Name: Análisis por tomografía microcomputarizada de la rodilla en cobayas Dunkin-Hartley envejecidos después de una inyección intraarticular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprende a realizar inyecciones intraarticulares y análisis por micro-CT en cobayas Dunkin-Hartley para investigar la osteoartritis. Este método permite evaluar cambios en densidad mineral ósea y espesor trabecular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La investigación descrita en este manuscrito fue apoyada por los fondos de la Cátedra SmartState® de Carolina del Sur en Dotación para el Descubrimiento de Fármacos (PMW), la División de Recursos para Animales de Laboratorio de MUSC y el Centro de Descubrimiento de Fármacos de MUSC. Esta publicación también fue apoyada por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de subvención TL1 TR001451 y UL1 TR001450, así como por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R01DE029637.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur. El estudio siguió el principio de las 3R.
1. Preparaciones de inyecciones intraarticulares
<ol><li>Permita que los conejillos de indias Dunkin-Hartley se aclimaten a las instalaciones durante al menos una semana antes de comenzar el experimento. NOTA: Se utilizaron cuyes machos de 5 (n=2), 9 (n=1) y 12 (n=2) meses de edad. Los machos muestran un desarrollo acelerado y un fenotipo más severo de OA.</li>
	<li>Afeita el área de la rodilla con una maquinilla de afeitar eléctrica. NOTA: Tenga cuidado con los pezones medialmente.</li>
	<li>Anestesiar al conejillo de indias en una cámara de isoflurano que administra una mezcla de isoflurano al 3-5% en O2 (caudal de 2,5 L/min) y luego transferir al conejillo de indias a un cono de nariz conectado a un circuito de anestesia sin reinhalación. Ajustar el isoflurano para mantener el plano quirúrgico de anestesia durante la inyección, normalmente con un caudal de oxígeno de 0,5-1 L/min y 1-3% de isoflurano. NOTA: Las inyecciones intraarticulares causan un dolor leve y momentáneo. Los animales son anestesiados durante el procedimiento para evitar la percepción de estímulos dolorosos y mejorar la precisión de la inyección. En el estudio presentado, la administración de analgésicos, incluyendo antiinflamatorios no esteroideos, interferiría con la progresión de la OA21. Debido al dolor momentáneo, la anestesia proporcionada y el potencial de los analgésicos para confundir al modelo, no se administraron analgésicos a menos que los animales mostraran efectos secundarios, incluyendo cojera y signos de dolor a la palpación articular después de la inyección. Los investigadores deben considerar el uso de analgésicos para las inyecciones de rutina. Se recomiendan analgésicos cuando se presentan efectos secundarios. Los regímenes analgésicos deben ser discutidos con el veterinario institucional y aprobados por la IACUC antes de iniciar los estudios.</li>
	<li>Asegúrese de que el conejillo de indias esté a la profundidad de anestesia adecuada por falta de respuesta de pellizco del dedo del pie.</li>
	<li>Coloque lubricante ocular estéril en ambos ojos para prevenir la desecación y las lesiones.</li>
	<li>Diluya betadine con agua estéril al 10%.</li>
	<li>Diluya etanol de 200 grados con agua estéril hasta obtener etanol al 70%.</li>
	<li>Preparar las soluciones inyectables, en una cabina de bioseguridad para mantener la esterilidad. En el protocolo presentado, se utilizó un vehículo estéril (solución salina tamponada con fosfato 1x) para inyectar ambas rodillas. Las soluciones se pueden cambiar en función de los objetivos de la investigación. NOTA: Asegúrese de diluir las soluciones frescas para inyección inmediatamente antes de la sesión de inyección para garantizar la esterilidad. Cualquier solución no utilizada debe desecharse al final de cada sesión de inyección.</li>
	<li>Llene las jeringas estériles de insulina de un solo uso con soluciones inyectables. Tenga cuidado de utilizar el volumen más pequeño posible para evitar sobrecargar el espacio de la junta con volumen. En el presente estudio se utilizaron 50 μL.</li>
	<li>Coloque el conejillo de indias y el cono de la nariz sobre una superficie limpia con una almohadilla térmica para soporte térmico y acolchado debajo de la cabeza para elevarla ligeramente.</li>
	<li>Use bata quirúrgica, redecilla para el cabello, guantes estériles y mascarilla mientras realiza el procedimiento de inyección.</li>
	<li>Vierta betadine al 10% en una bola de algodón y limpie ambas áreas de las rodillas.</li>
	<li>Vierta etanol al 70% en una bola de algodón y limpie ambas áreas de las rodillas.</li>
	<li>Repita 1.12 y 1.13 dos veces más. NOTA: Para fines de demostración, el video correspondiente muestra la limpieza de la rodilla y el sitio de inyección una vez con 10% de betadine y 70% de etanol. Posteriormente, el lugar de inyección se limpió con movimientos circulares dos veces más, alternando estas soluciones. Se recomiendan tres exfoliantes en serie alternando soluciones de exfoliante y alcohol para lograr una técnica aséptica.</li>
</ol>2. Inyección intraarticular
<ol><li>Coloque al conejillo de indias en posición supina durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Póngase un nuevo par de guantes estériles y palpa la articulación de la rodilla. NOTA: En el protocolo presentado y en el video, se utilizaron guantes de nitrilo esterilizados en autoclave. Los guantes estériles, incluidos los guantes de nitrilo esterilizados en autoclave o los guantes quirúrgicos, deben utilizarse para la técnica aséptica.</li>
	<li>Flexiona manualmente la rodilla a 90°.</li>
	<li>Mueva el dedo distal a la rótula para ubicar el surco de la cara distal del espacio articular flexionando y extendiendo la extremidad posterior. NOTA: La rótula se puede palpar en esta posición como una estructura pequeña y firme ubicada directamente sobre el espacio articular. La tibia se puede sentir como una estructura ósea distal a la rótula. Una vez determinada la ubicación de la tibia y la rótula, la articulación, sentida como un surco, se encuentra entre ellas, distal a la rótula y proximal a la tibia.</li>
	<li>Inserte la aguja de insulina con cuidado en la línea media distal a la rótula dentro del espacio articular. La aguja debe insertarse 1-2 mm por debajo de la piel para entrar en el espacio articular. NOTA: La ventana de acceso más grande para el espacio articular mientras la rodilla está flexionada se encuentra en la cara anterior de la extremidad en la línea media, directamente distal a la rótula. La inyección en la línea media en la dirección antero-posterior ayudará a inyectar con precisión en el espacio articular sin penetrar las estructuras óseas. La inyección precisa en el espacio articular se puede lograr utilizando un enfoque lateral a medial, aunque la ventana de acceso es más estrecha, especialmente cuando la rodilla está flexionada.</li>
	<li>Inyecte lentamente 50 μL de la solución en la articulación. Asegúrese de que la aguja se inserte fácilmente y que el contenido se inyecte sin resistencia. NOTA: Asegúrese de no insertar la aguja demasiado profunda, ya que puede causar daños en las articulaciones o los huesos y provocar inflamación y / o dolor no deseados. Si no se encuentra el surco correspondiente al espacio articular, la aguja podría penetrar el fémur, la rótula o la tibia. Por lo tanto, es beneficioso palpar con confianza el surco correspondiente al espacio articular para evitar inyecciones periarticulares o lesiones asociadas con la penetración de estructuras óseas. Si se desarrolla una burbuja en el lugar de la inyección debajo de la piel, la inyección fue demasiado superficial y el líquido ha entrado en el espacio subcutáneo. Dependiendo de las propiedades del agente utilizado, el fármaco puede entrar en el espacio articular a través de la difusión, o puede ser necesario otro intento de inyección.</li>
	<li>Una vez hecho esto, deseche la aguja en el contenedor de objetos punzantes. NOTA: Para fines de práctica y entrenamiento, inyecte líquido que contenga un tinte en el espacio articular de un cadáver en un roedor o conejillo de indias de tamaño similar. Luego, diseccione la articulación para confirmar la ubicación de la inyección.</li>
	<li>Masajear la rodilla flexionando y extendiendo la articulación unas cuantas veces para promover la difusión del fármaco dentro del espacio articular.</li>
	<li>Repita los pasos 2.1-2.5 una vez en la extremidad contralateral con 1x solución de PBS.</li>
</ol>3. Recuperación de la inyección intraarticular
<ol><li>Apague el isoflurano y mantenga el 100% del flujo de oxígeno hasta que el animal recupere la conciencia.</li>
	<li>Coloque al animal sobre una almohadilla térmica para soporte térmico hasta que deambule.</li>
	<li>Aplique una compresa de hielo en la rodilla durante 30 segundos con una toalla de papel como barrera para ayudar a disminuir la hinchazón de la inyección.</li>
	<li>Evalúe la marcha de los animales cuando están ambulatorios antes de devolverlos a la vivienda. NOTA: Si se observa alguna anomalía en la marcha, es posible que se justifiquen analgésicos y cuidados de apoyo. Es aconsejable volver a evaluar su marcha varias horas después de la recuperación de la anestesia para asegurar una movilidad normal.</li>
</ol>4. Microtomografía computarizada (μCT)
<ol><li>Para la recolección de tejidos, establecer un plano quirúrgico de anestesia con 100% de oxígeno y 5% de mezcla de isoflurano.</li>
	<li>Confirmar un plano quirúrgico de anestesia con falta de respuesta a un estímulo de pellizco en el dedo del pie. Sacrificar humanamente al animal mediante la administración de ≥ 150 mg/kg de pentobarbital por vía intravenosa de acuerdo con las políticas institucionales y el protocolo de uso animal aprobado. NOTA: En el protocolo presentado, cada uno de los cinco conejillos de indias recibió una inyección en ambas rodillas. Los animales fueron anestesiados y sacrificados humanitariamente una semana después de la inyección.</li>
	<li>Cosecha ambas extremidades traseras diseccionando la piel lejos de la musculatura circundante.</li>
	<li>A continuación, desarticule la extremidad posterior con Rongeurs en la diáfisis media del fémur y proximal al tobillo. NOTA: La cama de escaneo y el portamuestras utilizados no pudieron acomodar toda la extremidad trasera de un conejillo de indias adulto. Los soportes para muestras grandes están disponibles comercialmente para tamaños de muestras más grandes.</li>
	<li>Colocar los tejidos en una solución de formalina neutra tamponada durante 72 h para su fijación antes de realizar la μCT.</li>
	<li>Abra el software de escaneo de μCT y coloque la muestra con formalina en un recipiente compatible que quepa en la carpeta de muestras de μCT mientras mantiene el tejido en el campo de visión.</li>
	<li>Calibre la máquina μCT para exposiciones de campo oscuro y campo claro de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.</li>
	<li>Escanee la muestra con filtro Al+Cu a 18 μm. Utilice el paso de rotación de 0,7° para 360° con cámara offset. NOTA: El escaneo se guarda automáticamente.</li>
</ol>5. Procesamiento de imágenes para la evaluación de parámetros microarquitectónicos óseos
<ol><li>Descargue e instale el software de reconstrucción μCT para la reconstrucción de imágenes μCT.</li>
	<li>Seleccione la carpeta del software y haga doble clic para abrir el software.</li>
	<li>Seleccione un sector de las imágenes μCT haciendo clic en un segmento de imagen.</li>
	<li>Elija el destino del archivo de reconstrucción. Seleccione Examinar y cree una nueva carpeta denominada Reconocimiento. El formato de archivo seleccionado debe ser BMP(8).</li>
	<li>Verifique la compensación de desalineación. NOTA: Por lo general, la estimación está cerca de ser correcta, pero se puede ajustar manualmente para cambiar las imágenes superpuestas de modo que los bordes derecho e izquierdo se alineen lo más posible.</li>
	<li>En Configuración, aplique los algoritmos Suavizado, Endurecimiento del haz, Rotación CS y Artefactos de anillo . NOTA: Puede ser útil elegir una imagen de vista previa para determinar la claridad antes de reconstruir. La configuración de ajuste fino también puede ser útil para determinar qué configuraciones son las mejores.</li>
	<li>Seleccione Iniciar para comenzar a procesar la reconstrucción.</li>
</ol>6. Recopilación de datos microarquitectónicos a partir de imágenes reconstruidas
<ol><li>Descargue e instale Dataviewer.</li>
	<li>Seleccione VOI y oriente la muestra para alinearla verticalmente y facilitar el análisis en un momento posterior.</li>
	<li>Guarde el VOI editado como una nueva carpeta.</li>
	<li>Descargue e instale CTAnalyser para el análisis de las propiedades óseas de los parámetros de microarquitectura. NOTA: La versión gratuita de CTAnalyser tiene una funcionalidad limitada, por lo que se recomienda obtener una licencia completa.</li>
	<li>Divida el análisis en placa subcondral y hueso trabecular guardándolos como un rango separado de imágenes. NOTA: No es necesario dividir el análisis, pero debido a que la placa subcondral y el hueso trabecular tienen características diferentes, los análisis separados pueden ayudar con mediciones y comparaciones sólidas.</li>
	<li>Seleccione el rango de imágenes a analizar, comenzando con la placa subcondral, haciendo clic en el corte de imagen con el que desea comenzar.</li>
	<li>Seleccione la región de interés de cada imagen para asegurarse de que abarca el hueso haciendo clic en la pestaña de la región de interés.</li>
	<li>Seleccione la pestaña Selección binaria . Ajuste el histograma para que el fondo y el hueso estén completamente separados.</li>
	<li>Seleccione la pestaña Densidad mineral ósea (DMO). Guarde esos datos en una nueva carpeta de datos de análisis.</li>
	<li>Seleccione Procesamiento personalizado y vaya a la pestaña Interno .</li>
	<li>Primero realice Umbral y seleccione Otsu automático, luego Ejecutar.</li>
	<li>A continuación, seleccione Despeckle , elija Eliminar motas negras y, a continuación, Run (Ejecutar).</li>
	<li>Repita Despeckle y elija Eliminar manchas blancas y, a continuación, Ejecutar.</li>
	<li>Elija Análisis 3D y seleccione Valores básicos y Valores adicionales.</li>
	<li>Repita los pasos 6.2.2-6.4.5 para restablecer la imagen para el análisis del hueso trabecular. NOTA: Asegúrese de que el archivo de salida esté en una nueva carpeta con el mismo archivo que los datos BMD.</li>
</ol>

<ol><li>Callahan, L. F., Cleveland, R. J., Allen, K. D., Golightly, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial%2FEthnic%2C+socioeconomic%2C+and+geographic+disparities+in+the+epidemiology+of+knee+and+hip+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Rheum+Dis+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Racial/Ethnic, socioeconomic, and geographic disparities in the epidemiology of knee and hip osteoarthritis.</a> Rheum Dis Clin North Am. 47 (1), 1-20 (2021).</li>
<li>Mandl, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+year+in+review+2018%3A+clinical%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis year in review 2018: clinical.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (3), 359-364 (2019).</li>
<li>Assirelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+expression+and+activation+in+osteoarthritis+joint+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement expression and activation in osteoarthritis joint compartments.</a> Front Immunol. 11, 535010(2020).</li>
<li>Lampropoulou-Adamidou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Useful+animal+models+for+the+research+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Orthop+Surg+Traumatol%22%5BJournal%5D)">Useful animal models for the research of osteoarthritis.</a> Eur J Orthop Surg Traumatol. 24 (3), 263-271 (2014).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li>
<li>Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+osteoarthritis%3A+classification%2C+update%2C+and+measurement+of+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes.</a> J Orthop Surg Res. 11, 19(2016).</li>
<li>Pitcher, T., Sousa-Valente, J., Malcangio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Monoiodoacetate+Model+of+Osteoarthritis+Pain+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse.</a> J Vis Exp. (111), e53746(2016).</li>
<li>de Araujo, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphology+of+the+hind+limbs+in+two+caviomorph+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Histol+Embryol%22%5BJournal%5D)">morphology of the hind limbs in two caviomorph rodents.</a> Anat Histol Embryol. 42 (2), 114-123 (2013).</li>
<li>Veronesi, F., Salamanna, F., Martini, L., Fini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+osteoarthritis+features+and+treatments%3A+systematic+review+on+the+aged+guinea+pig+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring osteoarthritis features and treatments: systematic review on the aged guinea pig model.</a> Int J Mol Sci. 23 (13), (2022).</li>
<li>Kraus, V. B., Huebner, J. L., DeGroot, J., Bendele, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OARSI+histopathology+initiative+-+recommendations+for+histological+assessments+of+osteoarthritis+in+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 S35-S52 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoarthritis+natural+progress+and+changes+in+intraosseous+pressure+of+the+guinea+pig+model+in+different+degeneration+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Surg%22%5BJournal%5D)">The osteoarthritis natural progress and changes in intraosseous pressure of the guinea pig model in different degeneration stages.</a> Orthop Surg. 14 (11), 3036-3046 (2022).</li>
<li>Boyde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+cartilage+interface+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">The bone cartilage interface and osteoarthritis.</a> Calcif Tissue Int. 109 (3), 303-328 (2021).</li>
<li>Akhter, M. P., Recker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+imaging+in+bone+tissue+research-review%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">High resolution imaging in bone tissue research-review.</a> Bone. 143, 115620(2021).</li>
<li>Clark, D. P., Badea, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+micro-CT+imaging+of+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in micro-CT imaging of small animals.</a> Phys Med. 88, 175-192 (2021).</li>
<li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CD147+in+alveolar+bone+remodeling+and+soft+tissue+degradation+in+experimental+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of CD147 in alveolar bone remodeling and soft tissue degradation in experimental periodontitis.</a> J Periodontal Res. 52 (4), 704-712 (2017).</li>
<li>Ruegsegger, P., Koller, B., Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtomographic+system+for+the+nondestructive+evaluation+of+bone+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture.</a> Calcif Tissue Int. 58 (1), 24-29 (1996).</li>
<li>Boca, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+micro-CT+imaging+and+histology+for+approximal+caries+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of micro-CT imaging and histology for approximal caries detection.</a> Sci Rep. 7 (1), 6680(2017).</li>
<li>Ren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+morphological+abnormalities+of+subchondral+bone+and+their+association+with+cartilage+degeneration+in+spontaneous+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Biochemical and morphological abnormalities of subchondral bone and their association with cartilage degeneration in spontaneous osteoarthritis.</a> Calcified Tissue International. 109 (2), 179-189 (2021).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+and+location-specific+cartilage+calcification+in+osteoarthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Stage-specific and location-specific cartilage calcification in osteoarthritis development.</a> Ann Rheum Dis. 82 (3), 393-402 (2023).</li>
<li>Magni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+osteoarthritis%3A+expert+opinion+on+NSAIDs%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Ther%22%5BJournal%5D)">Management of osteoarthritis: expert opinion on NSAIDs.</a> Pain Ther. 10 (2), 783-808 (2021).</li>
<li>Wang, T., Wen, C. Y., Yan, C. H., Lu, W. W., Chiu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+changes+of+subchondral+bone+proceed+to+microscopic+articular+cartilage+degeneration+in+guinea+pigs+with+spontaneous+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal changes of subchondral bone proceed to microscopic articular cartilage degeneration in guinea pigs with spontaneous osteoarthritis.</a> Osteoarthr Cartil. 21 (4), 574-581 (2013).</li>
<li>Gao, J., Ren, P., Gong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+mechanical+alterations+in+articular+cartilage+and+subchondral+bone+during+spontaneous+hip+osteoarthritis+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Morphological and mechanical alterations in articular cartilage and subchondral bone during spontaneous hip osteoarthritis in guinea pigs.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1080241(2023).</li>
<li>Makarczyk, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+models+for+development+of+disease-modifying+osteoarthritis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs.</a> Tissue Eng Part C Methods. 27 (2), 124-138 (2021).</li>
<li>Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+therapy+for+osteoarthritis--the+era+of+disease+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic therapy for osteoarthritis--the era of disease modification.</a> Nat Rev Rheumatol. 7 (1), 13-22 (2011).</li>
<li>Schuelert, N., McDougall, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grading+of+monosodium+iodoacetate-induced+osteoarthritis+reveals+a+concentration-dependent+sensitization+of+nociceptors+in+the+knee+joint+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Grading of monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis reveals a concentration-dependent sensitization of nociceptors in the knee joint of the rat.</a> Neurosci Lett. 465 (2), 184-188 (2009).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+ferroptosis+contribute+to+the+progression+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Translat%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte ferroptosis contribute to the progression of osteoarthritis.</a> J Orthop Translat. 27, 33-43 (2021).</li>
<li>Huebner, J. L., Hanes, M. A., Beekman, B., TeKoppele, J. M., Kraus, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+bone+and+cartilage+metabolism+in+two+strains+of+guinea-pig+with+varying+degrees+of+naturally+occurring+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of bone and cartilage metabolism in two strains of guinea-pig with varying degrees of naturally occurring osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 758-767 (2002).</li>
<li>Ringe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL25-Supplemented+hyaluronic+acid+attenuates+cartilage+degeneration+in+a+guinea+pig+model+of+knee+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">CCL25-Supplemented hyaluronic acid attenuates cartilage degeneration in a guinea pig model of knee osteoarthritis.</a> J Orthop Res. 37 (8), 1723-1729 (2019).</li>
<li>Chouhan, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+platelet-rich+plasma+injections+versus+single+platelet-rich+plasma+injection+in+early+osteoarthritis+of+the+knee%3A+An+experimental+study+in+a+guinea+pig+model+of+early+knee+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple platelet-rich plasma injections versus single platelet-rich plasma injection in early osteoarthritis of the knee: An experimental study in a guinea pig model of early knee osteoarthritis.</a> Am J Sports Med. 47 (10), 2300-2307 (2019).</li>
<li>Patel, S., Mishra, N. P., Chouhan, D. K., Nahar, U., Dhillon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroprotective+effects+of+multiple+PRP+injections+in+osteoarthritis+by+apoptosis+regulation+and+increased+aggrecan+synthesis-+Immunohistochemistry+based+Guinea+pig+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Chondroprotective effects of multiple PRP injections in osteoarthritis by apoptosis regulation and increased aggrecan synthesis- Immunohistochemistry based Guinea pig study.</a> J Clin Orthop Trauma. 25, 101762(2022).</li>
<li>Cheng, J., Abdi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+of+joint%2C+tendon%2C+and+muscle+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Tech+Reg+Anesth+Pain+Manag%22%5BJournal%5D)">Complications of joint, tendon, and muscle injections.</a> Tech Reg Anesth Pain Manag. 11 (3), 141-147 (2007).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+central+role+for+complement+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a central role for complement in osteoarthritis.</a> Nat Med. 17 (12), 1674-1679 (2011).</li>
<li>Santangelo, K. S., Kaeding, A. C., Baker, S. A., Bertone, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gait+analysis+detects+significant+differences+in+movement+between+osteoarthritic+and+nonosteoarthritic+guinea+pig+strains+before+and+after+treatment+with+flunixin+meglumine%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis%22%5BJournal%5D)">Quantitative gait analysis detects significant differences in movement between osteoarthritic and nonosteoarthritic guinea pig strains before and after treatment with flunixin meglumine.</a> Arthritis. 2014, 503519(2014).</li>
<li>McCoy, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+osteoarthritis%3A+comparisons+and+key+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Animal models of osteoarthritis: comparisons and key considerations.</a> Vet Pathol. 52 (5), 803-818 (2015).</li>
<li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targets%2C+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Dis Model Mech. 8 (1), 17-30 (2015).</li>
<li>Vazquez-Portalatin, N., Breur, G. J., Panitch, A., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+ultrasound-guided+intra-articular+injections+in+guinea+pig+knees%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Joint+Res%22%5BJournal%5D)">Accuracy of ultrasound-guided intra-articular injections in guinea pig knees.</a> Bone Joint Res. 4 (1), 1-5 (2015).</li>
<li>Nie, C., Wang, Z., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+depression+on+fracture+healing+and+osteoblast+differentiation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatr+Dis+Treat%22%5BJournal%5D)">The effect of depression on fracture healing and osteoblast differentiation in rats.</a> Neuropsychiatr Dis Treat. 14, 1705-1713 (2018).</li>
<li>Jonsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+and+deep+learning%3A+Modern+techniques+and+applications+in+insect+morphology+and+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Micro-CT and deep learning: Modern techniques and applications in insect morphology and neuroscience.</a> Front Insect Sci. 3, (2023).</li>
</ol>

A pesar de los avances recientes en el tratamiento sintomático de la OA, existe una falta total de agentes terapéuticos que prevengan la aparición o retrasen la progresión de la OA24. En la actualidad, la única cura para la artrosis grave es el reemplazo articular, que es costoso, invasivo y puede provocar morbilidad y mortalidad del paciente25. Como resultado, existe una necesidad imperiosa de continuar la investigación con modelos animales de OA y el desarrollo sostenido de nuevas terapias. Existen varios modelos animales para estudiar los diferentes componentes de la artrosis, incluidos los modelos espontáneos y los inducidos química o quirúrgicamente. La inyección de sustancias químicas, al igual que en el modelo de ratón MIA, es vital para estudiar el dolor, pero no permite a los investigadores seguir la progresión del desarrollo de la artrosis e intervenir en los momentos deseados a lo largo del curso de la enfermedad26. Los métodos quirúrgicos requieren procedimientos invasivos y no logran reflejar fielmente el inicio de la OA en humanos27. Los conejillos de indias Dunkin-Hartley desarrollan OA de forma natural, lo que los convierte en un modelo espontáneo ampliamente disponible de OA28. Este modelo espontáneo es ideal para la investigación traslacional que estudia el desarrollo mecanicista de la OA, ya que no requiere intervenciones y presenta cambios patológicos que reflejan los de los seres humanos6. En trabajos publicados anteriormente se han utilizado inyecciones intraarticulares para probar los efectos de nuevas terapias sobre la progresión de la artrosis espontánea en cobayas Dunkin-Hartley 29,30,31.
Si bien las inyecciones intraarticulares en ratones han sido descritas previamente, las diferencias anatómicas plantean desafíos adicionales para este procedimiento en cobayas7. Aunque las inyecciones intraarticulares son parte integral de los estudios de artrosis en conejillos de indias, este procedimiento aún no se ha detallado sistemáticamente. Con la metodología descrita, destacamos las consideraciones clave para refinar las inyecciones intraarticulares en cobayas, reduciendo así la posibilidad de complicaciones relacionadas con el procedimiento. Los efectos secundarios comunes después de las inyecciones intraarticulares en humanos incluyen dolor, hinchazón, artritis séptica y neuropatía, y estos deben considerarse como complicaciones potenciales al realizar inyecciones en conejillos de indias32. En nuestra experiencia, los efectos secundarios, como cojera y dolor a la palpación de la articulación, pueden producirse cuando la aguja se inserta demasiado profundamente en el espacio articular y/o entra en contacto con una estructura ósea durante la inyección. Tener cadáveres para practicar nuestras inyecciones antes de realizarlas en animales vivos ayudó a garantizar inyecciones más precisas. Al refinar nuestra técnica para garantizar una profundidad de inyección poco profunda, no observamos efectos secundarios después de las inyecciones intraarticulares de rodilla. Por lo tanto, la técnica de inyección adecuada es primordial para garantizar el bienestar de los animales, especialmente para los estudios que requieren múltiples inyecciones durante muchos meses. Los pasos clave en el procedimiento incluyen el uso de la técnica aséptica; suficiente capacitación antes de realizar procedimientos de supervivencia; lograr un plano quirúrgico de anestesia para evitar la percepción del dolor y el movimiento a la inyección; y asegurar la profundidad de inyección adecuada, para evitar el contacto con el hueso distalmente y las inyecciones periarticulares que pueden requerir la administración de nuevo el compuesto.
Para evaluar sistemáticamente los cambios relacionados con la OA, describimos los análisis de μCT, incluidas las representaciones de imágenes en 3D, que permiten la visualización, la segmentación, el etiquetado y las mediciones objetivas del tejido afectado. Los métodos descritos han sido efectivos y eficientes en la evaluación sistemática de los cambios articulares y óseos de la artrosis a lo largo del tiempo. Los resultados de nuestra μCT muestran que los conejillos de indias Dunkin-Hartley de 12 meses de edad tienen una OA más grave que los conejillos de 5 meses, como lo indica el aumento de la densidad mineral ósea y el aumento del grosor trabecular. Este empeoramiento demostrado de la OA a lo largo del tiempo se alinea con los resultados publicados previamente en este modelo de OA, incluidos los análisis de μCT que evaluaron la densidad mineral ósea y el grosor trabecular13. Los estudios previos, y los resultados representativos presentados, demuestran un aumento en la DMO y el espesor trabecular a lo largo del tiempo medido por μCT22,23. Además, nuestra evaluación histológica de las rodillas en dos dimensiones apoya la validez de los datos de la μCT. Desde el punto de vista histológico, los signos de artrosis son más pronunciados en los cobayos de 9 y 12 meses de edad en comparación con los animales de 5 meses. Los cambios histológicos asociados con la OA incluyen pérdida de proteoglicanos, fisuras e hipocelularidad. 10 Cada una de estas características se puede ver en los conejillos de indias más viejos. Además, los conejillos de indias más viejos tienen puntuaciones más altas de Mankin modificado, un método ampliamente utilizado y validado para evaluar la gravedad de la OA10. Si bien nuestros análisis histológicos demuestran los cambios esperados en la OA, la μCT proporciona una evaluación más profunda de los cambios en la OA que la revisión histológica, ya que escanea una muestra completa en lugar de una o unas pocas secciones de tejido18. Además, proporciona mediciones más objetivas de la extensión de las lesiones óseas tanto en 2 como en 3 dimensiones18. Los investigadores deben consultar las directrices existentes para puntuar los cambios histológicos en la artrosis, como las directrices de evaluación histológica de la Osteoarthritis Research Society International10. Los investigadores deben considerar pruebas auxiliares adicionales, incluyendo análisis de la marcha, para una caracterización en profundidad del desarrollo de la OA34. Si bien los análisis de la marcha pueden revelar cambios funcionales a lo largo del tiempo, las lesiones de la artrosis se desarrollan mucho antes de la aparición de la cojera, lo que hace que la μCT sea una medida más sensible de los cambios relacionados con la artrosis durante las primeras etapas de la enfermedad.
Si bien los conejillos de indias Dunkin-Hartley proporcionan un modelo sólido para estudiar la progresión de la artrosis y los efectos de nuevas terapias, este modelo tiene limitaciones. Los modelos espontáneos suelen requerir un período de estudio más largo en comparación con el rápido desarrollo de cambios después de la OA quirúrgica o inducida químicamente35. Esto puede resultar en un aumento del costo y la duración del estudio. Como se ha descrito anteriormente, el inicio de la OA varía entre animales de la misma edad, lo que puede requerir la evaluación de los cambios relacionados con la OAen serie 36. A pesar de esta variación, los investigadores pueden esperar que todos los conejillos de indias Dunkin-Hartley desarrollen artrosis a partir de los 3 meses, mostrando cambios en el hueso subcondral y trabecular, seguidos de cambios progresivos en la artrosis a medida que el animal envejece10,19 años. Los investigadores pueden reducir el efecto de la variabilidad entre animales mediante la aplicación de tratamientos a una extremidad de cada animal, permitiendo que la extremidad contralateral sirva como control interno. Aunque están más allá del alcance de la metodología presentada, las inyecciones guiadas por ultrasonido pueden ayudar a mejorar aún más la precisión de la inyección y se han utilizado en conejillos de indias37. El estudio propuesto describe la factibilidad de la inyección guiada por palpación, sin utilizar esta modalidad de imagen, técnica ampliamente utilizada en el campo37. Si bien la μCT es una herramienta poderosa para analizar la patología y la estructura ósea, la disponibilidad de software que admite amplias funciones analíticas puede introducir variabilidad entre usuarios en los análisis38. En el presente estudio, el diámetro del lecho de escaneo de la μCT fue de 6,35 cm, lo que impidió la obtención de imágenes de todo el conejillo de indias o de la articulación in situ. En el mercado hay disponibles accesorios de cama más grandes que podrían facilitar la obtención de imágenes de animales enteros. Aunque el software es generalmente fácil de usar y ofrece varias configuraciones sugeridas, puede ser beneficioso editar manualmente la configuración para obtener una mayor resolución y precisión. A medida que las técnicas automatizadas continúan evolucionando, incluido el aprendizaje automático, estos ajustes manuales pueden reemplazarse con nuevas técnicas de software automáticas para mejorar la estandarización39. Si bien el manuscrito presentado describe instrucciones paso a paso para el μCT utilizado y el software correspondiente, estos mismos análisis se pueden realizar con otras marcas y software; Los investigadores deben consultar los manuales de usuario correspondientes para optimizar y estandarizar los análisis de imágenes cuando utilicen diferentes máquinas y/o software. Para reducir la variabilidad, es importante mantener la misma configuración en todas las muestras. La subjetividad de los análisis de imágenes puede reducirse aún más replicando los análisis realizados por múltiples experimentadores ciegos.
El objetivo principal de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la realización de un procedimiento técnicamente desafiante en conejillos de indias y análisis posteriores de μCT de los cambios asociados a la OA. La estandarización de la técnica y el análisis de datos ayudará a minimizar los costos y aumentar la eficiencia.

La osteoartritis (OA) afecta a 32,5 millones de adultos estadounidenses. Está causada por la pérdida progresiva del cartílago articular, la inflamación leve de los tejidos dentro y alrededor de las articulaciones y la formación de osteofitos y quistes óseos 1,2. Los síntomas suelen manifestarse en las últimas etapas de la enfermedad, y los tratamientos actuales solo proporcionan alivio paliativo y tienen efectos secundarios sistémicos. La falta de fármacos modificadores de la enfermedad se debe a una escasa comprensión de los mecanismos subyacentes de la enfermedad3. Como resultado, existe una necesidad médica crítica y continua de agentes mejorados para tratar la artrosis.
Existen varios modelos animales de OA que examinan diferentes componentes de los procesos de la enfermedad4. Si bien existen varios modelos quirúrgicos, como la transección del ligamento cruzado anterior y la desestabilización del menisco medial, estos son invasivos y requieren un alto nivel de habilidad técnica5. Los modelos inducidos químicamente son procedimientos comparativamente menos invasivos que se utilizan normalmente para estudiar los mecanismos del dolor de la artrosis6. Uno de estos modelos de ratón ampliamente utilizados consiste en la inducción de la artrosis mediante una inyección intraarticular de yodoacetato monosódico (MIA) en la rodilla. Este modelo genera un fenotipo similar al dolor reproducible, robusto y rápido que se puede graduar alterando la dosis de MIA7. Los detalles técnicos de la inducción de este modelo se han descrito anteriormente7. La traslación de esta técnica a roedores más grandes, como los conejillos de indias, es difícil debido a sus diferencias anatómicas. Algunas diferencias incluyen un aumento de la musculatura que rodea los huesos adyacentes y el espacio articular en el conejillo de indias y un peroné y una tibia articulados en comparación con la fusión distal observada en ratones8. Los conejillos de indias Dunkin-Hartley, una cepa de conejillos de indias ampliamente disponible, son un modelo animal establecido de OA ya que desarrollan naturalmente esta enfermedad, lo que ofrece un modelo sólido para investigar los efectos de nuevas terapias administradas por inyección intraarticular en la progresión de la enfermedad9. Los conejillos de indias Dunkin-Hartley comienzan a desarrollar OA a los tres meses, y los machos muestran un desarrollo acelerado y un fenotipo10 más severo. En los cobayos, la artrosis progresa con la edad y, a los 12 meses, la patología asociada es evidente en las imágenes11. Los modelos de OA espontánea, como el modelo de Dunkin-Hartley, no requieren ninguna intervención para inducir OA y, por lo tanto, recapitulan el desarrollo y la progresión del fenotipo de la enfermedad en humanos, proporcionando así un potente modelo traslacional10. Además, el desarrollo espontáneo de la artrosis permite el control interno cuando se administran unilateralmente nuevas terapias en una sola rodilla de un animal determinado. Este control interno minimiza los efectos de las variabilidades entre animales al analizar los datos y puede ayudar a reducir el número total de animales. 
El análisis de microtomografía computarizada de rayos X (μCT) es una herramienta poderosa que permite la evaluación cuantitativa de la gravedad de la OA12. La μCT consiste en escanear múltiples imágenes de rayos X de alta resolución, obtenidas de una muestra giratoria o de una fuente de rayos X giratoria y un detector13. A continuación, se reconstruyen los datos volumétricos tridimensionales (3D) en forma de fragmentos de imagen apilados14. Debido a que el hueso mineralizado tiene un excelente contraste en μCT, esta modalidad se puede utilizar para evaluar las características 3D y realizar análisis cuantitativos de los cambios asociados con el OA 15,16,17. La μCT ofrece varias ventajas sobre las herramientas más utilizadas, como la histopatología y los análisis de la marcha. A diferencia de la evaluación histológica de una o pocas secciones de tejidos, la μCT explora toda la articulación y ofrece una evaluación más holística de las lesiones de artrosis18. Si bien el análisis de la marcha puede discernir cambios sintomáticos en la función articular con el tiempo, los cambios articulares se desarrollan mucho antes que los cambios funcionales asociados con la artrosis. La μCT puede proporcionar una medida más sensible del desarrollo de la artrosis antes de la aparición de la cojera. Dos mediciones cuantitativas especialmente relevantes son la densidad mineral ósea y el grosor trabecular, ya que ambas aumentan a lo largo de la progresión de la OA19,20. Puede ser útil dividir el análisis en placa subcondral y hueso trabecular, ya que tienen características diferentes, para lograr mediciones y comparaciones más sólidas.
El objetivo general de este método es ayudar a los investigadores a realizar con éxito inyecciones intraarticulares en conejillos de indias. El protocolo presentado utilizó cuyes Dunkin-Hartley machos de cinco (n=2), nueve (n=1) y 12 (n=2) meses de edad; Los procedimientos se pueden extrapolar a otras cepas y edades de conejillos de indias que requieren inyecciones intraarticulares en la rodilla. En los modelos espontáneos de OA, como el modelo de Dunkin-Hartley, la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento en serie a menudo se monitorean durante largos períodos de tiempo, que abarcan de semanas a meses9. Este protocolo extendido da como resultado múltiples inyecciones intraarticulares y, por lo tanto, es importante contar con una técnica de inyección adecuada para prevenir eventos adversos, como dolor, cojera o infecciones, todos los cuales pueden afectar el bienestar animal y confundir los resultados del estudio, al tiempo que requieren animales adicionales en el estudio. El protocolo presentado describe la metodología de inyecciones intraarticulares en cobayas y el posterior análisis de los datos de μCT.

<table><tbody><tr><td>200 Proof</td><td>Ethanol Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>agente esterilizante</td></tr><tr><td>3D. SUITE software</td><td>Bruker</td><td></td><td>&mu;-CT software de análisis</td></tr><tr><td>Betadine Surgical Scrub Avrio</td><td>Health</td><td>67618-151-16</td><td>agente esterilizante</td></tr><tr><td>Jeringa de insulina con aguja</td><td>Ulticare</td><td>91008</td><td>para realizar inyecciones</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal</td><td>803249</td><td>anestesia animal</td></tr><tr><td>Neutral Formol tamponado Fisher</td><td>Scientific</td><td>23-427098</td><td>Arreglar el tejido</td></tr><tr><td>Nrecon Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>&mu;-CT software de reconstrucción</td></tr><tr><td>Fosfato tamponado solución salina</td><td>Cytiva</td><td>SH30258.01</td><td>agente de control y dilución</td></tr><tr><td>SkyScan 1176</td><td>Bruker</td><td></td><td>para escanear muestras&nbsp;</td></tr></tbody></table>

análisis por tomografía microcomputarizada de la rodilla en cobayas dunkin-hartley envejecidos después de una inyección intraarticular

Micro-Computed Tomography Analysis of the Knee in Aged Dunkin-Hartley Guinea Pigs after Intra Articular Injection

El propósito de este protocolo es guiar a los investigadores en la realización de una técnica guiada por palpación de inyección intraarticular de rodilla en cobayas y evaluación mediante tomografía microcomputarizada. Los conejillos de indias Dunkin-Hartley son modelos robustos para la investigación de la osteoartritis, ya que desarrollan espontáneamente osteoartritis en las rodillas. La administración intraarticular de fármacos es un método común para estudiar los efectos de un fármaco en investigación in vivo. En los seres humanos, los agentes terapéuticos administrados a través de inyecciones intraarticulares pueden ofrecer alivio del dolor y retrasar la progresión de la osteoartritis. Al igual que con cualquier especie, la introducción de una aguja en un espacio articular tiene el potencial de causar lesiones, que pueden provocar dolor, cojera o infección. Tales eventos adversos pueden comprometer el bienestar animal, confundir los resultados del estudio y requerir animales adicionales para lograr los objetivos del estudio. Como tal, es imperativo desarrollar técnicas de inyección adecuadas para prevenir complicaciones, especialmente en estudios longitudinales que requieren inyecciones intraarticulares múltiples y repetidas. Utilizando la metodología presentada, cinco cuyes recibieron inyecciones bilaterales de rodilla bajo anestesia general. Siete días después de la inyección, los animales fueron sacrificados humanitariamente para analizar la gravedad de la osteoartritis. No se produjeron eventos adversos después de la anestesia o las inyecciones en la rodilla, como cojera, dolor o infección. El análisis de microtomografía computarizada de rayos X de la rodilla puede detectar cambios patológicos asociados con la osteoartritis. Los datos de la microtomografía computarizada indican que la osteoartritis es más grave en los animales de mayor edad, como lo indica el aumento de la densidad mineral ósea y el grosor trabecular con la edad. Estos resultados son consistentes con los cambios histológicos y las puntuaciones de Mankin modificado, un sistema de puntuación establecido y ampliamente utilizado para evaluar la gravedad de la artritis en estos mismos animales. Este protocolo se puede utilizar para refinar las inyecciones intraarticulares en conejillos de indias.

Antes de realizar inyecciones intraarticulares en animales vivos, se practicó el protocolo anterior en tres cadáveres de ratas para garantizar el lugar correcto de la inyección. Durante las sesiones de práctica, se inyectaron 50 μL de colorante azul de metileno al 70% en ambas articulaciones de la rodilla utilizando la metodología descrita anteriormente. Esto equivale a seis inyecciones de práctica. Después de las inyecciones, la articulación de la rodilla se diseccionó mediante incisión a través de la cara craneal del espacio articular, distal a la rótula y a través del ligamento rotuliano, para visualizar el espacio articular y verificar la ubicación de la deposición de tinte. Debido a que el nuevo tinte azul de metileno es una solución azul brillante, la ubicación de la deposición del tinte se puede visualizar macroscópicamente. En la Figura 1 se incluyen imágenes representativas de las inyecciones de cadáveres. La figura 1A muestra la presencia de tinte dentro del espacio articular, lo que indica una ubicación correcta y una técnica de inyección. Durante estas sesiones de práctica, la articulación de la rodilla se inyectó con éxito en los seis intentos (tasa de éxito del 100%). Para fines de demostración, en la Figura 1B-C se incluyen ejemplos de ubicación de inyección incorrecta. Si la inyección se administra en el espacio subcutáneo, el líquido se acumulará causando una ampolla debajo de la piel como se ve en la Figura 1B. Si no se inyecta el espacio articular, no habrá tinte presente dentro de la articulación de la rodilla, como se ve en la Figura 1C.
Cada uno de los 5 conejillos de indias se sometió a un único procedimiento de inyección bilateral en la rodilla con solución salina tamponada con fosfato 1x como parte de un experimento piloto para garantizar la viabilidad de la inyección y los análisis posteriores de μCT de los cambios en la artrosis relacionados con la edad. Los animales fueron evaluados visualmente al menos una vez al día siguiendo el procedimiento para determinar la salud general y los eventos adversos. Ninguno (0%) de estos animales experimentó eventos adversos asociados con la inyección, incluyendo dolor, cojera o infección. Siete días después de la inyección, los animales fueron colocados bajo un plano quirúrgico de anestesia y sacrificados humanamente para la extracción de rodilla y los análisis posteriores de μCT.
Como se ha publicado anteriormente, el análisis de la μCT puede utilizarse para evaluar los cambios en la rodilla en los conejillos de indias, incluida la capacidad de medir los cambios cuantitativos asociados con la gravedad de la artrosis a lo largo del tiempo22,23. En el estudio presentado, se utilizó μCT para verificar los cambios en la OA en cobayas de diferentes edades. Estos resultados se pueden utilizar como datos de referencia para futuros estudios que evalúen nuevos tratamientos destinados a retrasar la progresión de la artrosis. La metodología descrita anteriormente permitirá la estandarización de los análisis de μCT en estudios futuros. La placa subcondral (Figura 2A) y el hueso trabecular (Figura 2B) tienen propiedades óseas drásticamente diferentes. Como tal, estas regiones se analizan por separado para obtener un resultado más sólido una semana después de la inyección.
La densidad mineral ósea (DMO) es mayor en los cuyes de 12 meses de edad en comparación con los de 5 y 9 meses (Figura 3). La DMO media de la placa subcondral fue de 0,898 g/cm3, 0,952 g/cm3 y 0,588 g/cm3, en cuyes de 12, 9 y 5 meses de edad, respectivamente. Esto demuestra un aumento de 1,53 veces en la DMO subcondral para los conejillos de indias de 12 meses en comparación con los de 5 meses de edad. La DMO media del hueso trabecular fue de 0,825 g/cm3, 0,839 g/cm3, 0,427 g/cm3 en cuyes de 12, 9 y 5 meses de edad, respectivamente. Esto representa un aumento de 1,93 veces en la DMO trabecular para los cobayos de 12 meses en comparación con los de 5 meses. En general, la DMO aumenta en los conejillos de indias Dunkin-Hartley a medida que envejecen de 5 a 12 meses de edad (Figura 3).
También hubo diferencias en el grosor trabecular entre cuyes de varias edades (Figura 4). En cuanto al grosor trabecular medio, hay un aumento de 1,38 veces en los de 12 meses (0,558 mm) en comparación con los de 9 meses (0,403 mm), así como un aumento de 2,48 veces en los de 12 meses (0,558 mm) en comparación con los cobayos de 5 meses (0,225 mm). Por lo tanto, la media del grosor trabecular aumenta en los cobayos Dunkin-Hartley a medida que envejecen de 5 a 12 meses.
Los cambios histológicos y las puntuaciones de Makin modificadas, un enfoque validado y ampliamente utilizado para evaluar los cambios en la OA en 2D, respaldan los hallazgos de la μCT (Figura 5). Las puntuaciones de Mankin modificadas aumentaron a medida que los conejillos de indias envejecen (Figura 5A). Desde el punto de vista histológico, los signos de artrosis, como pérdida de proteoglicanos, hipocelularidad y fisuras, aumentan la prevalencia a medida que los cobayos pasan de los 5 a los 12 meses de edad (figura 5B-D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66053/66053fig01.jpg"> Figura 1: Imágenes representativas de las ubicaciones de inyección correctas e incorrectas. (A) Rodilla de rata disecada con la presencia de un nuevo tinte azul de metileno dentro del espacio articular. Escala incluida a la izquierda de la rodilla como referencia. (B) Rodilla mostrando una inyección superficial, lo que resulta en la formación de una ampolla en el espacio subcutáneo. (C) Rodilla del panel B disecada que confirma la falta de nuevo tinte azul de metileno dentro del espacio articular. Escala incluida a la derecha de la rodilla como referencia. En todas las imágenes, el cráneo está en la parte superior de la imagen y la caudal está en la parte inferior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66053/66053fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66053/66053fig02.jpg"> Figura 2: Segmentación de los campos de medición de la placa subcondral frente a los campos de medición del hueso trabecular. La placa subcondral tiene propiedades diferentes a las del hueso trabecular. El análisis de estas regiones por separado permite realizar comparaciones entre diferentes regiones a lo largo del curso de la progresión de la OA. La región A (rojo) representa la vista coronal de la región del segmento de placa subcondral utilizada para el análisis. La región B (verde) representa la vista coronal del segmento óseo trabecular utilizado para el análisis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66053/66053fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66053/66053fig03.jpg"> Figura 3: Cambios en la densidad mineral ósea en cobayas Dunkin-Hartley envejecidos. Se evaluó la densidad mineral ósea (DMO) en cobayos a los 5 (n=2), 9 (n=1) y 12 (n=2) meses de edad. Se tomaron medidas en la placa subcondral y en el hueso trabecular para dos mediciones diferentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66053/66053fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66053/66053fig04.jpg"> Figura 4: Cambios en el grosor trabecular en cobayas Dunkin-Hartley envejecidos. Se tomaron medidas de espesor trabecular de cobayas de 5 (n = 2), 9 (n = 1) y 12 (n = 2) meses de edad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66053/66053fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66053/66053fig05.jpg"> Figura 5: Análisis histológico de los cambios en la OA en cobayas Dunkin-Hartley. (A) Puntuaciones de Mankin modificadas para muestras histológicas de 5 (n = 2), 9 (n = 1) y 12 (n = 2) meses de edad. La puntuación de Mankin modificado se calculó sumando las puntuaciones individuales de la estructura del cartílago, la celularidad, la marca de marea y la formación de osteofitos. (B) Imagen histológica representativa teñida con azul de toluidina de un conejillo de indias de 5 meses de edad. (C) Imagen histológica representativa teñida con azul de toluidina de un conejillo de indias de 9 meses de edad. Negro *= Pérdida de proteoglicanos. D. Imagen histológica representativa teñida con azul de toluidina de un conejillo de indias de 12 meses de edad. negro *= fisuras; blanco *= hipocelularidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66053/66053fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Los conejillos de indias Dunkin-Hartley son un modelo animal establecido para la investigación de la osteoartritis. Dichos estudios pueden beneficiarse de las inyecciones intraarticulares por varias razones, incluida la investigación de agentes nuevos o el tratamiento de enfermedades. Describimos una metodología para las inyecciones intraarticulares de rodilla en cobayas y el posterior análisis de microtomografía computarizada que evalúa los cambios de rodilla asociados a la artritis.

Análisis por tomografía microcomputarizada de la rodilla en cobayas Dunkin-Hartley envejecidos después de una inyección intraarticular

The purpose of this protocol is to guide researchers in performing a palpation-guided technique of intra-articular knee injection in guinea pigs and ...

La osteoartritis, o OA, es una enfermedad degenerativa de las articulaciones que afecta a 32,5 millones de adultos estadounidenses. A menudo, los síntomas de la artrosis aparecen solo después de que la enfermedad se ha vuelto grave. La falta de fármacos modificadores de la enfermedad se debe a una escasa comprensión de los mecanismos que inician e impulsan la enfermedad.Como resultado, existe una necesidad médica crítica y continua de agentes mejorados para el tratamiento de la artrosis. Los conejillos de indias Dunkin-Hartley son un modelo animal establecido de OA, ya que desarrollan naturalmente esta enfermedad, lo que ofrece un modelo sólido para investigar los efectos de nuevas terapias administradas por inyección intraarticular en la progresión de la enfermedad. Debido a que el hueso mineralizado tiene un excelente contraste en la micro-TC, esta modalidad se puede utilizar para evaluar las características 3D y realizar análisis cuantitativos de los cambios asociados con la OA. Dos mediciones cuantitativas especialmente relevantes son la densidad mineral ósea y el grosor trabecular, ya que ambas aumentan a lo largo de la progresión de la enfermedad. La metodología descrita de inyecciones intraarticulares en cobayas y el posterior análisis de los datos de micro-TC ayudarán a reducir la variabilidad del estudio y aumentar la eficiencia de los análisis de datos.Afeita la rodilla con una maquinilla de afeitar eléctrica. Anestesiar al animal y confirmar una profundidad adecuada de la anestesia por falta de respuesta de pinzamiento de los dedos del pie. Coloque lubricante ocular estéril en ambos ojos para prevenir la desecación y las lesiones.Limpie el lugar de la inyección tres veces con movimientos circulares y alterne con el exfoliante diluido y las soluciones de alcohol. Se deben utilizar guantes estériles. Este video incluye el uso de guantes nitro para autoclave.Se debe utilizar una técnica aséptica durante todo el procedimiento. Flexiona la rodilla a 90 grados, mueve el dedo distal a la rótula para localizar el surco de la cara distal del espacio articular flexionando y extendiendo la extremidad trasera. La tibia se puede sentir como la estructura ósea distal a la rótula.Una vez que se determina la ubicación de la tibia y la rótula, la unión se encuentra entre ellas. Inserte la aguja de insulina con cuidado en la línea media distal a la rótula dentro del espacio articular. La aguja debe insertarse uno o dos milímetros por debajo de la piel.Inyecte el volumen lentamente. Masajee la rodilla flexionando y extendiendo la articulación unas cuantas veces para asegurar la distribución adecuada del medicamento. Coloque las muestras con formalina en un recipiente compatible.Calibre la máquina de micro-CT para exposiciones de campo oscuro y campo claro, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Escaneo de la muestra con filtro de cobre y aluminio a 18 micras. Utilice el paso de rotación de 0,7 grados para 360 grados con la cámara desplazada.Seleccione un corte de las imágenes de micro-CT. Compruebe la compensación de desalineación. En Ajustes, aplique suavizado, endurecimiento de haz, rotación CS y artefacto de anillo.Seleccione Iniciar para comenzar la reconstrucción. Seleccione VOI y oriente la muestra para alinearla verticalmente y facilitar el análisis posterior. Guarde el VOI editado como una nueva carpeta.Seleccione el rango de imágenes a analizar, empezando por la placa subcondral. Se recomienda dividir el análisis de la placa subcondral en el hueso trabecular porque tienen diferentes características óseas. Seleccione la región de interés de cada imagen para asegurarse de que abarca el hueso.Seleccione Selección binaria. Ajuste el histograma para que el fondo del hueso esté completamente separado. Seleccione la pestaña Densidad mineral ósea.Guarde esos datos en una nueva carpeta de datos de análisis. Seleccione Procesamiento personalizado. En primer lugar, realice el establecimiento de umbrales y seleccione Automático y, a continuación, ejecute.A continuación, seleccione Eliminar motas y elija Eliminar manchas negras. Repita Despeckle y elija Eliminar motas blancas. Elija Análisis 3D y seleccione los valores básicos y los valores adicionales.A muestra una rodilla disecada con presencia de tinte azul de metileno dentro del espacio articular, mostrando la inyección correcta. B es una inyección superficial que da lugar a la formación de una ampolla en el espacio subcutáneo. C muestra la falta de tinte azul de metileno dentro del espacio articular, lo que muestra una inyección incorrecta.Puede ser útil dividir el análisis de la placa subcondral, que se muestra en A y el hueso trabecular, que se muestra en B, ya que a veces tienen diferentes parámetros para diferentes análisis óseos. En cuanto a la densidad mineral ósea, vemos que hay un aumento en la media de los cobayos de 12 meses en comparación con los cobayos de cinco meses, y esto es cierto tanto en la placa subcondral como en el hueso trabecular, lo que demuestra que la densidad mineral ósea aumenta con el tiempo. Además del grosor trabecular, vemos que hay un aumento del grosor en milímetros entre el conejillo de indias de 12 meses y el conejillo de nueve meses y el conejillo de cinco meses, lo que demuestra que el grosor trabecular aumenta con el tiempo.Las puntuaciones de Mankin modificadas aumentan a medida que los conejillos de indias envejecen, como se ve en la figura A. Las figuras B a D muestran manchas de azul de toluidina. B es un conejillo de indias de cinco meses, C es un conejillo de indias de nueve meses y D es un conejillo de indias de 12 meses. El asterisco negro de la figura C muestra la pérdida de proteoglicanos, mientras que el asterisco negro de la figura D muestra fisuras, y el asterisco blanco de la figura D muestra hipocelularidad.En la actualidad, la única cura para la artrosis grave es el reemplazo, que es costoso, invasivo y puede provocar morbilidad y mortalidad del paciente. Como resultado, existe una necesidad imperiosa de continuar investigando con modelos animales de OA y el desarrollo sostenido de nuevas terapias. Aunque las inyecciones intraarticulares son parte integral de los estudios de artrosis en conejillos de indias, este procedimiento aún no se ha detallado sistemáticamente.Los procedimientos de inyección adecuados son primordiales para garantizar el bienestar de los animales y reducir el número total de animales, especialmente para los estudios que requieren múltiples inyecciones durante muchos meses. Para evaluar sistemáticamente los cambios relacionados con la OA, describimos los análisis de micro-TC. La micro-TC proporciona una evaluación más profunda de los cambios en la artrosis que la revisión histológica de las exploraciones en una muestra completa en lugar de una o unas pocas secciones de tejido.Si bien los conejillos de indias Dunkin-Hartley proporcionan un modelo sólido para estudiar la progresión de la artrosis y los efectos de nuevas terapias, este modelo tiene limitaciones. Los modelos espontáneos suelen requerir un período de estudio más largo en comparación con el rápido desarrollo de cambios después de la OA quirúrgica o inducida químicamente. Además, los investigadores pueden reducir el efecto de la variabilidad entre animales mediante la aplicación de tratamientos a una extremidad de cada animal, permitiendo que la extremidad contralateral sirva como control interno.

micro-computed-tomography-analysis-knee-aged-dunkin-hartley-guinea

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Demostramos cómo realizar macrófagos RM con contraste superparamagnético ultra pequeño (USPIO) en la artritis séptica, lo que permite una inicial y...

En vivo los macrófagos de imágenes utilizando MR Agente de contraste dirigida para la Evaluación Longitudinal de Artritis séptica

Se describe un protocolo para la desestabilización del menisco medial modelo (DMM) en ratones, una herramienta eficaz para la osteoartritis (OA) de la investigación. Además, hemos demostrado que la deficiencia de desarrollo progranulincan OA exagera y la progresión mediante el uso de este modelo, lo que indica que progranulina juega un papel protector en la patogénesis de la OA.

Establecimiento de un modelo quirúrgicamente inducida en ratones para investigar el papel de protección de progranulina en la osteoartritis

Este artículo de metodología presenta un protocolo de medición cuantitativa asistido por software para cuantificar el grosor óseo subcondral histológico en articulaciones de rodilla osteoartríticas murinas y articulaciones normales de rodilla como controles. Este protocolo es altamente sensible al engrosamiento sutil y es adecuado para detectar cambios óseos subcondrales osteoartríticos tempranos.

Medición cuantitativa asistida por software del grosor óseo subcondral osteoartrítico

El presente protocolo describe los arañazos controlados de microcuchilla en la superficie del cartílago articular después de desestabilizar la rodilla del ratón cortando el ligamento miniescotibial medial. Este modelo animal presenta una forma acelerada de osteoartritis (OA) adecuada para estudiar la formación de osteofitos, la osteosclerosis y el dolor en etapa temprana.

Desestabilización del menisco medial y el cartílago rasguño modelo murino de osteoartritis acelerada

La lesión no invasiva del LCA es un método fiable y clínicamente relevante para iniciar la osteoartritis postraumática (PTOA) en ratones. Este método de lesión también permite la cuantificación in vivo de la actividad de la proteasa en la articulación en puntos de tiempo tempranos después de la lesión utilizando sondas de infrarrojo cercano activables por proteasa e imágenes de reflectancia de fluorescencia.

Lesión no invasiva del ligamento cruzado anterior (LCA) inducida por compresión e imágenes in vivo de la actividad de la proteasa en ratones

En este documento, describimos un método quirúrgico para seccionar el ligamento cruzado anterior (LCA) como un modelo confiable para inducir osteoartritis de rodilla en roedores y metodologías para recolectar líquido sinovial de rodilla, medir el edema de rodilla y evaluar la gravedad de la osteoartritis.

Transección del ligamento cruzado anterior y lavado de líquido sinovial en un modelo de roedor para estudiar la inflamación articular y la osteoartritis postraumática

El desarrollo de un flujo de trabajo automatizado de detección de espacio articular permitió la segmentación de alto rendimiento de huesos distintos de la pata trasera murina con una precisión del &gt;98% en animales salvajes. Se logró una aplicación flexible a las patas delanteras y patas con artritis inflamatoria-erosiva, pero con un rendimiento obsoleto que justifica una mayor optimización en futuros estudios utilizando datos públicos.

La detección automatizada del espacio articular mejora la precisión de la segmentación ósea

La visualización de los vasos coronarios es fundamental para avanzar en nuestra comprensión de las enfermedades cardiovasculares. Aquí se describe un método para la perfusión vascular coronaria murino con una goma de silicona radiopaco (Microfil), en preparación para la micro-tomografía axial computerizada (μCT) de imágenes.

Perfusión retrógrada y llenado de la vasculatura coronaria del ratón, como preparación para la Micro tomografía computarizada

Osmótica Drug Delivery de miembros posteriores isquémicos y la perfusión de la vasculatura con Microfil para Micro-tomografía computarizada

El injerto de grasa es una técnica esencial para reconstruir los déficits de tejidos blandos. Sin embargo, sigue siendo un procedimiento impredecible caracterizado por una supervivencia variable del injerto.  Nuestro objetivo era diseñar un modelo de ratón que utilizara un nuevo método de imagen para comparar la retención de volumen entre diferentes técnicas de preparación y administración de injertos de grasa.

Evaluación de la viabilidad de la inyección de grasa humana en ratones desnudos con micro-tomografía computarizada

Aprende a realizar inyecciones intraarticulares y análisis por micro-CT en cobayas Dunkin-Hartley para investigar la osteoartritis. Este método permite evaluar cambios en densidad mineral ósea y espesor trabecular.

Análisis por tomografía microcomputarizada de la rodilla en cobayas Dunkin-Hartley envejecidos después de una inyección intraarticular (Video) | JoVE Journal

Análisis por tomografía microcomputarizada de la rodilla en cobayas Dunkin-Hartley envejecidos después de una inyección intraarticular

Explorar más videos