Name: Biobanco de biopsias líquidas acuosas y vítreas humanas para análisis moleculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Aprenda a establecer un biobanco estandarizado de biopsias líquidas oculares humanas (humor acuoso y vítreo) para análisis moleculares. Este protocolo facilita la investigación de enfermedades oculares mediante proteómica, glicómica y metabolómica.

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VBM cuenta con el apoyo de subvenciones de los NIH (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 y P30EY026877), el Centro de Stanford para Drusas de Disco Óptico e Investigación para Prevenir la Ceguera, Nueva York, EE. JW y DR cuentan con el apoyo de la VitreoRetinal Surgery Foundation, EE. DR cuenta con el apoyo de la beca DARE, patrocinada por la Fundación Lundbeck.

El protocolo sigue las directrices de la Junta de Revisión Institucional para la Investigación en Sujetos Humanos (IRB) de la Universidad de Stanford, EE.
PRECAUCIÓN: Este protocolo es una guía para cirujanos oftalmológicos calificados. En el contexto de las neoplasias malignas intraoculares, no se puede descartar la siembra de tumores extraoculares en el contexto de biopsias de humor acuoso o líquido vítreo. Sin embargo, el riesgo de extensión extraocular y afectación orbitaria es extremadamente bajo en la biopsia transvítrea del tumor coroideo, que se realiza de manera segura y con una cuidadosa consideración del sitio de entrada6. Este protocolo no cubre y puede estar contraindicado en casos de retinoblastoma o tumores con alto riesgo metastásico.
1. Antes de la recogida de la muestra
<ol><li>Aprobación de la junta de revisión institucional
	<ol><li>Obtenga las aprobaciones del IRB local antes del inicio del experimento y realice la recolección de muestras en consecuencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Población de estudio
	<ol><li>Criterios de inclusión: Incluir a todos los pacientes (de 0 a 99 años) que se someten a cirugía intraocular en la institución que proporcionará una cantidad adecuada de humor acuoso o líquido vítreo superior a la requerida para las pruebas diagnósticas adecuadas para evaluar la condición del paciente y los pacientes que desean participar.</li>
		<li>Criterios de exclusión: Excluir a los pacientes que se niegan a participar y a las mujeres embarazadas.</li>
	</ol></li>
</ol>
<ol start="3"><li>Consentimiento informado
	<ol><li>Obtener el consentimiento informado por escrito de cada paciente siguiendo el protocolo aprobado por el IRB.</li>
		<li>Archive el consentimiento firmado en una base de datos segura.</li>
		<li>Capacitar al personal involucrado (cirujanos, técnicos de laboratorio, personal de quirófano, científicos) como se describe en este protocolo.</li>
		<li>Configure una base de datos de administración de ejemplo. Utilice REDCap como una base de datos de muestra basada en la web compatible con HIPAA que está diseñada para admitir la captura de datos para estudios de investigación5. Nota: En este artículo se describe el uso de la interfaz basada en web proporcionada por REDCap para diseñar formularios, definir campos, configurar lógica de bifurcación y aplicar reglas de validación de datos sin necesidad de amplios conocimientos de programación. Alternativamente, otro software, como las aplicaciones de hoja de cálculo estándar, también puede ser adecuado.</li>
		<li>Asegúrese de la disponibilidad de una caja de enfriamiento, hielo seco, jeringa para la recolección de muestras y crioviales (consulte la Tabla de materiales). Use crioviales con códigos de barras que estén grabados permanentemente en los viales. Esto elimina la necesidad de agregar identificadores de pacientes en el vial y la posibilidad de perder una etiqueta en condiciones de congelación.</li>
		<li>Notifique al cirujano sobre el caso y al técnico de laboratorio que ayudará con la recolección de muestras en el quirófano al menos 24 horas antes de la cirugía programada.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Adquisición de muestras quirúrgicas en quirófano
<ol><li>Interfaz de laboratorio de quirófano móvil (MORLI)
	<ol><li>Establecer un MORLI en el quirófano. MORLI incluye una superficie plana de laboratorio, una computadora/tableta con un escáner de código de barras con acceso a la base de datos REDCap y una caja de enfriamiento con hielo seco (consulte la Tabla de materiales). PRECAUCIÓN: El hielo seco es extremadamente frío. Siempre use guantes cuando manipule hielo seco y evite tocarlo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la recogida de muestras en el quirófano
	<ol><li>Inicie sesión en la computadora / tableta en MORLI y abra la base de datos REDCap.</li>
		<li>Compruebe que el consentimiento informado ha sido firmado por el paciente y confírmelo con el cirujano. Recuérdele que se requiere una muestra sin diluir.</li>
		<li>Use guantes. Obtenga el número adecuado de crioviales con código de barras (0,5 ml para el humor acuoso y 1,9 ml para muestras vítreas) y colóquelos donde sean fácilmente accesibles.</li>
	</ol></li>
	<li>Colección de biopsias líquidas de humor acuoso PRECAUCIÓN: Considere las muestras de tejido humano como material biopeligroso, lo que requiere precauciones adecuadas, como una bata de laboratorio y guantes para garantizar la seguridad del personal involucrado. NOTA: Los siguientes pasos solo deben ser realizados por un cirujano oftalmológico capacitado. Se pueden obtener biopsias líquidas de humor acuoso, por ejemplo, al inicio de la cirugía de cataratas, una de las cirugías más frecuentes a nivel mundial. NOTA: Se mantiene un campo estéril según los protocolos estándar de atención en la sala de operaciones. Los procedimientos preoperatorios relacionados con la anestesia del paciente siguen los pasos estándar de atención para las cirugías de cámara anterior y vitreorretinianas.<ol><li>Prepare y cubra el ojo para la cirugía y coloque un espéculo de párpado estéril para una visualización óptima del campo estéril.</li>
		<li>Use un microscopio quirúrgico para realizar una paracentesis de cámara anterior perpendicular al limbo usando una aguja de 30-32 G conectada a una jeringa de 1 ml. Use una punta de algodón o fórceps pequeños para estabilizar el ojo durante este procedimiento. NOTA: Asegúrese de que la aguja y la jeringa estén bloqueadas y que no haya presión en la jeringa (moviendo el émbolo). Asegúrese de que la punta de la aguja permanezca sobre el iris periférico en la cámara medio-anterior para evitar daños en las estructuras intraoculares. En el caso de la cirugía de cataratas, la aguja para obtener la biopsia líquida también puede entrar en la cámara anterior a través de uno de los paracentesis que se crean para la cirugía de cataratas.</li>
		<li>Bajo visualización directa a través del microscopio, aspirar manualmente aproximadamente 100 μL de humor acuoso sin diluir usando una jeringa de 1 ml. Mueva el émbolo de la jeringa con la mano no dominante del cirujano o por un asistente capacitado sin mover la aguja. NOTA: Obtener menos de 100 μL de humor acuoso en caso de colapso de la cámara anterior.</li>
		<li>Retire con cuidado la aguja de la cámara anterior. NOTA: En un ojo fáquico, mantenga la aguja sobre el iris para evitar tocar la lente. La presión positiva sobre el globo puede aumentar el reflujo. Liberar la punta de algodón antes de retirar la aguja ayuda a reducir el reflujo.</li>
		<li>Tire hacia atrás del émbolo y vea cómo se mueven el aire y el fluido recogido.</li>
		<li>Inyecte la jeringa en el criovial. El aire extra despeja el espacio muerto de la jeringa.</li>
		<li>Use el código de barras en el criovial para escanear la muestra al formulario REDCap en una computadora en la sala de operaciones (más detalles en los pasos 3.1 a 3.9).</li>
		<li>Transfiera inmediatamente el criovial al hielo seco en la caja de enfriamiento.</li>
		<li>Continúe con la cirugía programada para el paciente (p. ej., una cirugía de cataratas como se describió anteriormente7 ).</li>
	</ol></li>
	<li>Colección de biopsias líquidas vítreas NOTA: Los siguientes pasos solo deben ser realizados por un cirujano vitreorretiniano capacitado. Las biopsias líquidas vítreas se pueden obtener al comienzo de una vitrectomía8. Dado que el objetivo es recolectar una muestra vítrea sin diluir, el cortador de vitrectomía no se cebará con líquido1. NOTA: Se mantiene un campo estéril según los protocolos estándar de atención en la sala de operaciones. Los procedimientos preoperatorios relacionados con la anestesia del paciente siguen los pasos estándar de atención para las cirugías de cámara anterior y vitreorretinianas.<ol><li>Prepare y cubra el ojo para la cirugía y coloque un espéculo de párpado estéril para una visualización óptima del campo estéril.</li>
		<li>Cree esclerotomías con una cánula de trócar de 23, 25 o 27 G, siguiendo los procedimientos de atención estándar. Inserte la cánula de infusión y confirme visualmente la colocación adecuada en la cavidad vítrea.</li>
		<li>En la cavidad vítrea, active el cortador vítreo sin perfusión para recoger una muestra vítrea sin diluir. Aspirar manualmente 0.5 a 1.0 ml de vítreo usando una jeringa que está conectada a la cánula de extrusión vítrea1.</li>
		<li>Retire el cortador vítreo del ojo y encienda la infusión de líquido.</li>
		<li>Aspire el líquido restante dentro del tubo en la jeringa.</li>
		<li>Desconecte la jeringa.</li>
		<li>Procesar la muestra como se describe para una muestra de humor acuoso en la sección 2.3 (paso 2.3.5 a paso 2.3.9).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Procesamiento de muestras en el quirófano y adición de muestras a la base de datos
<ol><li>Pídale al técnico de laboratorio que tome el criovial preparado (0.5 ml para el humor acuoso y 1.9 ml para las muestras vítreas) y camine hasta el cirujano sin tocar ningún equipo estéril o quirófano.</li>
	<li>Pídale al técnico de laboratorio que abra el criovial.</li>
	<li>Descargue la jeringa directamente en el criovial.</li>
	<li>Pídale al técnico de laboratorio que vuelva a tapar inmediatamente el criovial.</li>
	<li>Pídale al técnico de laboratorio que regrese al MORLI e inmediatamente transfiera la muestra al hielo seco en la caja de enfriamiento (-80 ° C). Cierre la tapa de la caja.</li>
	<li>Abra un nuevo formulario de recogida de muestras. Ingrese la siguiente información en el campo respectivo del formulario: cirujano del caso, lugar y fecha de recolección, número de identificación del paciente y otra información básica, como edad, sexo, ojo derecho o izquierdo, diagnóstico, historial preoperatorio (texto libre), información sobre el procedimiento (por ejemplo, tipo de cirugía), así como información sobre las muestras, como el número de muestras recolectadas, Tipo de muestras (humor acuoso, vítreo), y otros detalles como volúmenes. Agregue el código de barras del tubo utilizando el escáner de código de barras.</li>
	<li>Haga clic en Enviar/Siguiente.</li>
	<li>Repita los pasos 3.1 a 3.7 si se recogen muestras adicionales.</li>
	<li>Cuando todas las muestras estén protegidas, haga clic en Guardar y enviar en el formulario de recopilación de muestras de REDCap. A continuación, cierre la sesión de la base de datos y de la computadora/tableta.</li>
</ol>4. Transferencia de crioviales al almacenamiento
<ol><li>Transporte las muestras en hielo seco en la caja de enfriamiento desde el quirófano hasta el laboratorio y colóquelas en un banco de laboratorio junto a una computadora de laboratorio.</li>
	<li>Inicie sesión en REDCap en la computadora del laboratorio con su ID de inicio de sesión y contraseña.</li>
	<li>Use guantes. Tome una de las muestras recogidas y escanee el código de barras del criovial en la base de datos (más detalles en la sección 5). Coloque inmediatamente la muestra de nuevo en hielo seco.</li>
	<li>Obtenga un segundo recipiente lleno de hielo seco.</li>
	<li>Obtenga una rejilla para los crioviales del congelador de -80 °C. Colóquelo en el segundo recipiente sobre hielo seco. NOTA: Se necesitará un rack de 96 formatos para los tubos de humor acuoso de 0,5 ml y un rack de 48 formatos para los tubos vítreos de 1,9 ml.</li>
	<li>Escanee el código de barras del rack a la base de datos (más detalles en la sección 5).</li>
	<li>Transfiera la muestra al bastidor.</li>
	<li>Añadir la posición de los viales en el bastidor a la base de datos (más detalles en la sección 5).</li>
	<li>Haga clic en Guardar y enviar.</li>
	<li>Transporte la rejilla con los viales en hielo seco a la nevera para su almacenamiento a -80 °C. Agregue la rejilla a una posición específica en el refrigerador usando un sistema de coordenadas. Esto más tarde permitirá recuperar muestras para el análisis posterior fácilmente.</li>
</ol>5. Formulario de almacenamiento de muestras
<ol><li>Complete un formulario de almacenamiento para cada muestra que se recolecte durante la fase del formulario de inscripción. Haga clic en el círculo vacío o en el "+" en Almacenamiento de muestras para crear y abrir un nuevo formulario de almacenamiento.</li>
	<li>Introduzca la fecha en que se ha completado este formulario en Fecha de archivo de registros.</li>
	<li>Escanee o escriba el código de barras del tubo en Código de barras del tubo de muestra. Coloque inmediatamente la muestra de nuevo en hielo seco.</li>
	<li>Seleccione si una muestra se transfiere o si la muestra va al almacenamiento interno del biorepositorio.</li>
	<li>Verifique que se obtuvo el consentimiento informado por escrito del paciente y seleccione la casilla debajo de Verificar el cumplimiento del consentimiento e ingrese su nombre en Consentimiento verificado por.</li>
	<li>Seleccione una ubicación libre y adecuada para el criovial en el bastidor. Transfiera el criovial en esta posición al bastidor (p. ej., posición A1). Mantenga la rejilla sobre hielo seco.</li>
	<li>En la fase de ubicación, introduzca la siguiente información: la ubicación del congelador en Congelador, el número de estante donde se almacenará la muestra en Estante, el código de barras de la caja en el código de barras de la caja, la posición del tubo en la caja por fila (Posición del tubo (fila)) y la columna (Posición del tubo (Columna)). NOTA: Opcionalmente, también se puede introducir una etiqueta de caja en Etiqueta de caja, lo que puede facilitar encontrar la caja en el congelador.</li>
	<li>En la sección Uso , escriba la siguiente información: el nombre del proyecto para el que se utiliza la muestra (Nombre del proyecto), el volumen de muestra en una de las siguientes categorías: lleno, parcial, casi vacío o vacío (Volumen de muestra) y notas de almacenamiento, si corresponde, en Notas de almacenamiento. NOTA: La fecha, la hora y el usuario que accedió por última vez al formulario se rellenan automáticamente para garantizar una cadena de custodia que se puede revisar y auditar según sea necesario.</li>
	<li>Confirme que el formulario se ha completado haciendo clic en Completar en ¿Completar?.</li>
	<li>Haga clic en Guardar y salir del formulario. Esto lo llevará de vuelta a la descripción general del paciente.</li>
	<li>Para cada tubo que se recolectó, genere otro formulario de recolección de muestras haciendo clic en el "+" en Almacenamiento de muestras. A continuación, repita los pasos 5.1 a 5.10.</li>
	<li>Haga clic en Guardar y salir para completar el formulario y cerrar sesión en la base de datos y en el equipo o tableta.</li>
	<li>Transfiera la rejilla de muestras (sobre hielo seco) a la nevera en la posición especificada previamente.</li>
</ol>6. Recuperación de muestras quirúrgicas para análisis posterior
NOTA: Los especímenes a menudo se archivan durante varios años antes de ser analizados. Los crioviales con código de barras y el sistema de base de datos REDCap permiten encontrar y localizar cada muestra fácilmente para el análisis posterior.
<ol><li>Identifique muestras de interés para el experimento utilizando la función de búsqueda de la base de datos. Esto permitirá encontrar, por ejemplo, todas las muestras de humor acuoso de pacientes entre 20 y 40 años con retinopatía diabética.</li>
	<li>Obtenga la ubicación de los crioviales de interés (congelador, estante / estante, estante de muestras, coordenadas dentro del estante). Escríbalos, imprímalos o téngalos disponibles en una computadora / tableta móvil para facilitar la búsqueda de las muestras en el congelador.</li>
	<li>Marque los ejemplos como utilizados en la base de datos.</li>
	<li>Haga clic en Guardar y salir para completar el formulario y cerrar sesión en REDCap y en la computadora/tableta.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las muestras quirúrgicas de pacientes permiten la caracterización molecular directa de la enfermedad en humanos vivos 2,3,4,14, y pueden ayudar a superar las limitaciones de los modelos de enfermedades celulares y animales que no recapitulan completamente la enfermedad humana 15,16. El análisis molecular del tejido humano podría mejorar la selección de nuevas dianas farmacológicas y podría contribuir a una mayor tasa de éxito de los ensayos clínicos y la aprobación de medicamentos17. Además, este enfoque ofrece el potencial para la medicina personalizada, ya que el tejido obtenido conserva la huella genómica, epigenómica, metabolómica, glucómica y proteómica única de cada individuo 2,18,19.
La calidad de muestra alta y consistente es fundamental para todas las aplicaciones de análisis molecular. Estudios previos han demostrado que la congelación inmediata después de la recuperación de la muestra y evitar ciclos repetidos de congelación/descongelación son críticos para altas calidades de muestra 9,20. El almacenamiento a largo plazo durante varios años a -70 °C no afectó significativamente la integridad del perfil proteómico9. Un protocolo estandarizado es una base importante para reducir el sesgo y mejorar la comparabilidad de los datos científicos, especialmente cuando varias personas (cirujanos, técnicos y otros) o diferentes instituciones están involucradas en el proceso de muestreo. Además de la calidad de la muestra, la anotación de las muestras es otro factor importante que requiere estandarización para permitir la correlación de los hallazgos moleculares con los datos clínicos. Nuestro protocolo se basa en tres principios esenciales para lograr esto: 1) un procedimiento de muestreo estandarizado para el humor acuoso y biopsias líquidas vítreas por un cirujano oftalmológico, 2) el procesamiento inmediato y la congelación rápida de muestras en el quirófano por parte del personal del laboratorio, y 3) una anotación de metadatos de cada muestra en una base de datos basada en la web que permite a los investigadores encontrar rápidamente muestras para experimentos posteriores.
Además de las muestras vítreas20, este flujo de trabajo también establece la colección estandarizada de biopsias líquidas de humor acuoso para el análisis molecular. El humor acuoso es un líquido complejo y altamente accesible en la cámara anterior del ojo que no sólo refleja enfermedades oculares del segmento anterior sino también del segmento posterior del ojo, incluyendo la enfermedad retiniana18,21. Junto con el hecho de que se puede recolectar un gran número de muestras de humor acuoso, por ejemplo, durante la cirugía de cataratas, una de las cirugías más frecuentes en todo el mundo, estas características la convierten en una fuente interesante de biopsias líquidas del ojo humano. La anotación estandarizada de metadatos de cada muestra establecida en este flujo de trabajo también podría permitir la correlación de los datos del proteoma con los datos de seguimiento clínico prospectivo. Esto brinda la emocionante oportunidad de identificar nuevos biomarcadores pronósticos que pueden ayudar a estimar el pronóstico para futuros pacientes.
Sin embargo, el análisis molecular de muestras quirúrgicas humanas también tiene limitaciones importantes. Por ejemplo, las manipulaciones experimentales complejas a menudo solo son posibles en modelos animales y celulares. Una solución puede ser comparar el perfil molecular de modelos animales o celulares con el de la enfermedad humana. Esta estrategia puede identificar biomarcadores de proteínas superpuestos y dianas terapéuticas que pueden ser validadas en animales o modelos celulares para identificar los candidatos más prometedores que se correlacionan con la enfermedad humana y que tienen probabilidades de tener éxito en los ensayos clínicos 4,16.
En conclusión, nuestro flujo de trabajo establece una interfaz práctica entre el quirófano y el laboratorio de investigación que permite la recolección, anotación y almacenamiento estandarizados y de alto rendimiento de muestras quirúrgicas de alta calidad para el análisis molecular posterior, proporcionando una base valiosa para futuras investigaciones traslacionales.

El perfil molecular de biopsias líquidas del ojo humano puede capturar fluidos enriquecidos localmente que contienen moléculas como ADN, ARN, proteínas, glicanos y metabolitos de tejidos oculares altamente especializados. Las biopsias líquidas del vítreo en la cámara posterior del ojo humano demostraron ser un procedimiento generalmente seguro1. Permiten la caracterización molecular de enfermedades oculares en humanos vivos y ofrecen el potencial de identificar nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas 2,3,4. El humor acuoso en la cámara anterior del ojo tiene una accesibilidad quirúrgica aún mayor y podría obtenerse en grandes cantidades, por ejemplo, durante la cirugía de cataratas, que es una de las cirugías más frecuentes. Sin embargo, hasta ahora no se dispone de un protocolo estandarizado para la recopilación, anotación y bioalmacenamiento de humor acuoso humano y biopsias líquidas vítreas para análisis moleculares posteriores, incluida la proteómica, la metabolómica y la glucómica.
Aquí, desarrollamos un protocolo para la recolección y bioalmacenamiento de biopsias líquidas de alta calidad para análisis moleculares de pacientes sometidos a cirugía ocular. Una interfaz de laboratorio de quirófano móvil (MORLI) permite a un investigador congelar inmediatamente las muestras recogidas en crioviales con código de barras en hielo seco a -80 ° C en la sala de operaciones (OR). Este procedimiento garantiza una calidad de muestra alta y consistente para el análisis molecular posterior. Además de la excelente calidad de la muestra, la anotación precisa de las muestras en un biobanco es fundamental. Utilizandouna base de datos REDCap (captura electrónica de datos de investigación) 5 compatible con HIPAA (Ley de Portabilidad y Responsabilidad del Seguro de Salud) basada en la web, nuestro flujo de trabajo permite el almacenamiento de metadatos detallados para cada muestra, incluida la edad, el sexo, la enfermedad, la etapa de la enfermedad, el tipo de muestra y las características únicas de la cirugía. Esto permitirá una capacidad de búsqueda futura precisa, por ejemplo, para muestras de una enfermedad específica o un grupo particular de pacientes. Además, la ubicación exacta de cada muestra en el congelador se archiva utilizando un sistema de cuadrícula cartesiana, que permite una recuperación eficiente de muestras para experimentos posteriores. Mostramos ejemplos de análisis de ADN, proteínas, glicanos y metabolitos.
Nuestro flujo de trabajo representa una conexión práctica y efectiva entre el quirófano y el laboratorio de investigación y proporciona una base valiosa para la investigación traslacional.

<table><tbody><tr><td>Tubo tricodificado de 0,5 ml, formato 96, rosca externa</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, EE. UU.</td><td>68-0703-12</td><td>utilizado para muestras acuosas de humor</td></tr><tr><td>Jeringa de grado quirúrgico de 1 mL</td><td>, lo que esté disponible en el hospital,</td><td></td> <td>para biopsias acuosas de humor</td></tr><tr><td>Tubo tricodificado de 1,9 ml, formato 48, rosca externa</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, EE. UU</td>. <td>65-7643</td><td>utilizado para muestras vítreas</td></tr><tr><td>Jeringa de 3 mL de</td><td>grado quirúrgico, lo que esté disponible en el hospital-para</td><td></td> <td>biopsias vítreas Aguja</td></tr><tr><td>de calibre 30-32</td> grado <td>quirúrgico, lo que esté disponible en el hospital-para</td><td></td> <td>biopsias de humor acuoso</td></tr><tr><td>Electroforesis capilar acoplada a espectrometría de masas transformada de Fourier (CE-FTMS)</td><td>Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japón</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Sistema de vitrectomía Constellation con sistema de cánula de trocar de calibre 23, 25 o 27</td><td>Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, EE. UU.</td><td></td> <td>para biopsias vítreas</td></tr><tr><td>Caja de enfriamiento</td><td>Caja de espuma de poliestireno estándar, lo que esté disponible en el laboratorio</td><td>:</td><td></td></tr> <tr><td>hielo seco</td><td>Lo que esté disponible en el laboratorio</td><td>:</td> kit <td>de</td></tr> <tr><td>escáner de rango estándar manos libres con cable USB blindado Símbolo</td> de <td>cebra&nbsp;</td><td>DS9208-SR4NNU21Z</td><td>Escáner de código de barras</td></tr><tr><td>Matriz de anticuerpos de glicosilación humana L3&nbsp;</td><td>RayBiotech, Peachtree Corners, GA, EE. UU.</td><td>GAH-GCM-L3-Mac</td><td></td></tr> <tr><td>mini</td><td>Apple Inc., Cupertino, CA 95014, EE. UU</td>.<td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Software MetaboAnalyst</td><td>Pang et al., 2021, PMID: 34019663</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Rack para tubos de 0,5 ml, formato 96</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, EE. UU.</td><td>66-51026</td><td>para muestras acuosas de humor</td></tr><tr><td>Rack para tubos de 1,9 ml, formato</td> <td>48Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, EE. UU.</td><td>65-9451</td><td>para muestras vítreas</td></tr><tr><td>Base de datos de muestras basada en navegador REDCap</td><td>Consorcio REDCap, Universidad de Vanderbilt, https://www.project-redcap.org</td><td></td><td>--</td></tr></tbody></table>

biobanco de biopsias líquidas acuosas y vítreas humanas para análisis moleculares

Biobanking of Human Aqueous and Vitreous Liquid Biopsies for Molecular Analyses

Un desafío crítico en la investigación traslacional es establecer una interfaz viable y eficiente entre la atención al paciente en la sala de operaciones (OR) y el laboratorio de investigación. Aquí, desarrollamos un protocolo para adquirir biopsias líquidas de alta calidad para análisis moleculares del humor acuoso y el vítreo de pacientes sometidos a cirugía ocular. En este flujo de trabajo, se utiliza un carro Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) equipado con una computadora, un escáner de código de barras e instrumentos de laboratorio, incluido el almacenamiento en frío a bordo, para obtener y archivar muestras biológicas humanas. Una base de datos basada en la web que cumple con la privacidad de datos permite anotar cada muestra durante su vida útil, y un sistema de coordenadas cartesianas permite rastrear cada muestra con código de barras almacenada, lo que permite una recuperación rápida y precisa de muestras para análisis posteriores. La caracterización molecular de muestras de tejido humano no solo sirve como una herramienta de diagnóstico (por ejemplo, para distinguir entre endoftalmitis infecciosa y otra inflamación intraocular no infecciosa), sino que también representa un componente importante de la investigación traslacional, permitiendo la identificación de nuevos objetivos farmacológicos, el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico y terapias personalizadas.

Las muestras de biopsia líquida recolectadas pueden someterse a una variedad de análisis moleculares, incluido el análisis de ADN, proteínas, glicanos y metabolitos. Se ha demostrado antes que el almacenamiento a largo plazo durante varios años a -70 °C no afectó significativamente la integridad del perfil proteómico9. La base de datos REDCap permite la recuperación simple y rápida de muestras. La base de datos se puede buscar muestras de un grupo específico de pacientes, por ejemplo, todos los pacientes con retinopatía diabética. La base de datos proporcionará los códigos de barras de los tubos y las posiciones en almacenamiento. Hasta ahora, hemos recopilado y archivado más de 1.000 biopsias líquidas. La base de datos nos permitió encontrar rápidamente las muestras para análisis posteriores 3,10 y ayudó a realizar los siguientes experimentos.
Mujer de 17 años que presentaba inflamación de la retina y del nervio óptico. Estaba inmunocomprometida y había una preocupación por la infección. Se recogió humor acuoso de su ojo derecho y se envió para análisis de PCR de ADN. Los resultados fueron positivos para citomegalovirus y negativos para el virus del herpes simple y toxoplasmosis. Estos hallazgos ilustran que las biopsias líquidas de humor acuoso pueden ayudar a distinguir las formas infecciosas de las no infecciosas de inflamación intraocular, lo cual es fundamental para seleccionar la terapia adecuada.
La cromatografía líquida-espectrometría de masas permite un análisis imparcial y semicuantitativo del proteoma. En una biopsia líquida del vítreo de un paciente sometido a vitrectomía, la técnica pudo identificar 484 proteínas únicas, incluyendo Complemento C3 (C3), Opticina (OPTC) y Colágeno Tipo II Alfa 1 (COL2A1) (Figura 1A).
Se analizaron tres biopsias líquidas vítreas mediante un ELISA multiplex glicoproteómico (ver Tabla de Materiales)11. El ensayo detectó los perfiles de glicosilación de 500 proteínas humanas, capturando una variedad de vías biológicas, como el metabolismo, la respuesta inmune, la adhesión celular y la organización de la actina (Figura 1B).
Una pantalla metabolómica utilizando electroforesis capilar junto con espectrometría de masas transformada de Fourier12 (ver Tabla de materiales) identificó 292 metabolitos diferentes en tres muestras de biopsia líquida de humor acuoso. Un análisis de la vía (ver Tabla de materiales)13 identificó una variedad de vías metabólicas, incluyendo el metabolismo de los aminoácidos, el ciclo de la urea y la síntesis de carnitina (Figura 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65804/65804fig01.jpg"> Figura 1: Resultados representativos . (A) El análisis proteómico del humor vítreo humano mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS) identificó 484 proteínas únicas en una sola biopsia líquida. Los niveles de proteína se muestran y clasifican en función de los recuentos espectrales. Las proteínas representativas se resaltan en azul. (B) Un ELISA multiplex de glicoproteómica detectó niveles de glicosilación de 500 proteínas únicas en tres biopsias líquidas vítreas. Un análisis de interacción de proteínas STRING identificó grupos de interacciones de proteínas (se muestran grupos con al menos 10 proteínas). La vía más enriquecida significativamente se muestra para cada grupo. (C) El análisis metabolómico mediante espectrometría de masas identificó 292 metabolitos diferentes en tres biopsias líquidas de humor acuoso. Cada punto representa una muestra. La altura de la barra corresponde al número medio de metabolitos, la barra de error representa la desviación estándar. El panel derecho muestra vías significativamente enriquecidas. Se muestra el número de metabolitos detectados (numerador), así como el número total de metabolitos en cada vía (denominador). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65804/65804fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo presenta una plataforma integrada de biorepositorio para la recopilación, anotación y biobanco estandarizados de biopsias líquidas vítreas y de humor acuoso humano de alta calidad para análisis moleculares posteriores, incluida la proteómica, la metabolómica y la glucómica.

Biobanco de biopsias líquidas acuosas y vítreas humanas para análisis moleculares

A critical challenge in translational research is establishing a viable and efficient interface between patient care in the operating room (OR) and the ...

El perfil molecular de biopsias líquidas del ojo humano puede capturar fluidos enriquecidos localmente que contienen miles de moléculas diferentes de tejidos oculares altamente especializados. Permiten la caracterización molecular de enfermedades oculares en humanos vivos y de mayor potencial para identificar nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas. Aquí desarrollamos un protocolo para la recolección estandarizada y biobanco de biopsias líquidas vítreas y de humor acuoso de alta calidad durante la cirugía intraocular.Parte del protocolo es una base de datos compatible con la privacidad de datos basada en la web para anotar cada muestra a lo largo de su vida útil y el uso de un sistema de coordenadas que permite rastrear la ubicación de cada muestra con código de barras en el almacenamiento, lo que permite una recuperación eficiente de muestras para experimentos posteriores como análisis de proteínas, glicanos y metabolitos. Use un microscopio quirúrgico para realizar una paracentesis de cámara anterior perpendicular al limbo utilizando una aguja de calibre 30 a 32 conectada a una jeringa de un ml. Se puede usar una punta de algodón para estabilizar el ojo durante este procedimiento.Asegúrese de que la punta de la aguja permanezca sobre el iris periférico en la cámara anterior media para evitar daños en las estructuras intraoculares. Bajo visualización directa a través del microscopio, aspire manualmente aproximadamente cien microlitros de humor acuoso sin diluir con una jeringa de un ml. Luego, la aguja se retira cuidadosamente de la cámara anterior.En un ojo fáquico, mantenga la aguja sobre el iris para evitar tocar la lente. La presión positiva sobre el globo puede aumentar el reflujo. Liberar la punta de algodón antes de retirar la aguja ayuda a reducir el reflujo.Tire hacia atrás del plomero y vea cómo se mueve el aire y el fluido recogido. Inyecte la jeringa en el vial criogénico. El aire adicional despeja el espacio muerto de la jeringa.Aquí puede ver el código de barras que está grabado permanentemente en el vial. El código de barras se utiliza para escanear la muestra al formulario REDCap en una computadora en la sala de operaciones. El vial criogénico se transferirá inmediatamente en hielo seco en la caja de enfriamiento.Las biopsias líquidas vítreas se pueden obtener al comienzo de una vitrectomía por un cirujano vitreorretiniano capacitado. Tenga en cuenta que el cortador de vitrectomía no se cebará con líquido. En la cavidad vítrea, active el cortador vítreo sin perfusión para recoger una muestra vítrea sin diluir.Aspirar manualmente de 0,5 a un ml de vítreo con una jeringa conectada a la cánula de extrusión vítrea. Luego, la muestra se procesa como demostramos para una muestra humeral precisa. Este video es un tutorial de un formulario de recolección de muestras completado en REDCap en la vista de encuesta.Una vez que un paciente completa el consentimiento electrónico con la ayuda de un coordinador de investigación clínica, este formulario se rellena. Se puede acceder a él en el mismo dispositivo en el que el paciente recibió su consentimiento electrónico, o se puede acceder utilizando cualquier otro dispositivo aprobado. Se puede acceder a una copia del consentimiento electrónico que se completó aquí para verificar las firmas.Luego, el coordinador completa las otras secciones relevantes, incluido el tipo de consentimiento y, en esta sección azul, detalles sobre el caso en sí, como el cirujano del caso, dónde se realizó, la fecha de la recopilación y otra información relevante. En esta siguiente sección verde de pacientes, tenemos datos demográficos del paciente, que incluyen una muestra de MRN, el nombre y apellido del paciente, su sexo, fecha de nacimiento con un cálculo automático de la edad, la lateralidad del ojo afectado y la categoría de diagnóstico. Este formulario presenta lógica de bifurcación, por lo que cuando se selecciona una casilla de verificación, afecta a la apariencia de las casillas de verificación debajo de ella.En este caso, este es un segmento anterior y un caso de retina. Entonces, primero, se llena la caja de retina de diagnóstico. El coordinador ha seleccionado que se trata de un agujero macular y también se ha rellenado el cuadro de diagnóstico del segmento anterior.En este caso, parece que es una catarata. Un formulario de historial preoperatorio también se rellena como un cuadro de texto libre. Aquí, la información del EMR se puede copiar y pegar o se puede ingresar nueva información sobre el historial preoperatorio para referencia futura.A continuación, en esta sección roja, tenemos el cuadro de procedimiento. En este caso, parece que se seleccionó una vitrectomía pars plana junto con la LIO de un faro. Cualquier cosa que no se rellene aquí en ninguna de estas casillas de verificación se puede ingresar en texto libre usando estas otras casillas que están salpicadas en todo el formulario.También se completan los detalles relevantes sobre el caso en sí. Por último, en esta sección de oro, tenemos un área de recolección. Aquí se ha introducido el nombre del coordinador que recoge la muestra junto con el número de tubos de muestra que se utilizan.Una vez más, utilizando la lógica de ramificación, podemos recolectar tantas muestras como sea necesario para el caso. En este caso, se recogieron dos muestras, parece un núcleo vítreo y una muestra de líquido de la cámara anterior. Los códigos de barras de cada una de estas muestras se han escaneado aquí y se han registrado en el formulario.Finalmente, hay una sección de notas de recolección de muestras donde el coordinador puede escribir detalles relevantes, incluidos los volúmenes y la calidad del fluido extraído. En esta sección final de carga de archivos, cualquier foto, video o documentación relevante se puede cargar en el formulario y vincular. Finalmente, una vez que todo está completo, el coordinador puede hacer clic en enviar siguiente y el formulario se guarda con toda la información relevante almacenada, conectando la muestra con éxito con el paciente.Transporte las muestras en hielo seco desde el quirófano hasta el laboratorio. Inicie sesión en REDCap en el equipo del laboratorio. Tome una de las muestras recogidas y escanee el código de barras en la base de datos.Ahora, se necesita un segundo recipiente con hielo seco y un estante para los viales criogénicos. El código de barras del rack también se escaneará a la base de datos y las muestras se transferirán al rack. La posición de los viales en el bastidor se agrega a la base de datos y la entrada se guarda y se cierra.La rejilla con los viales se transporta en hielo seco al refrigerador para su almacenamiento a menos 80 grados centígrados. La rejilla se añade a una posición específica en el frigorífico mediante un sistema de coordenadas. Esto permitirá recuperar fácilmente muestras para el análisis posterior.Este vídeo es un tutorial del formulario de almacenamiento de ejemplo. Aquí, vemos el registro general del paciente. Este círculo verde indica que el formulario de entrada de recolección de muestras ya se ha completado.Este círculo vacío indica que se debe completar un formulario de almacenamiento. Se debe completar un formulario de almacenamiento para cada muestra que se recolecte durante la fase del formulario de inscripción. Al hacer clic en este círculo, accederemos al primer formulario de almacenamiento de muestras.Aquí podemos ver que se ha generado un PID y se ha enmascarado el MRN. Esa información sigue siendo accesible y se puede acceder a ella utilizando la página anterior haciendo clic en el círculo verde en el formulario de inscripción. Aquí se generará una instantánea de muestra una vez que se complete esta página.En las notas de recopilación, vemos que la información se ha importado automáticamente desde el formulario de inscripción. A continuación, en la fecha de archivo del registro, podemos ingresar la fecha en que se completa este formulario. Bajo el código de barras del tubo de muestra, escaneamos o volvemos a ingresar el código de barras del tubo que se está archivando.En tiempo real, esta instantánea de muestra se está actualizando. En esta sección, podemos seleccionar si se está transfiriendo una muestra. Aquí ingresamos esa información relevante.Por el bien de este ejemplo, vamos a indicar que esta es una muestra que va al almacenamiento interno del biorepositorio. Bajo verificación, un coordinador de investigación puede regresar y verificar que el consentimiento electrónico o el consentimiento en papel se completó con éxito y dentro de los protocolos. Se ingresa el nombre de la persona que completa esta verificación y, utilizando este menú desplegable, el verificador hace coincidir el código de barras aquí con lo que se acaba de escribir.Esto garantiza la precisión. A continuación, en esta fase de localización, vemos el congelador donde se va a almacenar la muestra. Podemos indicar el estante donde se almacenará la muestra, así como registrar el código de barras de la caja, que se puede escanear o escribir.También se puede escribir una etiqueta de caja aquí y la etiqueta se puede colocar en la caja para una mayor coincidencia. Luego se registran las dos posiciones por fila y columna. Esto garantiza que cada código de barras esté asociado con una posición dentro de la caja que se registre para recuperarlo fácilmente en el futuro.En esta sección de uso, podemos ingresar el nombre de nuestro proyecto o seleccionar uno de un cuadro desplegable. Registre el volumen de la muestra. Y aquí, la fecha y la hora, así como el usuario que accedió por última vez a este formulario, se rellenan automáticamente para garantizar una cadena de custodia que se puede revisar y auditar según sea necesario.La persona que archiva el formulario ingresa su nombre aquí e indica cualquier nota relevante aquí que pueda ser consistente con lo que desea registrar dentro de este formulario de entrada para su almacenamiento. Finalmente, hay otra sección para cargar un archivo, y una vez que todo esto se completa, este formulario se puede completar y enviar haciendo clic en guardar y salir, lo que nos lleva de vuelta a la descripción general del paciente. Por cada formulario adicional que se debe completar, por cada tubo que se debe almacenar, podemos hacer clic en este botón más para volver al formulario de almacenamiento de muestras y generar otro registro.Esta descripción general proporciona un acceso al formulario de entrada que se generó, así como a cualquier formulario de almacenamiento posterior para este registro del paciente. De esta manera, es fácilmente recuperable y accesible para cualquier persona con acceso de backend u otros permisos otorgados dentro de un REDCap. Las biopsias líquidas recolectadas pueden someterse a una variedad de análisis moleculares que incluyen proteómica, glucómica y metabolómica.La base de datos REDCap permite la recuperación simple y rápida de muestras, por ejemplo, mediante la búsqueda de muestras de pacientes con una enfermedad específica. Se trata de una paciente de 17 años que estaba inmunocomprometida y que presentaba inflamación retiniana y del nervio óptico. Preocupado por una infección, se realizó una biopsia líquida de humor acuoso y se envió para el análisis de PCR de ADN.Los resultados fueron positivos para CMV y negativos para HSV y toxoplasmosis y fueron críticos para distinguir las formas infecciosas de no infecciosas de inflamación intraocular y seleccionar la terapia apropiada. La cromatografía líquida de espectrometría de masas permite un análisis imparcial y semicuantitativo del proteoma. En una biopsia líquida del vítreo de un paciente sometido a vitrectomía, la técnica fue capaz de identificar 484 proteínas únicas, incluyendo complemento C3, óptica y colágeno tipo 2.Se analizaron tres biopsias líquidas vítreas utilizando un analizador multiplex de glicoproteómica. El ensayo detectó los perfiles de glicosilación de 500 proteínas humanas, capturando una variedad de vías biológicas como el metabolismo, la respuesta inmune, la adhesión celular y la organización de la actina. También analizamos el perfil metabolómico de biopsias líquidas de humor acuoso utilizando una forma especial de espectrometría de masas.Se identificaron 292 metabolitos diferentes en tres biopsias líquidas humanas acuosas. Un análisis de la vía identificó una variedad de vías metabólicas que incluyen el metabolismo de los aminoácidos, el ciclo de uria y la síntesis de carnitina. En conclusión, nuestro flujo de trabajo estableció una interfaz práctica entre el quirófano y el laboratorio de investigación que permite la recolección, anotación y almacenamiento estandarizados y de alto rendimiento de muestras quirúrgicas de alta calidad.Las muestras se pueden utilizar para análisis moleculares posteriores, incluidos estudios proteómicos, glucómicos y metabolómicos. Nuestro protocolo proporciona una base valiosa para futuras investigaciones traslacionales.

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