Name: En imágenes in situ del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Aprende a realizar imágenes in situ del timo de ratón mediante microscopía de dos fotones para estudiar la migración celular y los mecanismos de selección de linfocitos T en investigación inmunológica.

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Damos las gracias a Matt Pablo y Jimmy Wu para la asistencia técnica.

Transferencia adoptiva Inyectar los recién nacidos con 50 100 ul de la médula ósea con una jeringa de insulina 4.2 veces durante los primeros 3-7 días de vida, con un final de donantes-a-host proporción de 1:1. Aspirar a un sitio de la inyección por debajo del esternón y las costillas, pero por encima de los intestinos y el estómago. Inserte la aguja lo suficiente como para penetrar en el peritoneo, cuidado de no perforar la membrana. No es raro que algunos de la médula ósea que se pierde durante la inyección. Usted puede reducir la pérdida al aflojar el control sobre el cachorro a medida que se inyecta con el fin de permitir que la piel se expanda y, a continuación, extraer lentamente la aguja. La disección del timo Hacer una incisión a través de la línea media y cortar o rasgar la piel dejando al descubierto la caja torácica. Mantenerse en el esternón y el corte a través del peritoneo y el diafragma. Corte a los lados de la caja torácica para revelar la cavidad torácica. El timo se encuentra en la parte superior del corazón. A fin de preservar la estructura del timo, se aferran a los tejidos circundantes como diseccionar el timo. Enjuague el timo con PBS para evitar que se seque durante la disección. Suavemente se burlan de lejos el exceso de tejido en la superficie de la cápsula del timo y dividir en dos los dos lóbulos. Preparación de tejidos para imágenes Use adhesivo tisular veterinaria para pegar el timo no a un cubreobjetos cuadrado. Use un pipetteman poner una fracción de un microlitro de adhesivo. Separar el pegamento a la duración aproximada y el ancho de la timo. Constante el timo contra el cubreobjetos y se arrastra en su lugar. De dos fotones de imágenes El tejido se sumerge en DMEM sin rojo fenol que es perfundido con un 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono y se calienta a 37 ° C. Excitación de dos fotones se logró mediante una Spectra-Physics Maitai láser sintonizado a 900 nm, y de la PPC, GFP, YFP y Texas luz roja de emisión se separan mediante un 495, 515, 560 espejos dicroicos y recolectados a través de detectores de PMT.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Imágenes de dos fotones en el timo que nos permite examinar en la vida, órganos intactos las interacciones y las migraciones que subyacen a los eventos de selección en el timo.

en imágenes in situ del timo de ratón utilizando 2-photon microscopía

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Microscopía de dos fotones (TPM) permite a la imagen de fondo en el timo y documentar los eventos que son importantes para el desarrollo de los timocitos. Para seguir la migración de personas entre una multitud de timocitos, generamos quimeras neonatal, donde se obtienen menos de uno por ciento de los timocitos de un donante que es transgénico para una proteína fluorescente doquier expresar. Para generar estas quimeras hematopoyéticas parcial, los beneficiarios neonatal son inyectados con médula ósea de 3-7 días de edad. Después de 4-6 semanas, el ratón es sacrificado y el timo se seccionó en forma cuidadosa y bissected conservando la arquitectura del tejido que se va a examinar. El timo está pegado a un cubreobjetos en preparación para la ex vivo de imágenes de TPM. Durante la exploración del timo se mantiene en DMEM sin rojo fenol que es perfundido con un 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono y se calienta a 37 ° C. Con este enfoque, podemos estudiar los eventos necesarios para la generación de un repertorio de células T diferentes.

Se presenta paso a paso las instrucciones para la generación de quimeras neonatal, así como la disección y preparación de la timo para la ex vivo de imágenes de 2-fotones microscopía.

En imágenes in situ del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopía

La microscopía de dos fotones (TPM) nos permite obtener imágenes a gran profundidad del timo y documentar los eventos que son importantes para el desarrollo de los timocitos. Para seguir el...

La imagenología de dos fotones es útil para la inmunología porque nos permite seguir la migración de una sola célula mientras encuentra su entorno. Al seguir la migración en el sitio tímico, mediante microscopía de dos fotones podemos caracterizar el mecanismo de selección positiva y negativa.Hola, soy Ina Lottie del laboratorio de la doctora Ellen Roby en la Universidad de California en Berkeley. Y yo soy Paul Herzmark, también del laboratorio de Ellen Roby. Hoy les mostraremos cómo realizamos imágenes in situ de tejido tímico, y yo les mostraré cómo podemos usar nuestro microscopio de dos fotones para obtener imágenes del timo.Y les mostraré los pasos previos a la obtención de imágenes mediante microscopía de dos fotones. Esto incluye los siguientes procedimientos: aislamiento de células madre hematopoyéticas de la médula ósea, transferencia adoptiva de células de la médula ósea a neonatos, disección y bisecado del timo, y preparación del tejido para la obtención de imágenes mediante microscopía de barrido con láser de dos fotones. Así que comencemos.Antes de poder preparar el timo para la obtención de imágenes, primero debemos transferir células de la médula ósea de forma adoptiva a un ratón neonato. Estas células de la médula ósea se aislaron de las patas traseras de ratones transgénicos que expresan GFP de manera ubicua. Esta es una jeringa de insulina con 50 microlitros de médula ósea.Realizamos de dos a cuatro inyecciones en huéspedes de tres a siete días de edad, utilizando médula ósea de un donante por cada cría inyectada. Aquí tenemos una cría de cinco días de edad; pellizque la piel hacia atrás para evitar que la cría se mueva durante la inyección y para mantener la piel tensa. Apunte a un sitio de inyección que se encuentre por debajo de los pulmones y la caja torácica, pero por encima del intestino y el estómago.Mientras inyecta, afloje el agarre sobre la piel para permitir que se expanda. Por último, retire lentamente la jeringa para limitar la cantidad de médula ósea que se pierde. A estos ratones se les permitirá desarrollarse durante cuatro a seis semanas, y luego se puede extraer el timo para su análisis por imágenes.Después de cuatro a seis semanas, se puede extraer el timo. Para la obtención de imágenes, utilizaré un juego de pinzas y tijeras grandes, así como un juego de pinzas y tijeras pequeñas. Este espécimen ha sido sacrificado de acuerdo con nuestro protocolo de uso de animales y rociado con etanol.Y voy a usar la pinza grande para pellizcar la piel y hacer una incisión en la línea media. Ahora puedo usar las tijeras para cortar hacia abajo por la línea media o puedo separar la piel del peritoneo, y voy a sujetar la piel para exponer la cavidad torácica. Voy a usar el esternón como punto de sujeción mientras corto a través del peritoneo, ingreso a la cavidad torácica a través del diafragma y luego corto a lo largo de los lados de la caja torácica.Y puede observarse el timo situado justo encima del corazón. Voy a colocarlos de nuevo. Así que ahí está el timo.Voy a evitar tocarlo. Usa las pinzas más pequeñas y sigue sujetando el tejido alrededor del timo. Bien, ahora voy a rociarlo con un poco de PBS y comenzar a eliminar algunos de los tejidos sobrantes.Así que voy a usar el tejido alrededor del timo para sujetarlo. Cuando esté limpiando el timo, retiraré el tejido excesivo, cortándolo cuidadosamente. Ahora bien, el timo tiene dos lóbulos que también debemos separar mientras lo limpiamos.Pero primero voy a eliminar todos estos vasos sanguíneos adicionales que se encuentran en la superficie del timo. Tengo mucho cuidado de no alterar la arquitectura del timo que vamos a imaginar. Por lo tanto, solo retiro el tejido que está justo en la superficie.Ahora voy a comenzar suavemente a separar los dos lóbulos. Este es el lóbulo ventral y el lóbulo dorsal que vamos a separar, cortando suavemente el tejido y separándolos con cuidado. No queremos que el tejido se seque, así que vamos a rociar un poco de PBS sobre él.Ahora he separado los dos lóbulos. Este es el lóbulo dorsal, que tiene una forma característica de guitarra. Y este es el lóbulo ventral justo aquí.Voy a limpiar el tejido excesivo de cada uno de estos lóbulos para que el área de imagen esté libre de tejido adicional. Pero voy a dejar un poco de tejido para poder sujetar el tejido. Al realizar la imagen, estaremos capturando a través de este tejido excesivo, lo cual no es necesario, y la calidad de nuestra imagen mejorará al eliminarlo.Ahora tenemos nuestras dos lóbulos bisecados que están listos para ser montados sobre un cubreobjetos para su observación mediante imágenes. Para preparar el timo bisecado para la obtención de imágenes, necesitará un adhesivo tisular veterinario y cubreobjetos de 18 por 18. Me gusta usar un micropipeta para colocar una fracción de un microlitro de pegamento sobre el cubreobjetos.Así que voy a colocar una gota de pegamento que tenga aproximadamente la longitud del timo que vamos a observar. Luego me gusta extenderla. De modo que, si tiene el ancho del timo, nuevamente voy a colocar ambos lóbulos en el mismo cubreobjetos.Ahora voy a colocar otro justo aquí. Voy a tomar el lóbulo del tejido sobrante y simplemente colocarlo sobre el cubreobjetos, luego arrastrarlo hacia la zona donde está el pegamento. Haré lo mismo con el otro lóbulo, tocando nuevamente el cubreobjetos en la zona donde no hay pegamento para estabilizar mi mano, y luego colocaré la otra glándula tímica sobre el cubreobjetos.Ahora que hemos fijado ambos globos tímicos al cubreobjetos, se lo pasaremos a Paul para su obtención de imágenes. Gracias, Ina. Tomemos esta muestra y coloquémosla en el medio DME que utilizaremos para obtener sus imágenes.Así es como está configurado nuestro microscopio de dos fotones. La microscopía de dos fotones es muy adecuada para la visualización de células inmunitarias porque permite observar en profundidad el timo y ver las células fluorescentes en movimiento. Utiliza un láser infrarrojo pulsado para inducir la fluorescencia de las células.Y tenemos en nuestro microscopio del cinturón doméstico cuatro cámaras diferentes que nos permiten visualizar simultáneamente cuatro colores distintos, y utiliza un objetivo especial, que tiene un aumento de 20x. Se trata de una lente especial que se sumerge en el medio DME en el que hemos sumergido el timo, lo que le permite tener una apertura numérica de 0,95, lo cual es muy bueno y hará que nuestras células sean muy brillantes. Para mantener el tejido sano, burbujeamos una mezcla de 95 % de oxígeno y 5 % de CO₂ a través del medio DMEM.A partir de ahí, se bombea hacia la cámara de perfusión, donde se calienta a 37 grados, y es allí donde se sumergen los lóbulos del timo. Con este sistema, podemos mantener las células del timo sanas durante cuatro horas de adquisición de imágenes. Así que les mostré cómo configurar la adquisición de imágenes para el microscopio de dos fotones.Ahora veamos algunos de nuestros resultados en esta película que se repite en bucle. Pueden observarse el timo que hemos obtenido en cuatro colores diferentes. El rojo corresponde a los vasos sanguíneos del timo, y el amarillo a las células dendríticas del hospedador que expresan la proteína fluorescente amarilla bajo el control de un promotor específico de células dendríticas.Los timocitos azules y verdes que ve aquí provienen de dos donantes diferentes que utilizamos para generar una quimera neonatal mediante una técnica de transferencia adoptiva que Ena le mostró anteriormente. Las células verdes son timocitos que expresan la proteína verde fluorescente, y las células azules son timocitos del donante que expresaba la proteína fluorescente cian. Esta es la misma película en bucle que le mostré antes, pero quiero mostrarle la tridimensionalidad de los conjuntos de datos que recolectamos para obtener estas películas.Nos enfocamos en un plano y tomamos una imagen, luego enfocamos un poco más profundo y tomamos otra imagen, y un poco más abajo otra imagen más. Para esta película, avanzamos unos 60 micrómetros hacia abajo, y luego repetimos ese volumen de imágenes aproximadamente cada 30 segundos para obtener el volumen en movimiento. Esta película se registró durante unos 20 minutos.Así podemos rastrear las células a través de tres dimensiones a lo largo del tiempo. Acabamos de mostrarle cómo obtenemos imágenes del timo utilizando microscopía de dos fotones. Los aspectos más importantes de este procedimiento son, primero, inyectar a los neonatos con médula ósea de donantes.Dos, diseccionar y, bi, diseccionar el timo sin dañar su estructura. Tres, fijar firmemente el timo a un cubreobjetos para cuatro imágenes mediante un microscopio de dos fotones. La obtención de imágenes en el timo puede responder muchas preguntas sobre el desarrollo de los timocitos y la generación de un repertorio diverso de linfocitos T.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Investigación

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