órganos intactos las interacciones y las migraciones que subyacen a los eventos de selección en el timo.

en imágenes in situ del timo de ratón utilizando 2-photon microscopía

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Microscopía de dos fotones (TPM) permite a la imagen de fondo en el timo y documentar los eventos que son importantes para el desarrollo de los timocitos. Para seguir la migración de personas entre una multitud de timocitos, generamos quimeras neonatal, donde se obtienen menos de uno por ciento de los timocitos de un donante que es transgénico para una proteína fluorescente doquier expresar. Para generar estas quimeras hematopoyéticas parcial, los beneficiarios neonatal son inyectados con médula ósea de 3-7 días de edad. Después de 4-6 semanas, el ratón es sacrificado y el timo se seccionó en forma cuidadosa y bissected conservando la arquitectura del tejido que se va a examinar. El timo está pegado a un cubreobjetos en preparación para la ex vivo de imágenes de TPM. Durante la exploración del timo se mantiene en DMEM sin rojo fenol que es perfundido con un 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono y se calienta a 37 ° C. Con este enfoque, podemos estudiar los eventos necesarios para la generación de un repertorio de células T diferentes.

Se presenta paso a paso las instrucciones para la generación de quimeras neonatal, así como la disección y preparación de la timo para la ex vivo de imágenes de 2-fotones microscopía.

En imágenes in situ del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopía

La microscopía de dos fotones (TPM) nos permite obtener imágenes a gran profundidad del timo y documentar los eventos que son importantes para el desarrollo de los timocitos. Para seguir el...

La imagenología de dos fotones es útil para la inmunología porque nos permite seguir la migración de una sola célula mientras encuentra su entorno. Al seguir la migración en el sitio tímico, mediante microscopía de dos fotones podemos caracterizar el mecanismo de selección positiva y negativa.Hola, soy Ina Lottie del laboratorio de la doctora Ellen Roby en la Universidad de California en Berkeley. Y yo soy Paul Herzmark, también del laboratorio de Ellen Roby. Hoy les mostraremos cómo realizamos imágenes in situ de tejido tímico, y yo les mostraré cómo podemos usar nuestro microscopio de dos fotones para obtener imágenes del timo.Y les mostraré los pasos previos a la obtención de imágenes mediante microscopía de dos fotones. Esto incluye los siguientes procedimientos: aislamiento de células madre hematopoyéticas de la médula ósea, transferencia adoptiva de células de la médula ósea a neonatos, disección y bisecado del timo, y preparación del tejido para la obtención de imágenes mediante microscopía de barrido con láser de dos fotones. Así que comencemos.Antes de poder preparar el timo para la obtención de imágenes, primero debemos transferir células de la médula ósea de forma adopti

in-situ-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

De dos fotones de imágenes ha descubierto la motilidad de linfocitos y las interacciones celulares en el ganglio linfático en condiciones basales y durante una respuesta inmune 1. En este caso, se demuestra la transferencia adoptiva de células T, el aislamiento de los ganglios linfáticos, y la motilidad de imágenes de células CD4 + T en los ganglios linfáticos explantados.

La disección y 2-Photon imagen de los ganglios linfáticos periféricos en ratones

Se describe un método para visualizar repetidamente microglia murina y los monocitos...

Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación

Hemos desarrollado nuevas herramientas de laboratorio y protocolos para la adquisición de imágenes intravital del timo. Nuestra técnica debería ayudar en la identificación de "nichos" en el timo en el desarrollo de células T se produce.

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Las imágenes de lapso de tiempo en el animal vivo proporcionan información valiosa sobre la reorganización estructural en el cerebro intacto. Aquí, presentamos una preparación de cráneo adelgazado que permite la obtención de imágenes transcraneales de estructuras sinápticas marcadas con fluorescencia en la corteza del ratón vivo mediante microscopía de dos fotones.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

El objetivo del protocolo es mostrar longitudinal intravital seguimiento en tiempo real de los timocitos por microscopía en implantes tímicos en la cámara anterior del ojo de ratón del laser. La transparencia de la córnea y la vascularización del injerto permiten grabar continuamente reclutamiento de células progenitoras y salida de células T madura.

Seguimiento en Vivo de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real

En este estudio, presentamos un protocolo para realizar dos fotones intravital proyección de imagen y de la célula análisis de interacción en la mucosa traqueal murina después de la infección con virus de la gripe. Este Protocolo será relevante para los investigadores que estudian la dinámica celular inmune durante las infecciones respiratorias.

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

Los cambios morfológicos ocurren en las células de fibroblastos inmune sensibles después de la activación y promueven alteraciones en el reclutamiento celular. Utilización de imágenes de 2 fotones junto con una proteína específica de fibroblastos de ingeniería genética 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) línea de ratón y verde fluorescently etiquetado lipopolysaccharide-FITC, podemos ilustrar la absorción altamente específica de lipopolisacárido en fibroblastos dérmicos y cambios...

In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

El presente protocolo describe un procedimiento de radiología intervencionista establecido para la inyección intratímica en ratones para evitar el riesgo de cirugía abierta y mejorar la precisión de las inyecciones percutáneas ciegas.

Una técnica mínimamente invasiva, precisa y eficiente para la inyección intratímica en ratones

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes intravitales del pulmón izquierdo del ratón trasplantado utilizando microscopía de dos fotones. Esto representa una herramienta valiosa para estudiar la dinámica celular y las interacciones en tiempo real después del trasplante de pulmón murino.

Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado

Este protocolo contiene una descripción detallada de un enfoque paso a paso para un modelo ratón de ventana craneal crónica y embolia microvascular, optimizado para la imagen in vivo de microscopía de dos fotones utilizando microesferas fluorescentes de poliestireno.

Modelo de Ratón de Embolia Microvascular para Microscopía de Dos Fotones In Vivo usando Microsferas de Poliestireno Fluorescente

Este estudio presenta un enfoque in vivo de imagen de dos fotones para visualizar las estructuras de terminales axonales de mecanorreceptores de bajo umbral (LTMR) en la piel de la pata delantera de ratones. Utilizando imágenes repetidas y de alta resolución de axones individuales, este método proporciona una nueva plataforma para estudiar la estructura y función del circuito sensorial cutáneo durante el desarrollo y en adultos.

Imagen intravital de dos fotones de la morfología del axón sensorial táctil en piel de ratón

Aprende a realizar imágenes in situ del timo de ratón mediante microscopía de dos fotones para estudiar la migración celular y los mecanismos de selección de linfocitos T en investigación inmunológica.

En imágenes in situ del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopía

Explorar más videos