Las inyecciones intrafemorales simplificadas con ratones vivos permiten un análisis continuo de la médula ósea
10 de noviembre de 2023
Este protocolo describe la inyección intrafemoral de unas pocas células madre hematopoyéticas o leucémicas, incluidas las células editadas genéticamente, en modelos de xenoinjertos murinos, lo que no solo permitirá el trasplante rápido y seguro de células, sino también análisis seriados de la médula ósea.
Esta técnica tiene como objetivo ayudarnos a comprender mejor la biología de la hematopoyesis normal y la enfermedad en la médula ósea mediante la inyección y el trasplante seguros de muestras valiosas de pacientes en ratones por vía intraoral, seguido de la aspiración de la médula ósea. Se sabe desde hace mucho tiempo que es más eficiente trasplantar pequeñas cantidades de muestras valiosas directamente en la médula ósea de ratones para experimentos realizados por inyección intravenosa. Sin embargo, no hay videos técnicos reales, por lo que generalmente se consideraba una técnica de alto obstáculo.
Nuestro protocolo permite injertar cualquier muestra valiosa de forma fácil y segura en el ratón con un pequeño número de células. Existe una gran demanda de esta tecnología, y con la ayuda de este video, cualquiera puede aprenderla rápidamente. Esperamos que todos puedan dominar esta tecnología y contribuir significativamente al avance de la ciencia.
Para comenzar, prepare suspensiones celulares con hasta 3 millones de células de muestra utilizando 20 microlitros de tampón FACS o medio de descongelación. Manténgalos en hielo antes de la inyección. Desinfecte la pierna que contiene el fémur que se va a inyectar con tres juegos de exfoliantes alternados utilizando un exfoliante de povidona yodada o clorhexidina y esponjas de gasa empapadas en etanol al 70%.
Estabilice la pierna pellizcando el fémur con los dedos pulgar e índice. Empuje la tibia con el dedo anular o el quinto dedo para mantener la tibia doblada del fémur. Asegúrese de que la posición sea adecuada para una inyección exitosa.
Use el borde de una aguja estéril vacía de 27G para picotear el tendón rotuliano en la parte superior del fémur. Para garantizar el mejor punto de inserción, inserte la aguja 27G con una jeringa adjunta justo debajo del tendón rotuliano. Alojándola firmemente entre los dos cóndilos del fémur, gire la aguja hacia afuera y hacia arriba para alinearla paralelamente con el cuerpo del fémur.
Gire la aguja en círculos mientras la hace avanzar hacia la cavidad de la médula femoral. Inserte la aguja hasta que haya una reducción notable de la resistencia. Confirme la posición correcta de la aguja mediante el movimiento lateral.
Cree presión negativa tirando del émbolo de la aguja hacia atrás mientras mueve la aguja dentro de la cavidad de la médula ósea. Revise si hay sangre o médula en la jeringa para asegurarse de que la aguja esté en la cavidad de la médula ósea. Después de asegurarse de la colocación correcta de la aguja, retírela lentamente e inserte la jeringa que contiene la célula a través de la misma raíz.
Es importante recordar la raíz y el ángulo de la primera inyección cuando se cambia a una nueva aguja. Una vez que las células se hayan inyectado con éxito en el fémur, retire con cuidado la aguja y la jeringa, manteniendo la presión sobre la jeringa. Luego retire el ratón del cono de la nariz y colóquelo sobre una toalla de papel limpia para evitar la aspiración de la ropa de cama.
Para la recuperación, mantenga el mouse sobre una almohadilla térmica u otra superficie controlada. Asegúrese de recuperarse de la anestesia antes de volver a colocarlos en el estante del ratón. Observe a los ratones en busca de signos de angustia o infección durante las próximas 24 horas.
Comience preparándose para el procedimiento antes de aspirar la médula ósea, humedezca una jeringa de 0,5 mililitros de 27 G con CSM llenando y expulsando CSM dos o tres veces. A continuación, aspire suavemente la médula ósea del ratón anestesiado, produciendo de 20 a 50 microlitros de médula ósea. A continuación, retire completamente la aguja del fémur y suspenda la muestra aspirada en 500 microlitros de CSM.
Retire el ratón del cono de la nariz y colóquelo sobre una toalla de papel limpia para evitar la aspiración de la ropa de cama durante la recuperación. Monitoree a todos los ratones para verificar la recuperación de la anestesia antes de colocarlos en la parte posterior del estante para ratones. Células de pellets de la médula ósea con un centrifugado de cinco minutos a 300 G a cuatro grados centígrados.
Aspire el sobrenadante y agregue tampón de lisis ACK a cada tubo. Agite las células para volver a suspenderlas y colóquelas en hielo durante 5 a 10 minutos. Filtre la suspensión de la celda a través de la malla de nailon en un tubo nuevo.
Enjuague el tubo original con tampón FACS y páselo a través de la malla de nailon, celdas de pellets nuevamente girando durante cinco minutos a 300 G a cuatro grados centígrados. Aspire el sobrenadante de las células granuladas y agregue la solución de tinción que contiene los anticuerpos deseados. Mantenga los tubos en hielo durante 20 minutos.
Lave las celdas y proceda a analizarlas según la configuración experimental. Las técnicas de trasplante se pueden evaluar fácilmente con una invasión mínima de ratones utilizando una imagen de bioluminiscencia. En este caso, se observó el trasplante de una línea celular K562 derivada de humanos con Acalook en un modelo de ratón xenoinjerto en el lado del fémur inyectado.
El trasplante de HSPCs CD34 positivas resultó en más del 10 al 20% del injerto de células humanas a las ocho semanas después del trasplante. De manera similar, el trasplante de HSC derivadas de la sangre del cordón umbilical resultó en hasta un 10% de injerto humano a las ocho semanas después del trasplante. Mediante este procedimiento, se logró un trasplante exitoso adicional de HSPC derivadas de la médula ósea adulta, células madre de leucemia, HSPC derivadas de la sangre del cordón umbilical editadas con CRISPR Cas9 y iPSC derivadas de la LMA de los pacientes.
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Resumen
Este protocolo describe la técnica para la inyección intrafemoral de células madre hematopoyéticas o leucémicas en modelos murinos. Este método facilita el trasplante seguro y permite análisis seriados de la médula ósea.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Hematopoyesis
- Biología de Células Madre
- Modelos de Xenoinjertos
Antecedentes
- Comprender la hematopoyesis normal y las enfermedades relacionadas es fundamental para avanzar en la ciencia médica.
- La inyección directa en la médula ósea es más eficiente que los métodos intravenosos.
- Las técnicas anteriores carecían de recursos instructivos accesibles.
- Este protocolo tiene como objetivo simplificar el proceso para los investigadores.
Objetivo del estudio
- Permitir el injerto seguro y eficiente de valiosas muestras de pacientes en ratones.
- Proporcionar una guía instructiva clara para los investigadores.
- Mejorar la comprensión de las enfermedades hematopoyéticas.
Métodos Utilizados
- Preparación de suspensiones celulares con tampón FACS.
- Desinfección y estabilización del sitio de inyección.
- Técnica de inyección intrafemoral utilizando una aguja estéril.
- Aspiración de médula ósea para análisis tras la inyección.
Resultados Principales
- Engraftamiento exitoso de células madre derivadas de humanos en modelos murinos.
- Altas tasas demostradas de engraftamiento de células humanas a las ocho semanas.
- Transplante exitoso de diversos tipos de células madre, incluidas células editadas genéticamente.
- El protocolo permite una mínima invasión del ratón y un monitoreo eficaz.
Conclusiones
- Esta técnica proporciona un método confiable para el trasplante de células madre en investigación.
- Atiende la necesidad de protocolos accesibles en la investigación hematopoyética.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para explorar diversas afecciones hematológicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La inyección intrafemoral directa y la aspiración serial de médula ósea en ratones vivos permiten un análisis continuo y mínimamente invasivo del injerto y la función de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC). Este enfoque aborda un cuello de botella crítico en hematología preclínica al permitir la evaluación prospectiva y cuantitativa de poblaciones celulares residentes en la médula ósea utilizando muestras limitadas pero de alto valor. El método mejora la confianza predictiva en estudios traslacionales y apoya decisiones de cartera ajustadas al riesgo en investigaciones de terapias celulares y enfermedades hematológicas en etapas tempranas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa del injerto de CPHS y el resultado de linaje en un nicho de médula ósea fisiológicamente relevante.
- Apoya la reducción mecanicista de riesgos al permitir la recuperación seriada y el fenotipado de células trasplantadas a lo largo del tiempo.
- Facilita la validación funcional de poblaciones celulares editadas mediante ingeniería genética o derivadas de pacientes in vivo.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un sistema validado in vivo para evaluar la eficiencia de injerto y el destino celular utilizando un número reducido de muestras.
- Permite la medición cuantitativa y reproducible del quimerismo de médula ósea y de la composición celular tras el trasplante.
- Facilita la estandarización de ensayos para protocolos de xenoinjertos y trasplantes de células madre.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con la modelización de trastornos hematopoyéticos y las intervenciones terapéuticas relevantes para la enfermedad.
- Permite el seguimiento longitudinal del injerto y la persistencia de células humanas en modelos de xenoinjerto murino.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales mediante la correlación de los resultados en la médula ósea con los resultados funcionales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método conecta el descubrimiento inicial, la identificación de compuestos activos y la validación preclínica al permitir un análisis cuantitativo continuo del injerto de médula ósea en modelos animales vivos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la función de las CPH y sus interacciones con el nicho mediante acceso directo a la médula ósea.
- Selección: Proporciona datos cuantitativos y reproducibles de injerto para poblaciones celulares candidatas.
- Análisis: Permite mediciones seriadas del quimerismo medular y del fenotipo celular para estudios comparativos.
- Investigación Traducional: Facilita la continuidad desde hallazgos in vitro hasta la validación in vivo en modelos relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma escalable y reutilizable para diversos programas de investigación en terapias celulares y hematología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en el injerto y la función de las CPH mediante el análisis óseo directo y seriado.
- Valor operativo: Estandariza procedimientos mínimamente invasivos para estudios de trasplante de alto valor con un bajo número de células.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de continuar/desistir al proporcionar datos cuantitativos y robustos in vivo en una etapa temprana del proceso.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo de terapias celulares y activos en hematología basándose en resultados funcionales in vivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia técnica en el manejo de roedores, anestesia y técnicas de inyección intrafemoral.
- Necesita acceso a infraestructura de análisis mediante FACS y de imágenes para la caracterización celular posterior.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos de los protocolos de inyección y aspiración para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a diversas fuentes celulares, incluyendo HSPC modificadas genéticamente, derivadas de pacientes y de sangre de cordón.
- Limitado por la necesidad de un monitoreo cuidadoso después del procedimiento para asegurar el bienestar animal y la integridad de los datos.
