Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune
6 de octubre de 2023
Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.
Para investigar los mecanismos moleculares y celulares en enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple, la generación de protocolos de aislamiento celular reproducibles y sofisticados es una necesidad no cubierta. La mayoría de las tecnologías actuales para aislar y analizar las células residentes en el SNC muestran serias deficiencias, como centrarse en un solo tipo de célula o solo en ratones postnatales. El protocolo actual para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el SNC a partir de una réplica del SNC ofrece la posibilidad de analizar redes neuronales complejas y nuevas vías inflamatorias, ex vivo a partir de una suspensión de una sola célula, aplicables a ratones sanos y a aquellos con encefalomielitis autoinmune experimental.
Además, el número de ratones disminuye Nuestro protocolo para el aislamiento simultáneo de los cuatro principales tipos de células residentes en el SNC en ratones sanos y EAE podría utilizarse como una herramienta útil para los grupos de investigación que estudian nuevas vías inflamatorias, permitiendo un análisis mucho más preciso de mecanismos biomoleculares complejos y redes celulares ex vivo. Las nuevas preguntas científicas que podrían responderse con la ayuda de nuestro protocolo son las investigaciones dinámicas en EAE durante diferentes etapas del curso de la enfermedad, como la neuroinflamación, la neurodegeneración y la remisión. Además, las interacciones célula-célula y las vías bioquímicas podrían estudiarse a nivel individual.
Asimismo, se podrían realizar ensayos funcionales con células cultivadas. Pretendemos centrarnos en los estudios dinámicos del curso EAE para el análisis multiómico a partir de un homogeneizado individual del SNC por punto temporal de EAE.
Resumen
Este estudio presenta un protocolo novedoso para el aislamiento simultáneo de todos los tipos celulares principales residentes del sistema nervioso central (SNC) a partir de un solo ratón, aplicable tanto en modelos ingenuos como en modelos de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Este método tiene como objetivo abordar las limitaciones de las tecnologías actuales de aislamiento celular, permitiendo a los investigadores estudiar interacciones celulares complejas durante la neuroinflamación, al mismo tiempo que minimiza el número de ratones utilizados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Investigación sobre Autoinmunidad
Antecedentes
- Los protocolos existentes suelen centrarse en un solo tipo celular o únicamente en ratones posnatales.
- El aislamiento de células residentes en el SNC puede mejorar significativamente nuestra comprensión de los procesos neuroinflamatorios.
- La necesidad de un protocolo integral y reproducible para el aislamiento celular es cada vez más importante en el contexto de las enfermedades autoinmunes.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para el aislamiento de todos los tipos celulares principales residentes en el SNC a partir de un solo ratón.
- Facilitar el análisis de las redes celulares en condiciones de salud y enfermedad.
- Permitir estudios más precisos de las vías inflamatorias en la neuroinflamación.
Métodos Utilizados
- El estudio utiliza un método de disociación celular aplicable tanto a ratones sanos como a ratones con EAE.
- Los ratones se colocan en posición supina, siguiendo un protocolo detallado y por etapas de disección para obtener tejido cerebral y de médula espinal.
- Se describen minuciosamente los protocolos de precipitación, lavado y purificación celular, asegurando altos rendimientos de tipos celulares del SNC.
Resultados principales
- El protocolo facilita el aislamiento simultáneo de microglía, oligodendrocitos y otros tipos celulares residentes del SNC para análisis posteriores.
- Se espera que este método proporcione información sobre la dinámica celular en diferentes etapas de la EAE.
- Las mejoras fundamentales incluyen la reducción del uso de animales y una mayor calidad de los datos obtenidos a partir de preparaciones del SNC de un solo ratón.
Conclusiones
- Este estudio demuestra una técnica novedosa de aislamiento celular que mejora las capacidades de investigación en neuroinmunología.
- La capacidad del método para analizar mecanismos biomoleculares complejos a partir de muestras más reducidas tiene implicaciones significativas para el estudio de modelos de enfermedades del SNC.
- En general, el protocolo puede ayudar a responder preguntas clave sobre la neuroinflamación y las intervenciones terapéuticas en condiciones autoinmunes.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento simultáneo de todos los tipos celulares principales residentes en el SNC de ratones adultos con EAE permite una interrogación integral de los mecanismos neuroinflamatorios en un solo experimento. Este enfoque posibilita análisis multiómicos de alto contenido y reduce el uso de animales, impactando directamente en la descubrimiento temprano y la validación de dianas en carteras de neuroinmunología. El protocolo mejora la confianza predictiva para la desactivación de riesgos en vías moleculares y el desarrollo de biomarcadores traslacionales en modelos de enfermedades autoinmunes del SNC.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el análisis ex vivo de redes neuronales y gliales complejas a partir de muestras individuales del SNC.
- Apoya la desestimación mecanicista al permitir la investigación dinámica de las etapas de neuroinflamación, neurodegeneración y remisión.
- Facilita la validación funcional de objetivos mediante el aislamiento de poblaciones celulares del SNC viables y de alta pureza.
- Reduce la variabilidad biológica al obtener todos los tipos celulares del mismo animal.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona suspensiones de células individuales validadas y con alta viabilidad para ensayos funcionales y fenotípicos posteriores.
- Normaliza el aislamiento celular entre los distintos tipos de células del SNC, mejorando la reproducibilidad y la comparabilidad de los ensayos.
- Permite la preparación a escala de células residentes en el SNC para cribado de compuestos e interrogación de vías.
- Facilita evaluaciones cuantitativas basadas en citometría de flujo de pureza y viabilidad para determinar la idoneidad del ensayo.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con modelos EAE relevantes para la enfermedad, para el descubrimiento y validación traslacional de biomarcadores.
- Mantiene la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir análisis de la enfermedad en múltiples etapas.
- Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar datos celulares integrales de animales individuales.
- Apoya la investigación de interacciones entre células y vías bioquímicas relevantes para la autoinmunidad del sistema nervioso central humano.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir análisis simultáneos de múltiples tipos celulares procedentes de ratones con EAE y ratones sanos, apoyando tanto la investigación basada en hipótesis como la investigación exploratoria.
- Biología del Descubrimiento: Mejora la comprobación de hipótesis y la clarificación de vías al permitir el análisis dinámico y específico por etapas de células del SNC.
- Selección: Proporciona suspensiones celulares reproducibles y de alta pureza para el desarrollo sólido de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece métricas cuantitativas de viabilidad y pureza mediante citometría de flujo para comparaciones entre diferentes condiciones.
- Investigación Traductiva: Conecta las fases de descubrimiento y preclínica al facilitar la alineación de biomarcadores en modelos relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el aislamiento de células del SNC aplicable en diversos programas de investigación sobre neuroinflamación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de autoinmunidad del SNC.
- Valor operativo: Estandariza el aislamiento celular, mejora la reproducibilidad y minimiza el uso de animales.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir análisis multiparamétricos a partir de un solo animal.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de dianas y biomarcadores neuroinflamatorios.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección del SNC, disociación celular y clasificación celular activada por magnetismo (MACS).
- Exige acceso a citometría de flujo e instrumentación para clasificación celular para el control de calidad.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de manejo de tejidos y análisis.
- Adaptable tanto a modelos de ratón adulto sano como a EAE, lo que garantiza una amplia aplicabilidad.
- Depende de un manejo cuidadoso para mantener la viabilidad y pureza celular, tal como lo respaldan los datos originales.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:58
Preparation of CNS Tissue for Isolating Cells in EAE Mice
3:54
Dissociation of CNS Tissue for Isolating Cells in EAE Mice
5:25
Removal of Debris and Red Blood Cells from CNS Cell Suspension of EAE Mice
7:18
Isolation of CNS Cell Types Using Magnetic Beads in Naive and EAE Mice
