Name: Perfusión quirúrgica y aislamiento del páncreas porcino para el aislamiento de islotes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda el protocolo de perfusión quirúrgica y aislamiento de islotes pancreáticos en cerdo mediante canulación aórtica percutánea. Este método optimiza el rendimiento y la pureza para xenotrasplante.

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<meta charset="utf8"></head><body>Purificación de islotes porcinos por perfusión quirúrgica de páncreas de cerdo

<ol><li>Gillespie, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+pathogenesis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22CMAJ%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention.</a> CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).</li>
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<li>Tullius, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+crystal+deposits+in+abdominal+organs+following+perfusion+with+defrosted+University+of+Wisconsin+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Accumulation of crystal deposits in abdominal organs following perfusion with defrosted University of Wisconsin solutions.</a> Am J Transplant. 2 (7), 627-630 (2002).</li>
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<li>vander Windt, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+islet+damage+after+direct+exposure+of+pig+islets+to+blood%3A+has+humoral+immunity+been+underestimated%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Early islet damage after direct exposure of pig islets to blood: has humoral immunity been underestimated.</a> Cell Transplant. 21 (8), 1791-1802 (2012).</li>
<li>Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+blood+content+on+porcine+pancreatic+dissociation+and+islet+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield.</a> Transplant Proc. 26 (6), 3442(1994).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+porcine+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult porcine islets of Langerhans.</a> Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M NaOH, 100 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS, 500 mL (15 a 30 &deg; C)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1x D-PBS, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 1 L</td><td>Thermo Fisher</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Tubos Cónicos</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430236-6EA</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B [50 mg]</td><td>Millipore Sigma</td><td>PHR1662</td><td></td></tr><tr><td>Povidona Yodada Antiséptica 10%</td><td>Millipore Sigma</td><td>25655-41-8</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Gradiente</td> Former <td>BioRad</td><td>395</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Thermo Fisher</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Procesador de células COBE</td><td>Ebay</td><td>317690&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Depósito de circuito de digestión, botella Gibco, 1 L</td><td>Thermo Fisher</td><td>10341001</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>Thermo Fisher</td><td>60-10-6</td><td></td></tr><tr><td>Kit de conexión de formador de gradiente</td><td>BioRad 1652008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparina [1000 U/mL]</td><td>Productos médicos de emergencia</td><td>0409-2720-01</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HEPES (1 m), 100 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana 25%, 100 mL</td><td>Celprogen</td><td>HSA2001-25-1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Covetrus</td><td>Artículo#:11695067772</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Patterson</td><td>Artículo #:07-894-8462</td><td></td></tr><tr><td>Liberase (100 mg)</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Kit de Viabilidad/Citotoxicidad</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Linfolito 1.1 Medios 500 mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5020</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex LS 16 Tubo</td><td>Masterfle</td><td>96419-16</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Masterflex Masterflex</td><td></td><td>07522-30</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (2 mg/mL)</td><td>Celprogen</td><td>PS-30-002</td><td></td></tr><tr><td>Pulmozyme (1 mg/mL, 2,5 mL/vial)</td><td>Dornase Alfa</td><td>8931278</td><td></td></tr><tr><td>Medio de recuperación, PIM(R)</td><td>Prodo Laboratories, Inc.</td><td>PIM-R001GMP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Millipore Sigma</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo estándar, PIM(S)</td><td>Prodo Laboratories, Inc.</td><td>PIM-S001GMP</td><td></td></tr><tr><td>Tzed&comercio; (tiletamina y zolazepam) Inyección C</td><td>Patterson</td><td>Artículo #:07-894-6240</td><td></td></tr><tr><td>Universidad de Wisconsin (UW) Solución, 3 L</td><td>Soluciones Globales de Trasplante</td><td>1000-0046-06</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Sigma Alderich CLS6783-1EA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Patterson</td><td>Artículo #:07-891-6165</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusión quirúrgica y aislamiento del páncreas porcino para el aislamiento de islotes

Surgical Perfusion and Isolation of the Porcine Pancreas for Islet Isolation

La configuración operatoria y la laparotomía de la línea media se muestran en la Figura 1. La incisión de la laparotomía debe ser curvada para evitar la apertura urogenital (Figura 1B). Al instalar el retractor, coloque el poste para el retractor Omni o Bookwalter en la esquina inferior izquierda de la mesa. La retracción ideal incluye dos cuchillas retractoras para la pared abdominal derecha, dos para la pared abdominal izquierda y 1-2 para el colon derecho y el intestino delgado envueltas en una toalla estéril (Figura 1C). Se pueden utilizar cuchillas retractoras de pared de la carrocería, esplácnicas o maleables, según la disponibilidad de un asistente y las preferencias del operador. Si no se dispone de un retractor Omni o Bookwalter, se pueden utilizar 1-2 retractores Balfour autorretenedores para retraer la pared abdominal a ambos lados. Luego, un asistente puede aplicar la retracción en el colon derecho y el intestino delgado envuelto en una toalla estéril.
La disección retroperitoneal llevada a cabo en la Figura 2 se puede realizar con una mezcla de disección roma y aguda. Si bien es importante obtener el control circunferencial de la VCI infrarrenal y la aorta, no es necesario continuar esta disección hasta la bifurcación. La parte intratorácica del procedimiento es la más desafiante técnicamente (Figura 3), ya que la lesión de la VCI intratorácica o retrohepática puede causar un sangrado significativo y oscurecer el campo operatorio. Al identificar la aorta torácica descendente, separe sin rodeos la aorta del esófago con el pulgar y el índice. Para evitar la avulsión de pequeñas arterias intercostales y el sangrado posterior, el control circunferencial no es imprescindible siempre y cuando la aorta torácica descendente sea accesible con un espacio claramente definido para alojar una pinza aórtica.
La canulación de la aorta infrarrenal se realiza mediante la técnica de Seldinger (Figura 4). Esto se puede hacer con la aorta infrarrenal pinzada proximal y distalmente (Figura 4A), o directamente sin pinzamiento. Tenga cuidado de no insertar la aguja a través de la pared posterior de la aorta. También se puede usar una vaina más grande si la aorta tiene un tamaño suficiente. Es importante purgar el aire del tubo de extensión intravenosa y conectar el tubo intravenoso de la solución UW a la vaina de 10Fr de forma estéril. Asegúrese de que el canal IV esté abierto, aunque el flujo no se iniciará hasta que se pince la aorta (Figura 4B). Al realizar la venotomía en la VCI infrarrenal, es importante que el cirujano principal agarre firmemente la VCI con pinzas DeBakey, para no perder el sitio de la venotomía y que se vierta un gran volumen de sangre en el campo operatorio. Una venotomía alejada del páncreas, con la colocación inmediata de la succión en piscina, mantiene un campo operatorio incruento con planos de tejido claros para la pancreatectomía (Figura 4C). El drenaje inicial será sangre venosa oscura, pero se aclarará a medida que el cerdo se desangra y la solución de UW se perfunde a través de las vísceras. Asegúrese de usar un recipiente de succión grande para esta parte del procedimiento.
Las vísceras, y en particular, el páncreas, se volverán cada vez más pálidas a medida que se perfunde la solución UW (Figura 5A). El conducto pancreático se puede identificar siguiendo el curso del lóbulo duodenal hacia el duodeno. El conducto debe dividirse entre dos bridas de seda para evitar la contaminación con contenido entérico (Figura 5B). Mientras que el parénquima pancreático debe aparecer pálido y sin sangre, el tejido conectivo restante que rodea al páncreas debe limpiarse antes del aislamiento de los islotes (Figura 5C).
A continuación, el páncreas recolectado puede someterse a un proceso de aislamiento y purificación de islotes de varios pasos (Figura 6). La Figura 7A muestra la distribución representativa del tamaño de los islotes después del proceso de aislamiento y purificación de los islotes. La Figura 7B muestra los islotes purificados mediante microscopía de campo claro y después de la tinción viva/muerta, con la tinción verde y roja que representan las células de los islotes viables y no viables, respectivamente. El rendimiento y la pureza de los islotes se pueden evaluar utilizando un contador de células de islotes. Los rendimientos representativos se proporcionan a partir de tres aislamientos pancreáticos porcinos independientes que se resumen en la Figura 7C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig01.jpg"> Figura 1: Configuración de la operación. (A) Cerdo colocado en posición supina con el abdomen preparado estérilmente; (B) Laparotomía de la línea media hecha desde el xifoides hasta el pubis; (C) Retroperitoneo expuesto con el retractor Omni en su lugar. Barras de escala = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig02.jpg"> Figura 2: Disección retroperitoneal. (A) Disección retroperitoneal completa con control circunferencial de la VCI infrarrenal y las venas renales. El rectángulo amarillo se amplía en la Figura 2B; (B) Imagen ampliada de la VCI infrarrenal y las venas renales; (C) Venas renales cortadas. Barras de escala = 2 cm. Abreviatura: IVC = vena cava inferior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig03.jpg"> Figura 3: Obtención del control supracelíaco. (A) Hemidiafragma derecho inciso. El cuadrado amarillo se amplía en la Figura 3B; (B) Extensión de la incisión del hemidiafragma derecho para exponer la VCI intratorácica y la aorta torácica descendente; (C) Control circunferencial de la VCI intratorácica obtenida. Barras de escala = 2 cm. Abreviatura: IVC = vena cava inferior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig04.jpg"> Figura 4: Canulación aórtica infrarrenal, aislamiento visceral y perfusión. (A) Control proximal y distal de la aorta infrarrenal obtenido; (B) Vaina de 10Fr colocada en la aorta infrarrenal mediante técnica de Seldinger; (C) Perfusión visceral a través de la vaina aórtica infrarrenal y drenaje a través de venotomía y succión de piscina en VCI infrarrenal. Barras de escala = 2 cm. Abreviatura: IVC = vena cava inferior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig05.jpg"> Figura 5: Pancreatectomía total. (A) Las vísceras se vuelven más pálidas durante la perfusión; (B) conducto pancreático aislado; C) Páncreas porcino explantado. Barras de escala = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig06.jpg"> Figura 6: Aislamiento y purificación de islotes. Representación esquemática de la infusión de solución enzimática, digestión del páncreas porcino, recolección de tejidos, lavado celular con procesador celular y cultivo y análisis celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig07.jpg"> Figura 7: Viabilidad y rendimiento representativos de los islotes después de la purificación. (A) Islotes porcinos después de la obtención de imágenes de campo claro ampliadas y tinción de vivos/muertos. El verde muestra células vivas; El rojo muestra las células muertas. Barras de escala = 100 μm (B) Distribución del histograma del tamaño de los islotes porcinos después de la purificación. (C) Tabla que indica la pureza y el rendimiento de los islotes de tres aislamientos de islotes pancreáticos porcinos. Abreviatura: IEQ = equivalente de islote, la unidad estándar para la cuantificación de islotes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Perfusión quirúrgica y aislamiento del páncreas porcino para el aislamiento de islotes

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet ...

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Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (I parte: la digestión y la acumulación de tejido de páncreas), utilizando un método modificado automatizado.

Aislamiento humanos islote pancreático: Parte I: La digestión y la acumulación de tejido pancreático

La oferta de la diabetes tipo 2 isletas para la investigación es insuficiente. Aquí compartimos nuestro protocolo para el aislamiento de islotes de pacientes sometidos a pancreatectomía parcial. Este enfoque representa un lugar único para la obtención de islotes de diabetes tipo 2 y clínicamente emparejado sujetos no diabéticos en un número suficiente de estudios básicos y clínicos.

El aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente Pancreatectomized

Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que producen hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Este protocolo explica un método para aislar los islotes pancreáticos mediante la perfusión de colagenasa a través de la ampolla de Vater para digerir el tejido pancreático exocrino y una centrifugación en gradiente de densidad simplificada para purificar los islotes de ratones.

Aislamiento de islotes pancreáticos mediante perfusión de colagenasa: un método enzimático para aislar células de islotes pancreáticos

Se describe un protocolo en el presente documento para el aislamiento de islotes intactos de ratones neonatales. Páncreas se digirieron parcialmente con colagenasa, seguido de lavado y recolección a mano. 20 - 80 grupos de los islotes se pueden obtener por el páncreas de los ratones recién nacidos, que son adecuados para diversos estudios de los islotes.

El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Ingeniería de tejidos del páncreas entero es un desafío debido a sus funciones exocrinas y endocrinas. Mostramos un método para la disección de un páncreas porcino intacto y el proceso de éxito descelularización por perfusión de detergentes Triton X-100, desoxicolato de sodio y desoxirribonucleasa.

Aislamiento y la descelularización de un páncreas todo porcino

El artículo en video resume la técnica de pancreatectomía y alotrasplante de páncreas en un modelo porcino de supervivencia de 3 días con una descripción paso a paso del método y énfasis en los consejos y trucos quirúrgicos para lidiar con la precaria y delicada anatomía visceral porcina.

Consejos y trucos quirúrgicos para realizar un trasplante de páncreas porcino

Aquí, proporcionamos detalles sobre la realización de la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) a través de la perfusión a través de la vasculatura de los ratones con un páncreas intacto como una técnica adicional para evaluar la función pancreática endocrina con reducción de posibles factores de confusión.

Secreción de insulina estimulada por glucosa a través de la perfusión a través de la vasculatura de ratones con un páncreas intacto

Este estudio desarrolló un método simplificado para extraer eficientemente islotes primarios funcionales y células acinas del páncreas del ratón, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar la comunicación intercelular en la patogénesis de la Diabetes Inducida por Pancreatitis Aguda.

Un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios y células acinares pancreáticas primarias de ratones

Este protocolo describe un método estandarizado para la extracción quirúrgica, la digestión enzimática y la purificación con gradiente de densidad de islotes pancreáticos de rata Lewis, permitiendo preparaciones de alto rendimiento y alta pureza para su uso directo en trasplantes o estudios in vitro .

Aislamiento y purificación de islotes pancreáticos a partir de ratas Lewis mediante digestión enzimática y separación por gradiente de densidad

Aprenda el protocolo de perfusión quirúrgica y aislamiento de islotes pancreáticos en cerdo mediante canulación aórtica percutánea. Este método optimiza el rendimiento y la pureza para xenotrasplante.

Perfusión quirúrgica y aislamiento del páncreas porcino para el aislamiento de islotes

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