Name: Fabricación de células T con receptor de antígeno quimérico en un procesador celular automatizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprende a fabricar células T con receptor de antígeno quimérico mediante un procesador celular automatizado para uso clínico. Este método semiautomatizado ofrece flexibilidad, esterilidad y costos reducidos en terapia génica.

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Los autores desean reconocer las contribuciones de varias personas y organizaciones a este trabajo. El Laboratorio de Terapia Celular y Génica y el Laboratorio de Estudios Traslacionales y Correlativos de la Universidad de Pensilvania proporcionaron una valiosa asistencia en el desarrollo de procesos y la preparación para las presentaciones de IND. Melissa Varghese y Amanda DiNofia contribuyeron al proceso, desarrollo y preparación de las presentaciones de IND que subyacen a este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una Beca de Aceleración de la Colaboración de Terapia Celular y Génica del Hospital Infantil de Filadelfia. Los autores también quieren agradecer a Miltenyi Biotec su apoyo técnico y de investigación. La figura 1 está cubierta por los derechos de autor © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG; Todos los derechos reservados.

Procesador automatizado para la fabricación de células CAR-T a escala clínica

<ol><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Shah, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+anti-CD20%2C+anti-CD19+CAR+T+cells+for+relapsed+B+cell+malignancies%3A+A+phase+1+dose+escalation+and+expansion+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial.</a> Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+humanized+CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-modified+T+cells+in+children+and+young+adults+with+relapsed%2Frefractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 128 (22), 217(2016).</li>
<li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+manufacturing+of+CAR-T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li>
<li>Fernández, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-compliant+manufacturing+of+NKG2D+CAR+memory+T+cells+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy.</a> Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361(2019).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20%2F19+chimeric+antigen+receptor+T+Cells+using+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li>
<li>Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clinical+grade+CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+produced+using+automated+CliniMACS+prodigy+system%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design%2C+Development+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system.</a> Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).</li>
<li>Abou-El-Enein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+manufacturing+of+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).</li>
<li>Miltenyi Biotec. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CliniMACS+Prodigy+User+Manual%22">CliniMACS Prodigy User Manual</a>. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chemistry%2C+manufacturing%2C+and+control+%28CMC%29+information+for+human+gene+therapy+investigational+new+drug+applications+%28INDs%29+guidance+for+industry%22">Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry</a>. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Considerations+for+the+development+of+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+products+draft+guidance+for+industry%22">Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry</a>. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).</li>
</ol>

S.K., S.G. y Y.W. han recibido apoyo de investigación de Miltenyi Biotec.

La terapia de células CAR-T se ha convertido en un enfoque de tratamiento prometedor para las células B y otras neoplasias malignas. Sin embargo, los métodos tradicionales de fabricación de células CAR-T tienen varias limitaciones, como el alto costo, la producción intensiva en mano de obra y los pasos abiertos que aumentan el riesgo de contaminación. Recientemente, han surgido varias plataformas semiautomatizadas, incluida Miltenyi CliniMACS Prodigy (el "procesador"), para abordar estas limitaciones. El proceso de trans...

La transferencia adoptiva de linfocitos T modificados para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) ha demostrado una eficacia notable en el tratamiento de pacientes con neoplasias malignas de linfocitos B refractarias 1,2,3,4,5. Sin embargo, los métodos tradicionales de fabricación de las células CAR-T requieren mucha mano de obra, mucho tiempo y técnicos altamente capacitados para llevar a cabo pasos altamente especializados. Por ejemplo, el proceso de fabricación tradicional de un producto autólogo de células CAR-T implica la centrifugación en gradiente de densidad, la elutriación o separación magnética para enriquecer las células T, la activación y transducción con un vector viral en un matraz estéril y la expansión en un biorreactor antes de la cosecha y la formulación. Recientemente han surgido varios sistemas que tienen como objetivo automatizar parcialmente este proceso. Por ejemplo, el Miltenyi CliniMACS Prodigy (en adelante, el "procesador") es un dispositivo de procesamiento celular automatizado que puede realizar muchos de estos pasos de forma automatizada 6,7,8,9. En un reciente artículo de revisión10 se presenta un análisis en profundidad de los métodos de fabricación de CAR-T tradicionales y automatizados.
El procesador se basa en la funcionalidad de CliniMACS Plus, un dispositivo médico aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para el procesamiento de células progenitoras hematopoyéticas. El procesador incluye una unidad de cultivo celular que permite el lavado, fraccionamiento y cultivo automatizado de células (Figura 1). El proceso de transducción de células T (TCT) es un programa preestablecido dentro del dispositivo procesador que replica en gran medida la fabricación manual de células CAR-T. TCT permite el procesamiento de celdas personalizable mediante una interfaz gráfica de usuario (la "Matriz de actividades", Figura 2). Debido a que el procesador automatiza muchos pasos y consolida la funcionalidad de varios dispositivos en una sola máquina, requiere menos capacitación y habilidades especializadas de resolución de problemas por parte de los tecnólogos. Debido a que todos los pasos se realizan dentro de un conjunto de tubos cerrados de un solo uso, el procesador puede operarse en instalaciones con una infraestructura de manejo de aire menos estricta de lo que se consideraría aceptable para un proceso de fabricación abierto. Por ejemplo, estamos operando el procesador en una instalación certificada como ISO clase 8 (comparable al grado C de la UE).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig01.jpg"> Figura 1: Fabricación de células CAR-T utilizando el sistema de transducción de células T. Se muestra el procesador con el juego de tubos instalado. El juego de tubos permite conectar otros componentes, como bolsas que contienen tampón de procesamiento, medio de cultivo y vector lentiviral mediante soldadura estéril. Una vez que el producto de leucoféresis se agrega a la bolsa de aplicación, se puede etiquetar con perlas de selección de células T, pasar a través de la columna de separación y luego transferirse a la bolsa de reaplicación. A continuación, las células seleccionadas se dirigen a la unidad de cultivo del instrumento para el cultivo y se activan con el reactivo de activación (véase la tabla de materiales). El producto final se recoge en la bolsa de células Target. A lo largo del proceso, es posible extraer muestras para el control de calidad de forma aséptica. Los números grises dentro de los círculos representan las válvulas numeradas en el procesador que dirigen la ruta del líquido a través del conjunto de tubos. Reproducido con permiso de 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig02.jpg"> Figura 2: Matriz de actividades. Después de la selección y activación de las células T, el resto del proceso de fabricación de células CAR-T es totalmente personalizable. Las actividades se pueden agregar o eliminar y programar para el día y la hora adecuados, y se puede especificar el volumen de referencia cultural después de la actividad (Volumen). Por ejemplo, la actividad de transducción se configuró para comenzar a las 10:00 a.m. del día 1 y el volumen de cultivo al final de la actividad se estableció en 100 ml. La matriz de actividades se puede editar durante todo el período de cultivo. El estado del proceso se puede monitorear en la pantalla integrada del dispositivo de procesamiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El objetivo de este manuscrito es proporcionar un recorrido detallado de la fabricación de células CAR-T utilizando el procesador y, además, proporcionar orientación sobre las pruebas en proceso y de liberación del producto que probablemente requerirán los reguladores para aprobar una solicitud de nuevo fármaco en investigación (IND). El protocolo presentado se mantiene cerca del enfoque recomendado por el proveedor y es el protocolo subyacente para IND 28617, que actualmente se está evaluando en un ensayo clínico de fase I/II iniciado por un investigador de un solo centro. Este ensayo tiene como objetivo determinar la seguridad y eficacia del uso de este procesador para fabricar células CAR-T autólogas humanizadas dirigidas a CD19 para pacientes con leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) o linfoma linfoblástico de linaje B (LLY-B) [NCT05480449]. El ensayo comenzó en septiembre de 2022 y está previsto que se inscriban hasta 89 pacientes de 0 a 29 años con LLA-B o B-Lly. En el manuscrito se presentan algunos resultados de fabricación del ensayo.
Nos gustaría señalar que, aunque el manuscrito se presenta como un protocolo con pasos a seguir, debe considerarse un punto de partida para que otros comiencen a optimizar su propio proceso de fabricación de células CAR-T. Una lista no exhaustiva de posibles variaciones del protocolo presentado incluye: el uso de células T frescas en lugar de criopreservadas como material de partida; usar un método diferente de enriquecimiento de células T u omitirlo por completo; el uso de diferentes medios y cócteles de citoquinas como IL7/IL15 en lugar de IL2; variar la concentración de suero AB humano u omitirla por completo; momento de la transducción; el uso de transducciones "multi-hit"; variación de la agitación, los volúmenes de cultivo y el programa de alimentación; el uso de diferentes métodos de transferencia genética, incluida la electroporación de ácidos nucleicos o vectores no lentivirales; utilizar un tampón de formulación final y/o crioprotector diferente; e infundir células CAR-T frescas en lugar de criopreservar para su infusión en un momento posterior. Estas variaciones pueden tener un impacto significativo en la composición celular y la potencia del producto terapéutico.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Paso general del proceso</td>
			<td>Día del Proceso</td>
			<td colspan="4">Técnicas</td>
		</tr><tr><td>Enriquecimiento celular</td>
			<td rowspan="2">Día 0</td>
			<td colspan="4">Selección de linfocitos T CD4+/CD8+</td>
		</tr><tr><td>Activación celular</td>
			<td colspan="4">Siembra y activación de cultivos de células T</td>
		</tr><tr><td>Transducción celular</td>
			<td>Día 1</td>
			<td colspan="4">Transducción lentiviral (volumen de cultivo de 100 mL)</td>
		</tr><tr><td rowspan="12">Expansión celular (seguida de formulación celular)</td>
			<td>Día 2</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>Día 3</td>
			<td colspan="4">Lavado de cultivo (1 ciclo); Agitador activado; El volumen de cultivo aumenta a 200 mL</td>
		</tr><tr><td>Día 4</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>Día 5</td>
			<td colspan="4">Alimentación (50 mL); El volumen de cultivo alcanza el volumen final de 250 mL</td>
		</tr><tr><td>Día 6</td>
			<td colspan="4">Muestra en proceso; Intercambio de medios (-125 mL / +125 mL)</td>
		</tr><tr><td>Día 7</td>
			<td colspan="4">Intercambio de medios (-150 mL / +150 mL) o Cosecha</td>
		</tr><tr><td>Día 8</td>
			<td colspan="4">Muestra en proceso; Intercambio de medios (-150 mL / +150 mL) o Cosecha</td>
		</tr><tr><td>Día 9</td>
			<td colspan="4">Intercambio de medios (-180 mL / +180 mL) o Cosecha</td>
		</tr><tr><td>Día 10</td>
			<td colspan="4">Muestra en proceso; Intercambio de medios (-180 mL / +180 mL) o Cosecha</td>
		</tr><tr><td>Día 11</td>
			<td colspan="4">Intercambio de medios (-180 mL / +180 mL) o Cosecha</td>
		</tr><tr><td>Día 12</td>
			<td colspan="4">Intercambio de medios (-180 mL / +180 mL) o Cosecha</td>
		</tr><tr><td>Día 13</td>
			<td colspan="4">Cosecha</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Cronograma y descripción general del proceso. Esta tabla resume los pasos del proceso de TCT empleados en un ensayo clínico actual [NCT05480449]. El proceso comienza con el enriquecimiento de las células T mediante la selección de CD4+/CD8+, la siembra del cultivo y la activación en el día 0, seguido de la transducción en el día 1. Las células descansan durante 48 h, seguidas de un lavado de cultivo, un aumento del volumen de cultivo a 200 ml y agitación mediante un mecanismo de agitación. El día 6, se toma la primera muestra en proceso. Las células se extraen una vez que se dispone de suficientes células para al menos tres dosis completas de células CAR-T (5 × 10 6 células CAR-T/kg si el paciente pesa &lt;50 kg, de lo contrario, 2,5 × 108 células CAR-T) y pruebas de control de calidad (~2 × 106 células CAR-T); o una vez que el cultivo alcanza un total de 4-5 x 109 células. Abreviaturas: TCT = transducción de células T; CAR-T = linfocitos T receptores de antígenos quiméricos; MACS = clasificación de células activadas magnéticamente.

<table><tbody><tr><td>12 x 75 tubos de borosilicato</td><td>Charles River</td><td>TL1000</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Bolsa de reactivos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-631</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo cónico</td><td>Fisher</td><td>05-539-10</td><td></td></tr><tr><td>150 mL Juego de transferencia</td><td>Fenwal</td><td>4R2001</td><td></td></tr><tr><td>2.000 mL Juego de transferencia</td><td>Fenwal</td><td>4R2041</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BDB559925</tr><tr><td>Preparación de Alcohol</td><td>Tyco/Bolsa de Atención</td> Médica <td></td><td></td></tr><tr><td>Acceso</td><td>Medline</td><td>2300E-0500</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Vio770 REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-643</td><td></td></tr><tr><td>CD19 CAR Reactivo de detección Biotina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-129-550</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>BD</td><td>555413</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC</td><td>BD</td><td>340440</td><td></td></tr><tr><td>CD4 VioBright FITC REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-229</td><td></td></tr><tr><td>CD45 VioBlue REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-637</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC-Vio770 REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-681</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de referencia del celómetro 10um</td><td>Nexcelom</td><td>B10-02-020</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de referencia del celómetro 15um</td><td>Nexcelom</td><td>B15-02-010</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de referencia de celómetro 5um</td><td>Nexcelom</td><td>B05-02-050</td><td></td></tr><tr><td>Correderas de celómetro</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS CD4 GMP MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>276-01</td><td>El reactivo CD4</td></tr><tr><td>CliniMACS CD8 GMP MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>275-01</td><td>El reactivo CD8</td></tr><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA Tampón</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-201</td><td>El tampón</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Origen</td><td>CP-10</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa de congelación 50 mL</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>Vial de congelación, 1,8 mL</td><td>Nunc</td><td>12565171N</td><td></td></tr><tr><td>Vial de congelación, 4,5 mL</td><td>Nunc</td><td>12565161N</td><td></td></tr><tr><td>Suero AB humano</td><td>Valley Biomedical</td><td></td><td>Estéril filtrado, inactivado por calor</td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana 25%</td><td>Grifols</td><td>68516-5216-1</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana 5%</td><td>Grifols</td><td>68516-5214-1</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP IL-2 humana recombinante</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-148</td><td>Las citoquinas</td></tr><tr><td>MACS GMP T Cell TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-076-202</td><td>El reactivo de activación</td></tr><tr><td>MycoSeq Mycoplasma Kit de detección</td><td>Life Technologies</td><td>4460623</td><td></td></tr><tr><td>Agujas, Hipodérmico 14G</td><td></td><td>Medline</td> SWD200573 <td></td></tr><tr><td>Agujas, SlideSafe 18G</td><td>BD</td><td>B-D305918</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta, 2-200 &mu; L,</td><td>Eppendorf</td><td>022492209</td><td></td>Puntas de pipeta envueltas individualmente</tr><tr><td>, 50-1000 &mu; L, envueltos individualmente</td><td>Eppendorf</td><td>022492225</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 10 mL</td><td>Fisher</td><td>13-678-27F</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 25 mL</td><td>Fisher</td><td>13-675-30</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 5 mL</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Plasmalyte-A</td><td>Baxter</td><td>2B2544X</td><td>La solución electrolítica</td></tr><tr><td>Prodigy TS520 Juego de tubos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076- 600</td><td>El juego de tubos</td></tr><tr><td>Campo estéril</td><td>Medline</td><td>NON21001</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina PE-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-793</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 3 mL</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 30 mL</td><td>BD</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 50 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP Medio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-306</td><td>El mediano</td></tr><tr><td>Adaptador de muestreo triple</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-609</td><td></td></tr><tr><td>Vector viral</td><td>CHOP Núcleo de vector</td><td></td> clínico <td>huCART19</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Gabinete</td><td>El Baker Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celómetro Auto 2000</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-075-301</td><td>El procesador</td></tr><tr><td>Tasa Controlada Freezer Cepilladora</td><td>/Kryosave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endosafe nexgen-PTS150K</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mettler Balance</td><td>Mettler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD Soldador de tubos estériles</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sebra Sellador de tubos</td><td>Sebra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Varitherm</td><td>Barkey</td><td></td><td>El dispositivo de descongelación en seco</td></tr><tr><td>XN-330 Analizador de hematología</td><td>Sysmex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación de células t con receptor de antígeno quimérico en un procesador celular automatizado

Chimeric Antigen Receptor T Cell Manufacturing on an Automated Cell Processor

Los linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR) representan un enfoque inmunoterapéutico prometedor para el tratamiento de diversas enfermedades malignas y no malignas. Las células CAR-T son células T modificadas genéticamente que expresan una proteína quimérica que reconoce y se une a una diana de la superficie celular, lo que provoca la muerte de la célula diana. Los métodos tradicionales de fabricación de células CAR-T requieren mucha mano de obra, son costosos y pueden conllevar el riesgo de contaminación. El CliniMACS Prodigy, un procesador celular automatizado, permite fabricar productos de terapia celular a escala clínica en un sistema cerrado, minimizando el riesgo de contaminación. El procesamiento se produce de forma semiautomática bajo el control de un ordenador y, por lo tanto, minimiza la participación humana en el proceso, lo que ahorra tiempo y reduce la variabilidad y los errores.
Este manuscrito y video describe el proceso de transducción de células T (TCT) para la fabricación de células CAR-T utilizando este procesador. El proceso TCT implica el enriquecimiento, la activación, la transducción con un vector viral, la expansión y la cosecha de células T CD4+/CD8+. Usando la Matriz de Actividades, una funcionalidad que permite ordenar y cronometrar estos pasos, el proceso TCT se puede personalizar ampliamente. Proporcionamos un recorrido por la fabricación de células CAR-T de conformidad con las Buenas Prácticas de Fabricación (cGMP) actuales y analizamos las pruebas de liberación requeridas y los experimentos preclínicos que respaldarán una solicitud de nuevo fármaco en investigación (IND). Demostramos la viabilidad y discutimos las ventajas y desventajas de utilizar un proceso semiautomático para la fabricación clínica de células CAR-T. Por último, describimos un ensayo clínico en curso iniciado por un investigador que se dirige a las neoplasias malignas de células B pediátricas [NCT05480449] como ejemplo de cómo se puede aplicar este proceso de fabricación en un entorno clínico.

Los resultados de las tres series iniciales de fabricación de CAR-T del ensayo de NCT05480449 se presentan a continuación en la Tabla 3. El material de partida, el vector, las citocinas de cultivo y las concentraciones séricas de AB se mantuvieron constantes para cada corrida. Los productos se cosecharon el día 7 u 8. El crecimiento celular diario promedio fue del 46% (aumento en el recuento total de células), lo que indica que el proceso TCT fue efectivo para promover la expansión celular. Estos resulta...

En este artículo se detalla el proceso de fabricación de linfocitos T receptores de antígenos quiméricos para uso clínico, concretamente utilizando un procesador celular automatizado capaz de realizar la transducción viral y el cultivo de linfocitos T. Proporcionamos recomendaciones y describimos los escollos que deben tenerse en cuenta durante el desarrollo del proceso y la implementación de un ensayo clínico de fase inicial.

Fabricación de células T con receptor de antígeno quimérico en un procesador celular automatizado

Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells represent a promising immunotherapeutic approach for the treatment of various malignant and non-malignant ...

La ventaja de nuestro protocolo es que se trata de un sistema semiautomático y cerrado que sigue ofreciendo flexibilidad. Los pasos que requieren mucha mano de obra se reemplazan por la automatización, que es ejecutada por una computadora, y debido a que es ejecutada por una computadora, el usuario puede personalizar su protocolo. Todo esto también se hace en un sistema cerrado.Descubrimos que el tipo de laboratorios de células madre que suelen estar presentes en los hospitales tienen la capacidad de producir células CAR-T de grado clínico a un coste significativamente menor que las alternativas comerciales. Creemos que nuestro proceso podría adaptarse fácilmente para hacer que las células CAR-T sean específicas para otras dianas, y también para fabricar otros tipos de terapias celulares y génicas. Nuestro equipo está preparado para explorar otras dianas de células CAR-T y nuevas terapias génicas.A una escala más amplia, las terapias celulares y génicas se están expandiendo rápidamente, y estamos entusiasmados de continuar apoyando e innovando en este apasionante campo.

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Este video muestra una técnica para fabricar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) ex vivo. Las células T humanas se incuban con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, junto con un medio suplementado con interleucina-2 (IL-2), lo que conduce a la activación y proliferación de las células T. Se introducen vectores lentivirales transgénicos, lo que permite que el ARN transgénico se integre en el genoma del huésped y exprese el transgén. Esto da como...

Una técnica ex vivo para fabricar linfocitos T receptores de antígenos quiméricos

El objetivo de este protocolo es fabricar células T de grado clínico específicas para patógenos utilizando un dispositivo de enriquecimiento celular de segunda generación, automatizado y de sobremesa que incorpora un sistema cerrado de captura de citocinas y no requiere personal dedicado ni el uso de una instalación GMP. Las células T específicas del citomegalovirus pp65 generadas pueden administrarse directamente a los pacientes.

Enriquecimiento de la célula automatizada de citomegalovirus células T específicas para aplicaciones clínicas utilizando el Sistema de citoquinas de captura

Describimos un sistema de ensayo cuantitativo de citolisis in vitro en tiempo real para evaluar la potencia de las células T del receptor de antígeno quimérico dirigidas a células tumorales líquidas y sólidas. Este protocolo se puede ampliar para evaluar otras células efector inmune, así como tratamientos combinados.

Un ensayo de potencia en tiempo real para células T receptores de antígeno quimérico dirigido a células cancerosas sólidas y hematológicas

Describimos un enfoque para generar de forma fiable células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) y probar su diferenciación y función in vitro e in vivo.

Fabricación de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para inmunoterapia adoptiva

Este protocolo describe el proceso de transducción de células T humanas primarias con un gen de interés, lo que garantiza la compatibilidad con los estándares de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP).

Un procedimiento conforme a las GMP para la generación de células T modificadas genéticamente

Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.

Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Este protocolo describe los pasos esenciales para el cultivo de células T primarias, incluyendo su aislamiento, activación, expansión y transfección transitoria mediante electroporación de ARNm. Además, se propone un flujo de trabajo y un panel de anticuerpos para el análisis citométrico de flujo del fenotipo, marcadores de activación, viabilidad y expresión del receptor quimérico de antígenos (CAR).

Aislamiento, cultivo y transfección transitoria de células T humanas primarias para generar células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR)

Un alto rendimiento, la plataforma automatizada de desarrollo de la fabricación línea celular para la producción de proteínas terapéuticas se describe. Implementación de BD clasificador de células FACS Aria, CloneSelect Imager y Libertad TECAN EVO sistema de manejo de líquidos se ha demostrado la capacidad de procesamiento aumentó significativamente en el desarrollo de líneas celulares con mejor calidad de línea celular y una alta reproducibilidad.

Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

Este protocolo permite a uno identificar los factores que modulan la masa funcional de las células beta para encontrar posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de la diabetes. El protocolo consiste en un método simplificado para evaluar la replicación de islotes y la función de las células beta en los islotes de rata aislados siguientes manipulación de la expresión génica con adenovirus.

La evaluación de la replicación y la función celular beta en Adenovirally transducidas aislados islotes de roedores

Aprende a fabricar células T con receptor de antígeno quimérico mediante un procesador celular automatizado para uso clínico. Este método semiautomatizado ofrece flexibilidad, esterilidad y costos reducidos en terapia génica.

Fabricación de células T con receptor de antígeno quimérico en un procesador celular automatizado

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