Name: Generación de modelos de lesiones retinianas en renacuajos de Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprende a generar modelos de lesiones retinianas en renacuajos de Xenopus laevis para estudiar regeneración ocular. Este método permite investigar mecanismos de reparación con células gliales de Müller.

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Esta investigación contó con el apoyo de becas a M.P. de la Association Retina France, la Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) y UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) en colaboración con ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Generación de degeneración retiniana para investigar estrategias de reparación celular en xenopus

<ol><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>García-García, D., Locker, M., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+M%C3%BCller+glia+regenerative+potential+for+retinal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).</li>
<li>Todd, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+stimulation+of+retinal+regeneration+from+M%C3%BCller+glia+in+adult+mice+using+combinations+of+proneural+bHLH+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors.</a> Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li>
<li>Langhe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reactivation+in+Xenopus+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration.</a> Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).</li>
<li>Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+chemogenetic+ablation+of+photoreceptor+cells+in+Xenopus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-specific+ablation+using+the+nitroreductase%2Fmetronidazole+system+to+investigate+regeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).</li>
<li>Zahn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Table+of+Xenopus+development%3A+a+new+graphical+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource.</a> Development. 149 (14), (2022).</li>
<li>McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Husbandry%2C+general+care%2C+and+transportation+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).</li>
<li>Parain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+models+of+retinitis+pigmentosa+reveal+differential+proliferative+response+of+M%C3%BCller+cells+between+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Cells. 11 (5), 807(2022).</li>
<li>Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+care+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).</li>
<li>Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+from+three+cellular+sources+and+ectopic+mini-retina+formation+upon+neurotoxic+retinal+degeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+the+Xenopus+laevis+tadpole%3A+a+new+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system.</a> Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).</li>
<li>Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+tadpoles+can+regenerate+neural+retina+lost+after+physical+excision+but+cannot+regenerate+photoreceptors+lost+through+targeted+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+homeobox+%28Rx%29+gene+is+necessary+for+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration.</a> Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Ventajas y desventajas de varios paradigmas de lesión retiniana en renacuajos de Xenopus
Lesión mecánica de la retina Se han desarrollado varias lesiones quirúrgicas de la retina neural en renacuajos de Xenopus. La retina neural puede ser extirpada por completo15,16 o sólo parcialmenteextirpada 16,17. La lesión mecánica que...

Millones de personas en todo el mundo padecen diversas enfermedades degenerativas de la retina que conducen a la ceguera, como la retinosis pigmentaria, la retinopatía diabética o la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). Hasta la fecha, estas afecciones siguen siendo en gran medida intratables. Los enfoques terapéuticos actuales que se están evaluando incluyen la terapia génica, los trasplantes de células o tejidos, los tratamientos neuroprotectores, la optogenética y los dispositivos protésicos. Otra estrategia emergente se basa en la autorregeneración a través de la activación de células endógenas con potencial de células madre. Las células gliales de Müller, el principal tipo de célula glial de la retina, se encuentran entre las fuentes celulares de interés en este contexto. Al lesionarse, pueden desdiferenciarse, proliferar y generar neuronas 1,2,3. Aunque este proceso es muy efectivo en el pez cebra o Xenopus, es en gran medida ineficiente en los mamíferos.
Sin embargo, se ha demostrado que los tratamientos apropiados con proteínas mitogénicas o la sobreexpresión de diversos factores pueden inducir la reentrada en el ciclo celular de la glía de Müller en mamíferos y, en algunos casos, desencadenar su posterior compromiso neurogénico 1,2,3,4,5. Sin embargo, esto sigue siendo en gran medida insuficiente para los tratamientos. Por lo tanto, es necesario aumentar nuestro conocimiento de los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración para identificar moléculas capaces de convertir de manera eficiente las propiedades de las células madre de Müller en nuevas estrategias terapéuticas celulares.
Con este objetivo, desarrollamos varios paradigmas de lesión en Xenopus que desencadenan la degeneración de las células de la retina. Aquí, presentamos (1) una lesión mecánica de la retina que no es específica del tipo de célula, (2) un modelo de ablación celular condicional y reversible utilizando el sistema NTR-MTZ que se dirige a los bastones, (3) un knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9, un modelo de retinosis pigmentaria que desencadena la degeneración progresiva de los bastones, y (4) un CoCl2-modelo citotóxico inducido que, según la dosis, puede dirigirse específicamente a los conos o provocar una degeneración más amplia de las células de la retina. Destacamos las particularidades, ventajas y desventajas de cada paradigma.

<table><tbody><tr><td>1,2-Propanodiol (propily egrave; ne glicol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398039</td><td></td></tr><tr><td>etanol absoluto &ge; 99,8 %</td><td>Productos químicos de VWR</td><td>20821-365</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-caspasa 3 escindido (conejo)</td><td>Señalización celular</td><td>9661S</td><td>Dilución 1/300</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP (pollo)</td><td>Aveslabs</td><td>GFP-1020</td><td>Dilución 1/500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-M-Opsina (conejo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5405</td><td>Dilución 1/500</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón, Alexa Fluor 594 (cabra)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11005</td><td>Dilución 1/1.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Otx2 (conejo)</td><td>Abcam</td><td>Ab183951</td><td>Dilución 1/100</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-conejo, Alexa Fluor 488 (cabra)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11008</td><td>Dilución 1/1.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-conejo, Alexa Fluor 594 (cabra)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11012</td><td>Dilución 1/1.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Recoverina (conejo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5585</td><td>Dilución 1/500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Rhodopsina (ratón)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN15</td><td>Dilución 1/1.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-S-Opsina (conejo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5407</td><td>Dilución 1/500</td></tr><tr><td>Kit de detección de Apoptotis (Sistema TUNEL fluorimétrico sin salida)</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaína&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Solución madre 10%</td></tr><tr><td>bisBenzimida H 33258 (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2883</td><td>Solución madre 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Butanol-1 &ge; 99,5 %</td><td>Productos químicos de VWR</td><td>20810.298</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2, 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.02382</td><td>Uso a 0,1 M</td></tr><tr><td>Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0646T</td><td></td></tr><tr><td>Clark Modelo de vidrio capilar GC100TF-10</td><td>Warner Instruments (Aparato de Harvard)</td><td>30-0038</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cobalto (II) hexahidratado (CoCl2, 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td>Solución madre 100</td></tr><tr><td>mM Cubreobjetos 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Dako REAL ab diluyente&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>S202230-2</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo Rotativo Electrónico</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 340E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eosina 1% acuosa</td><td>RAL Diagnostics</td><td>312740</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína lisina dextran&nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>D1822</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico fluorescente</td><td>Olympus</td><td>SZX 200</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Euromedex</td><td>EU0410-B</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de glicerina según Mallory</td><td>Diapath</td><td>E0012</td><td>Uso al 3% en agua</td></tr><tr><td>Hematoxilina (Hemalun de Mayer)</td><td>RAL Diagnostics</td><td>320550</td><td></td></tr><tr><td>Sal</td> <td>de potasio HEPESSigma-Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Hormona gonadotropina coriónica humana</td><td>MSD Animal Health</td><td>Chorulon 1500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico fumante, 37% (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich (SAFC)</td><td>1.00314</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de L-cisteína monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880</td><td>Uso al 2% en 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio Heptahidratado (MgSO4, 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>M3761</td><td>Uso a 10 mM</td></tr><tr><td>Puntas de microcargador</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas (P-97 Flaming/Marrón)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modelo P-97</td><td>Programa : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Desbloqueado p = 500</td></tr><tr><td>Medio de montaje para preservar la fluorescencia, FluorSave Reactivo</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje, Eukitt</td><td>Chem-Lab</td><td>CL04.0503.0500</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Ultra Microtomo</td><td>cuchilla Epredia</td><td>3053835</td><td></td></tr><tr><td>Aguja Agani 25 G x 5/8''</td> <td>Terumo</td><td>AN*2516R1</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de alfiler niquelado</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Tejido de filtración de nailon (tela de tamizado) NITEX, apertura de malla 1,000 y micro; m</td><td>Sefar</td><td>06-1000/44</td><td></td></tr><tr><td>Histowax de parafina sin DMSO</td><td>Histolab</td><td>00403</td><td></td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído (32%)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>EM-15714-S Uso</td><td>al 4% en 1x PBS pH 7.4 Moldes</td></tr> de <tr><td>inclusión desechables Peel-A-Way</td><td>Epredia</td><td>2219</td><td></td></tr><tr><td>Mortle</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 100 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>SB93-101</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 55 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>BP53-06</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato Solución salina (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330-A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microinyección PicoSpritzer</td><td>Parker Instrumentation Products</td><td>PicoSpritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Pins&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Polisacarosa (Ficoll PM 400 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td>Uso al 3% en 0,1x MBS</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Alimento para freír en polvo : SERA Micron Nature</td><td>SERA</td><td>45475 (00720)</td><td></td></tr><tr><td>Disección de tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Slide Superfrost&nbsp;</td><td>&nbsp; KNITTEL Vidrio</td><td>VS11171076FKA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de portaobjetos</td><td>Kunz instruments</td><td>HP-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio sal trisódica dihidratada (C6H5Na3O7, 2H2O)</td><td>Productos químicos VWR</td><td>27833.294</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de hidrógeno de sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.06329</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio al 30% solución acuosa (NaOH)</td><td>Productos químicos de VWR</td><td>28217-292</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas Omnifix-F Solo de un solo uso 1 mL</td><td>B-BRAUN</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>crRNA transactivador (tracrRNA)</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td></td><td></td>1072533</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 200DC Iluminador de fluorescencia</td><td>X-Cite&nbsp;</td><td>200DC</td><td></td></tr><tr><td>Xileno &ge; 98.5%&nbsp;</td><td>Productos químicos VWR</td><td>28975-325</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de modelos de lesiones retinianas en renacuajos de xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son las principales causas de ceguera. Entre las numerosas estrategias terapéuticas que se están explorando, la estimulación de la autorreparación ha surgido recientemente como particularmente atractiva. Una fuente celular de interés para la reparación de la retina es la célula glial de Müller, que alberga potencial de células madre y una extraordinaria capacidad regenerativa en los anamniotas. Sin embargo, este potencial es muy limitado en los mamíferos. El estudio de los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración de la retina en modelos animales con capacidades regenerativas debería proporcionar información sobre cómo desbloquear la capacidad latente de las células de Müller de mamíferos para regenerar la retina. Este es un paso clave para el desarrollo de estrategias terapéuticas en medicina regenerativa. Con este objetivo, desarrollamos varios paradigmas de lesión retiniana en Xenopus: una lesión retiniana mecánica, una línea transgénica que permite la ablación condicional de fotorreceptores mediada por nitroreductasa, un modelo de retinosis pigmentaria basado en la eliminación de rodopsina mediada por CRISPR/Cas9 y un modelo citotóxico impulsado por inyecciones intraoculares de CoCl2 . Destacando sus ventajas y desventajas, describimos aquí esta serie de protocolos que generan diversas condiciones degenerativas y permiten el estudio de la regeneración retiniana en Xenopus.

Lesión mecánica de la retina Las secciones retinianas de renacuajos sometidos a la lesión mecánica descrita en la sección 1 del protocolo muestran que la lesión retiniana abarca todas las capas del tejido y se limita al lugar de punción (Figura 2A, B).
Ablación condicional de bastones mediante el sistema NTR-MTZ Los ojos de renacuajos transgénicos Tg(rho:GFP-NTR) anestesiados tratados con tratamient...

Hemos desarrollado varios protocolos para inducir daño retiniano o degeneración retiniana en renacuajos de Xenopus laevis . Estos modelos ofrecen la posibilidad de estudiar los mecanismos de regeneración de la retina.

Generación de modelos de lesiones retinianas en renacuajos de Xenopus

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

Mi laboratorio trabaja en la regeneración de la retina. Estamos utilizando la rana Xenopus como sistema modelo. Este anfibio es realmente fascinante porque, a diferencia de los mamíferos, como nosotros, puede regenerar su retina de manera muy eficiente en caso de lesión.Y estamos estudiando el mecanismo subyacente porque, en el futuro, podría ser útil para desencadenar la regeneración de la retina en pacientes humanos afectados por enfermedades neurodegenerativas de la retina. Recientemente hemos descubierto que, además de las células madre en la periferia de la retina y el epitelio pigmentado de la retina, las células neurogliales también pueden ser reclutadas para la regeneración de la retina en caso de lesión. Por lo tanto, ahora estamos estudiando los vínculos entre la neuroinflamación y la capacidad regenerativa de estas células.De hecho, parece que el nicho neuroinflamatorio es un actor clave en la modulación de la regeneración de la retina. Para estudiar los mecanismos celulares y moleculares implicados en la regeneración de la retina, desarrollamos varios paradigmas de lesión retiniana en Xenopus. La primera es una lesión mecánica de la retina.La segunda es una línea transgénica que permite la ablación condicional de fotorreceptores mediada por nitroreductasa. El tercero es un modelo de retinosis pigmentaria basado en el knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9 y, para terminar, un modelo citotóxico impulsado por inyección intraocular de cloruro de cobalto o CoCl2. Mi laboratorio anfitrión ha demostrado que, aunque Xenopus puede regenerar su retina, la eficiencia es muy variable y depende de las etapas del renacuajo o de la especie, Xenopus laevis o tropicalis.Esto convierte a Xenopus en un modelo fantástico para ilustrar los mecanismos moleculares que desencadenan o limitan la regeneración de la retina.

generating-retinal-injury-models-in-xenopus-tadpoles

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína de destino en la retina del pez cebra adulto se describe, lo que implica la inyección intravítrea morfolinos antisentido y electroporating ellos en la retina. La proteína resultante es derribado por varios días, lo que permite realizar pruebas de función de la proteína en la regeneración o la retina intacta.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Xenopus laevis proporciona un sistema modelo ideal para el estudio de la especificación del destino celular y la función fisiológica de las células individuales de la retina en cultivo de células primarias. Aquí se presenta una técnica para la disección de tejidos retinales y la generación de cultivos de células primarias que se toman imágenes de la actividad del calcio y se analizaron mediante hibridación in situ.

Disección, Cultura y Análisis de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tejido de la retina embrionaria

El video muestra un método para cultivar células ganglionares primarias de la retina de embriones de pez cebra. Los embriones en etapa temprana se someten a disección para aislar los ojos, que posteriormente se disocian mecánicamente en una suspensión de células ganglionares de la retina. Esta suspensión celular se cultiva en cubreobjetos recubiertos con proteínas adhesivas para facilitar el desarrollo de los axones.

Generación de cultivos primarios de ganglios angulares de la retina a partir de embriones de pez cebra

Este video muestra un procedimiento para inducir la degeneración de la retina en peces cebra adultos utilizando lesiones por láser. El láser se dirige a las células fotorreceptoras de la retina, lo que provoca la muerte celular y un proceso degenerativo. Este daño activa las células de la glía de Müller (MG), lo que lleva a su desdiferenciación en progenitores de células madre que ayudan en la regeneración de la retina.

Modelado de la degeneración y regeneración de la retina en el pez cebra mediante una lesión focal con láser

Múltiples protocolos de daño de la luz se han descrito a daños fotorreceptores y, por consiguiente inducir una respuesta de la regeneración de la retina en adultos de pez cebra. Este protocolo describe un método mejorado que se puede utilizar en animales pigmentados y que daña la gran mayoría de la varilla y fotorreceptores de los conos a través de toda la retina.

Una novela ligera Paradigm daños para su uso en estudios de regeneración retiniana en adultos de pez cebra

Xenopus laevis renacuajos prefieren nadar en la parte blanca de un / tanque blanco negro. Este comportamiento es guiado por su visión. Sobre la base de este comportamiento, se presenta un ensayo simple para probar la función visual de los renacuajos.

Un ensayo de comportamiento simple para Pruebas de función visual en<em&gt; Xenopus laevis</em

Este protocolo describe un método para diseccionar, experimentalmente manipular y explantes de cultivo completo de la retina a partir de embriones de pollo. Los cultivos de explantes son útiles cuando alta tasa de éxito, la eficacia y reproducibilidad son necesarios para probar los efectos de plásmidos para la electroporación y / o sustancias de reactivos, es decir, inhibidores enzimáticos.

Los explantes de retina enteras de pollo embriones para Tratamientos electroporación y Reactivos Químicos

la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

Este protocolo tiene como objetivo demostrar cómo microinyectar una mezcla de ADN/DOTAP en los auriculares de embriones Xenopus laevis de un día de edad, y cómo imagen y reconstrucción de proteínafluorescentes verdes individuales (GFP) expresando árboles axonales ópticos en intactos, los renacuajos vivos de Xenopus.

Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos

Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando un modelo de pez cebra transgénico. La adaptación del protocolo para incorporar la modulación de la vía de señalización utilizando compuestos farmacológicos es ampliamente detallada. Se desarrolló una plataforma de MATLAB para cuantificar la regeneración de RPE basada en la pigmentación, que se presenta y discute.

Ablación mediada por nitrorreductasa/metronidazol y una plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudiar la regeneración del epitelio pigmentario de la retina del pez cebra

Aprende a generar modelos de lesiones retinianas en renacuajos de Xenopus laevis para estudiar regeneración ocular. Este método permite investigar mecanismos de reparación con células gliales de Müller.

Generación de modelos de lesiones retinianas en renacuajos de Xenopus

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