Análisis por tomografía microcomputarizada de la rodilla en cobayas Dunkin-Hartley envejecidos después de una inyección intraarticular

La osteoartritis, o OA, es una enfermedad degenerativa de las articulaciones que afecta a 32,5 millones de adultos estadounidenses. A menudo, los síntomas de la artrosis aparecen solo después de que la enfermedad se ha vuelto grave. La falta de fármacos modificadores de la enfermedad se debe a una escasa comprensión de los mecanismos que inician e impulsan la enfermedad.

Como resultado, existe una necesidad médica crítica y continua de agentes mejorados para el tratamiento de la artrosis. Los conejillos de indias Dunkin-Hartley son un modelo animal establecido de OA, ya que desarrollan naturalmente esta enfermedad, lo que ofrece un modelo sólido para investigar los efectos de nuevas terapias administradas por inyección intraarticular en la progresión de la enfermedad. Debido a que el hueso mineralizado tiene un excelente contraste en la micro-TC, esta modalidad se puede utilizar para evaluar las características 3D y realizar análisis cuantitativos de los cambios asociados con la OA. Dos mediciones cuantitativas especialmente relevantes son la densidad mineral ósea y el grosor trabecular, ya que ambas aumentan a lo largo de la progresión de la enfermedad. La metodología descrita de inyecciones intraarticulares en cobayas y el posterior análisis de los datos de micro-TC ayudarán a reducir la variabilidad del estudio y aumentar la eficiencia de los análisis de datos.

Afeita la rodilla con una maquinilla de afeitar eléctrica. Anestesiar al animal y confirmar una profundidad adecuada de la anestesia por falta de respuesta de pinzamiento de los dedos del pie. Coloque lubricante ocular estéril en ambos ojos para prevenir la desecación y las lesiones.

Limpie el lugar de la inyección tres veces con movimientos circulares y alterne con el exfoliante diluido y las soluciones de alcohol. Se deben utilizar guantes estériles. Este video incluye el uso de guantes nitro para autoclave.

Se debe utilizar una técnica aséptica durante todo el procedimiento. Flexiona la rodilla a 90 grados, mueve el dedo distal a la rótula para localizar el surco de la cara distal del espacio articular flexionando y extendiendo la extremidad trasera. La tibia se puede sentir como la estructura ósea distal a la rótula.

Una vez que se determina la ubicación de la tibia y la rótula, la unión se encuentra entre ellas. Inserte la aguja de insulina con cuidado en la línea media distal a la rótula dentro del espacio articular. La aguja debe insertarse uno o dos milímetros por debajo de la piel.

Inyecte el volumen lentamente. Masajee la rodilla flexionando y extendiendo la articulación unas cuantas veces para asegurar la distribución adecuada del medicamento. Coloque las muestras con formalina en un recipiente compatible.

Calibre la máquina de micro-CT para exposiciones de campo oscuro y campo claro, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Escaneo de la muestra con filtro de cobre y aluminio a 18 micras. Utilice el paso de rotación de 0,7 grados para 360 grados con la cámara desplazada.

Seleccione un corte de las imágenes de micro-CT. Compruebe la compensación de desalineación. En Ajustes, aplique suavizado, endurecimiento de haz, rotación CS y artefacto de anillo.

Seleccione Iniciar para comenzar la reconstrucción. Seleccione VOI y oriente la muestra para alinearla verticalmente y facilitar el análisis posterior. Guarde el VOI editado como una nueva carpeta.

Seleccione el rango de imágenes a analizar, empezando por la placa subcondral. Se recomienda dividir el análisis de la placa subcondral en el hueso trabecular porque tienen diferentes características óseas. Seleccione la región de interés de cada imagen para asegurarse de que abarca el hueso.

Seleccione Selección binaria. Ajuste el histograma para que el fondo del hueso esté completamente separado. Seleccione la pestaña Densidad mineral ósea.

Guarde esos datos en una nueva carpeta de datos de análisis. Seleccione Procesamiento personalizado. En primer lugar, realice el establecimiento de umbrales y seleccione Automático y, a continuación, ejecute.

A continuación, seleccione Eliminar motas y elija Eliminar manchas negras. Repita Despeckle y elija Eliminar motas blancas. Elija Análisis 3D y seleccione los valores básicos y los valores adicionales.

A muestra una rodilla disecada con presencia de tinte azul de metileno dentro del espacio articular, mostrando la inyección correcta. B es una inyección superficial que da lugar a la formación de una ampolla en el espacio subcutáneo. C muestra la falta de tinte azul de metileno dentro del espacio articular, lo que muestra una inyección incorrecta.

Puede ser útil dividir el análisis de la placa subcondral, que se muestra en A y el hueso trabecular, que se muestra en B, ya que a veces tienen diferentes parámetros para diferentes análisis óseos. En cuanto a la densidad mineral ósea, vemos que hay un aumento en la media de los cobayos de 12 meses en comparación con los cobayos de cinco meses, y esto es cierto tanto en la placa subcondral como en el hueso trabecular, lo que demuestra que la densidad mineral ósea aumenta con el tiempo. Además del grosor trabecular, vemos que hay un aumento del grosor en milímetros entre el conejillo de indias de 12 meses y el conejillo de nueve meses y el conejillo de cinco meses, lo que demuestra que el grosor trabecular aumenta con el tiempo.

Las puntuaciones de Mankin modificadas aumentan a medida que los conejillos de indias envejecen, como se ve en la figura A. Las figuras B a D muestran manchas de azul de toluidina. B es un conejillo de indias de cinco meses, C es un conejillo de indias de nueve meses y D es un conejillo de indias de 12 meses. El asterisco negro de la figura C muestra la pérdida de proteoglicanos, mientras que el asterisco negro de la figura D muestra fisuras, y el asterisco blanco de la figura D muestra hipocelularidad.

En la actualidad, la única cura para la artrosis grave es el reemplazo, que es costoso, invasivo y puede provocar morbilidad y mortalidad del paciente. Como resultado, existe una necesidad imperiosa de continuar investigando con modelos animales de OA y el desarrollo sostenido de nuevas terapias. Aunque las inyecciones intraarticulares son parte integral de los estudios de artrosis en conejillos de indias, este procedimiento aún no se ha detallado sistemáticamente.

Los procedimientos de inyección adecuados son primordiales para garantizar el bienestar de los animales y reducir el número total de animales, especialmente para los estudios que requieren múltiples inyecciones durante muchos meses. Para evaluar sistemáticamente los cambios relacionados con la OA, describimos los análisis de micro-TC. La micro-TC proporciona una evaluación más profunda de los cambios en la artrosis que la revisión histológica de las exploraciones en una muestra completa en lugar de una o unas pocas secciones de tejido.

Si bien los conejillos de indias Dunkin-Hartley proporcionan un modelo sólido para estudiar la progresión de la artrosis y los efectos de nuevas terapias, este modelo tiene limitaciones. Los modelos espontáneos suelen requerir un período de estudio más largo en comparación con el rápido desarrollo de cambios después de la OA quirúrgica o inducida químicamente. Además, los investigadores pueden reducir el efecto de la variabilidad entre animales mediante la aplicación de tratamientos a una extremidad de cada animal, permitiendo que la extremidad contralateral sirva como control interno.