Name: Paradigmas para la evaluación conductual en el modelo de Drosophila del trastorno del espectro autista (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a evaluar cinco paradigmas conductuales en Drosophila para investigar el trastorno del espectro autista, incluyendo agresión, espaciado social, cortejo, acicalamiento y habituación. Estos métodos permiten cuantificar déficits conductuales relacionados con genes de TEA.

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Estamos inmensamente agradecidos a Mani Ramaswami (NCBS, Bangalore) y Baskar Bakthavachalu (IIT Mandi) por la configuración del ensayo de habituación y elección de olor, a Pavan Agrawal (MAHE) por sus valiosas sugerencias sobre el ensayo de agresión, a Amitava Majumdar (NCCS, Pune) por compartir su prototipo de cámara de ensayo de cortejo y las líneas de mosca mutantes Fmr1 , y a Gaurav Das (NCCS, Pune) por compartir la línea MB247-GAL4. Agradecemos al Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana, EE. UU.), al Instituto Nacional de Genética (NIG, Kyoto, Japón), a la Universidad Hindú de Banaras (BHU, Varanasi, India) y al Centro Nacional de Ciencias Biológicas (NCBS, Bangalore, India) por las líneas de Drosophila . El trabajo en el laboratorio contó con el apoyo de subvenciones de SERB-DST (ECR/2017/002963) a AD, la beca DBT Ramalingaswami otorgada a AD (BT/RLF/Re-entry/11/2016) y el apoyo institucional del IIT Kharagpur, India. SD y SM reciben becas de doctorado de CSIR-Senior Research Fellowship; PM recibe una beca de doctorado de MHRD, India.

Drosophila Modelos de rasgos genéticos y conductuales del trastorno del espectro autista

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Drosophila se utiliza como un buen organismo modelo para la investigación de trastornos neurológicos humanos debido a un alto grado de conservación de las secuencias génicas entre los genes de la mosca y los genes de las enfermedades humanas9. Numerosos paradigmas conductuales robustos lo convierten en un modelo atractivo para el estudio de los fenotipos que se manifiestan en mutantes que recapitulan enfermedades humanas. Dado que cientos de genes están implicados en el trastorno del espectro autista (TEA), no existe un modelo común de TEA en ningún organismo modelo. Por lo tanto, para cada mutante, los investigadores primero deben establecer fenotipos similares a los TEA en la mosca. En este artículo, hemos tratado de simplificar el proceso proponiendo el uso de cinco paradigmas de comportamiento de mosca en conjunto para dicha evaluación. Estos paradigmas se emplean en moscas para evaluar los principales déficits conductuales que ocurren comúnmente en los pacientes humanos con TEA: déficits sociales y de comunicación, mejora de los comportamientos repetitivos y un defecto de habituación. Si una mutación genética de mosca muestra defectos en todos o en la mayoría de estos cinco paradigmas, podría ser una fuerte indicación de un escenario similar al TEA.
La mayoría de los paradigmas conductuales descritos aquí se han utilizado varias veces en la literatura previa para resolver diversas preguntas de investigación. No es raro encontrar variaciones en las técnicas entre los diferentes estudios. Los ajustes en las técnicas se realizaron para que coincidan con la necesidad de la investigación y para adaptarse a la demanda de la pregunta específica que se está resolviendo. Por ejemplo, en el ensayo de cortejo, el comportamiento de cortejo innato y aprendido se puede cuantificar hacia una mosca de prueba, que puede ser un macho inmaduro65, una hembra virgen66,67, una hembra preapareada 68,69,70, una hembra virgen congelada65, o incluso una hembra decapitada19. En el método descrito en este artículo, se han utilizado hembras preapareadas de tipo salvaje como probador para comprobar el patrón de cortejo de una mosca modelo de TEA macho. Lareceptividad exual de una hembra preapareada es relativamente menor que la de una mosca virgen71. Como resultado, el número de episodios de cortejo de los machos y su duración son más hacia una hembra apareada que hacia una virgen; Del mismo modo, la latencia hasta la cópula también es más larga que la de las hembras vírgenes probadoras, en cuyo caso la cópula temprana conduce a un índice de cortejo reducido, lo que reduce el alcance de una comparación efectiva entre genotipos. Por lo tanto, el uso de hembras preapareadas como probador proporciona un mejor análisis comparativo del comportamiento de cortejo de una mosca TEA frente a una mosca de tipo salvaje. Por otro lado, el uso de hembras vírgenes puede proporcionar información adicional que puede quedar enmascarada cuando se utilizan hembras apareadas. El uso de hembras apareadas también puede influir y alterar el comportamiento de cortejo de los machos. En resumen, se sugiere que los investigadores elijan su estrategia experimental y detalle en función de la necesidad del experimento específico.
Hay que tener cuidado antes de aplicar la técnica en cualquiera o en todos los homólogos de mosca de los genes del TEA. Todos estos paradigmas conductuales están regulados por un número específico y reducido de neuronas. La expresión de un determinado gen debe establecerse primero antes de pasar a un paradigma de comportamiento específico. Por ejemplo, si el homólogo de la mosca de un gen asociado al TEA no se expresa en las neuronas del cuerpo del hongo o en las neuronas glutamatérgicas, entonces el comportamiento de cortejo y acicalamiento puede no verse afectado en su mutante.
Otro punto con el que los investigadores deben tener cuidado es que la falta de un defecto no siempre significa que la mutación no tenga ningún papel. Por ejemplo, en los experimentos de comportamiento de acicalamiento con mutantes Fmr1 , el recuento total de episodios de acicalamiento no es significativamente menor en los mutantes que en los controles, mientras que otros parámetros como el índice de acicalamiento, etc. demuestran un defecto en el comportamiento de acicalamiento. Esto puede explicarse por la prolongación de cada episodio de acicalamiento en los mutantes Fmr1 , lo que resulta en un recuento bajo del número total de combates a pesar de que la duración total del combate es mucho mayor. Esto enfatiza la necesidad de cuantificar múltiples parámetros para cada patrón de comportamiento. Además, hay que recordar que el término TEA abarca una amplia gama de enfermedades causadas por variaciones en cualquiera de los cientos de genes, lo que da lugar a fenotipos heterogéneos con diversos grados de penetrancia entre los individuos afectados. Por ejemplo, se observa un déficit de habituación en algunos pacientes, pero no en todos. Lo mismo se esperaría en los modelos de mosca de la enfermedad.
Para el análisis de la conducta agresiva se tuvieron en cuenta en este estudio diferentes tipos de parámetros agresivos: embestida, amenaza de alas, forcejeos, etc. (Figura 1)30. Cada pelea debe identificarse y contarse como un tipo de pelea individual o como un recuento total de peleas. Es importante familiarizarse primero con los patrones de agresión de las moscas macho, que se describen en59,72 y se muestran en la Figura 1. Al contar los números de combates agresivos, los puntos de inicio y final de un solo evento de agresión deben identificarse claramente; Se pueden mostrar múltiples tipos de patrones de agresión dentro de un solo combate, seguidos del final del combate. Un ataque de agresión se considera terminado cuando una mosca deja de mostrar cualquiera de los comportamientos o movimientos agresivos durante 2 segundos o detiene el ataque y comienza a alejarse.
La mayoría de estos paradigmas conductuales tienen múltiples variaciones y avances descritos por múltiples laboratorios. Cada una de las modificaciones específicas se ha creado para satisfacer las necesidades de un propósito específico. Del mismo modo, las técnicas de cuantificación o análisis automatizadas y basadas en algoritmos han liberado a estas técnicas de las posibilidades de errores manuales. En este trabajo se han demostrado las técnicas más básicas con la menor cantidad de requerimientos materiales, con la esperanza de que estas técnicas puedan ser fácilmente adoptadas y utilizadas por el máximo número de investigadores.

El Trastorno del Espectro Autista (TEA) engloba un grupo heterogéneo de trastornos neurológicos. Incluye una serie de trastornos complejos del neurodesarrollo caracterizados por déficits multicontextuales y persistentes en la comunicación social y la interacción social y la presencia de patrones de comportamiento y actividad restringidos y repetitivos y de intereses1. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), 1 de cada 100 niños es diagnosticado con TEA en todo el mundo, con una proporción de 4,2 2 entre hombres ymujeres. La enfermedad se hace evidente en el segundo o tercer año de vida. Los niños con TEA muestran una falta de interés en la reciprocidad socioemocional, la comunicación no verbal y las habilidades de relación. Exhiben comportamientos repetitivos como movimientos motores estereotipados, seguimiento de rutinas inflexibles y ritualizadas, y un enfoque intenso en intereses restringidos. Los niños con TEA muestran un alto grado de respuesta al tacto, el olfato, el sonido y el gusto, mientras que la respuesta al dolor y a la temperatura es comparativamente baja1. La penetrancia de este trastorno también es diferente entre los diferentes pacientes que padecen TEA y, por lo tanto, la variabilidad aumenta.
El diagnóstico clínico actual del TEA se basa en la evaluación conductual de los individuos, ya que no existe una prueba genética común o basada en biomarcadores confirmatorios que abarque todas las formas de TEA3. Descifrar las bases genéticas y neurofisiológicas sería útil para orientar las estrategias de tratamiento. En la última década, una gran cantidad de investigaciones han dado como resultado la identificación de cientos de genes que se eliminan o mutan o cuyos niveles de expresión están alterados en pacientes con TEA. La investigación en curso hace hincapié en la validación de la contribución de estos genes candidatos utilizando organismos modelo como el ratón o la mosca de la fruta, en los que estos genes se eliminan o derriban, seguidos de pruebas para detectar déficits de comportamiento similares a los TEA y la elucidación de las vías genéticas y moleculares subyacentes que causan las anomalías. Un modelo de ratón que recapitula las variaciones del número de copias (CNV) en los loci cromosómicos humanos 16p11.2 muestra algunos de los defectos de comportamiento del TEA 4,5,6. La exposición prenatal a un fármaco teratogénico, el ácido valproico (VPA), es otro modelo de ratón que presenta rasgos que se asemejan al TEA humano 7,8. Además, existe una variedad de modelos de ratón que exhiben autismo asociado al síndrome genético, por ejemplo, modelos sindrómicos de un solo gen causados por mutaciones en Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c, y modelos no sindrómicos de un solo gen causados por mutaciones en genes como los genes Cntnap2, Shank, Neurexin o Neuroligin 5.
La mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) es otro organismo modelo prominente para estudiar las bases celulares, moleculares y genéticas de una gran cantidad de trastornos humanos9, incluido el TEA. Drosophila y los humanos comparten procesos biológicos altamente conservados a nivel molecular, celular y sináptico. Las moscas de la fruta se han utilizado con éxito en estudios de TEA 10,11,12 para caracterizar genes relacionados con TEA y descifrar su papel exacto en la sinaptogénesis, la función sináptica y la plasticidad, el ensamblaje de circuitos neuronales y la maduración; Se encontró que los homólogos de mosca de genes asociados a TEA tienen roles en la regulación del comportamiento social y/o repetitivo 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. La mosca de la fruta también ha funcionado como modelo para el cribado de genes de TEA y sus variantes 15,22,23. El mayor desafío en la investigación de los TEA en moscas es que, a diferencia de otros modelos de enfermedades, no existe un único modelo de mosca con TEA. Para comprender el impacto de las mutaciones o la eliminación de un gen específico del TEA, un investigador necesita validar si los fenotipos conductuales imitan suficientemente los síntomas de los pacientes con TEA y, a continuación, proceder a la comprensión de los fundamentos moleculares o fisiológicos de los fenotipos.
Por lo tanto, la detección de fenotipos similares al TEA es vital para la investigación del TEA en el modelo de mosca. A lo largo de los años han surgido un puñado de técnicas conductuales que nos permiten detectar anomalías como déficits en el comportamiento/interacción social, la comunicación, los comportamientos repetitivos y la capacidad de respuesta a los estímulos. Además, se han realizado varias modificaciones y actualizaciones de estas técnicas conductuales en diferentes laboratorios para adaptarse a requisitos específicos, como la ampliación, la automatización de ensayos, las lecturas, la cuantificación y los métodos de comparación. En este artículo de video, se muestran las versiones más básicas de cinco paradigmas conductuales, que, en combinación, se pueden usar para detectar resultados conductuales similares a los TEA de la manera más fácil.
La agresión es un comportamiento innato conservado evolutivamente que afecta a la supervivencia y la reproducción24. El comportamiento agresivo hacia los congéneres está influenciado por la "motivación para la socialización"25,26 así como por la "comunicación"27, ambas comprometidas en los individuos afectados por el TEA. El comportamiento agresivo está bien descrito en Drosophila y su cuantificabilidad a través del robusto ensayo de agresión 28,29,30 y una base genética y neurobiológica bien conocida 31 lo convierte en un paradigma conductual adecuado32 para evaluar el fenotipo de TEA en un modelo de mosca. La agresión se ve afectada por el aislamiento social fuera de un entorno social, lo que conduce a una mayor agresión; Lo mismo se ha observado cuando las moscas macho se alojan en aislamiento durante unos días 33,34. Otro ensayo conductual que cuantifica la sociabilidad en moscas es el Ensayo del Espacio Social35, que mide las distancias entre los vecinos más cercanos y las distancias entre moscas en un pequeño grupo de moscas, lo que lo hace perfectamente adecuado para probar las funciones de los ortólogos del gen ASD en la mosca 12,21,36,37, así como en los modelos de moscas ASD inducidos ambientalmente 38, Artículo 39.
El ensayo de cortejo de Drosophila es otro paradigma conductual utilizado con frecuencia para evaluar la alteración de las habilidades sociales y de comunicación tras la manipulación genética o de circuitos, incluidos los genes relacionados con el autismo 18,19,21,40. Los patrones repetitivos de comportamiento son prevalentes en los pacientes con TEA, que se recapitula en las moscas mediante el comportamiento de acicalamiento, una serie de acciones distintas y estereotipadas que se realizan para la limpieza y otros fines. Se ha utilizado con éxito para evaluar el impacto de las mutaciones del gen TEA en moscas21,41, así como la exposición a productos químicos38,39. Se han descrito múltiples avances y automatización en el ensayo antes de 16,41,42,43; Aquí, estamos demostrando el patrón de ensayo más básico, que es fácil de adoptar y cuantificar.
Se sabe que el TEA afecta la capacidad de habituación, aprendizaje y memoria en algunos pacientes 44,45,46,47,48,49,50, organismos modelo de TEA 51,52 y también causa déficits en diferentes comportamientos olfativos50. La habituación al salto con luz apagada de Drosophila se ha utilizado anteriormente para detectar los genes del TEA23. La habituación puede ser ensayada por un método simple de habituación olfativa 53,54,55. Describimos el método para inducir la habituación olfativa y analizamos el resultado utilizando un ensayo clásico de elección de olor binario basado en Y-maze56 que se puede utilizar para detectar defectos en la habituación en la condición de mutante del gen TEA o de derribo de genes. Para evaluar si el impacto de una mutación (o eliminación de genes) o de un tratamiento farmacológico en el comportamiento de una mosca equivale a un fenotipo similar al TEA, se puede utilizar una combinación de estos 5 ensayos descritos aquí.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Arena de agresión:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa estándar de 24 pocillos de poliestireno</td><td></td><td></td> transparente de <td>12 cm x 8 cm x 2 cm. Diámetro de un solo pocillo= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; profundidad = 1 cm</td></tr><tr>Lámina <td></td><td></td> transparente de<td>plástico/acrílico</td><td>Alternativa: una tapa perforada de una placa de cultivo celular</td></tr><tr><td><fuerte>Ensayo de espacio social:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td> de encuadernación <td>de 19 mm</td></tr><tr><td>Láminas de vidrio y láminas acrílicas de tamaños</td><td></td><td></td> personalizados <td>Espesor = 5 mm</td></tr><tr><td><fuerte>Ensayo de corte:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuerca y tornillo con rosca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Láminas de metacrilato de formas</td><td></td><td></td> <td>personalizadasi) Tapa: Un disco de metacrilato transparente redondo hecho a medida (2-3 mm de grosor, 70 mm de diámetro) con un orificio de carga en la región periférica y otro orificio de tornillo en el centro (diámetro ~ 3 mm para cada uno); ii) Un segundo disco de metacrilato transparente más grueso (3-4 mm de espesor, 70 mm de diámetro), con 6-8 perforaciones de 15 mm de diámetro, equidistantes del centro; iii) Base: Igual que la tapa, excepto sin el orificio</td></tr> <tr><td>de carga<fuerte>Ensayo de aseo: < / fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Panel</td><td></td><td></td> LED cubierto de vidrio difuso <td>10&ndash; Panel LED de montaje en techo de 15 vatios</td></tr><tr><td>Habituation and Y-maze assay</td>Climbing chambers x2, vidrio de borosilicato Adaptador para conectar Y-maze con un vial <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>de entrada Metacrilato, hecho a medida, mediciones en Figura 5AClear reactivos botellas Borosil #1500017 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tapón de</td><td></td><td></td> lavado <td>de gas Borosil #1761021</td></tr><tr><td>Frasco</td><td></td><td></td> de vidrio <td>OD= 25 mm x Altura= 85 mm; Vidrio de borosilicato</td></tr><tr><td>Odorante (butirato de etilo)</td><td></td><td></td><td>Merck #E15701</td></tr><tr><td>cera de parafina (líquida) light</td><td></td><td></td><td>SRL #18211</td></tr><tr><td>Pinzas de</td><td></td><td></td> rodillo <td>Polymed #14098</td></tr><tr><td>Tubos de</td><td></td><td></td> silicona <td>OD = 0,6 cm, ID = 0,3 cm; pinzas de rodillo para el control del caudal</td></tr><tr><td>Bomba</td><td></td><td></td><td>de vacío Hana #HN-648 (Cualquier bomba de acuario con dirección de flujo invertido manualmente)</td></tr><tr><td>Laberinto</td><td></td><td></td> en Y <td>Vidrio de borosilicato</td></tr><tr><td>Tubo de vidrio en forma de Y (vidrio de borosilicato)</td><td></td><td></td><td>Hecho a medida, mediciones en <fuerte>Figura 5A</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Elementos comunes:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cualquier software para la reproducción de video (por ejemplo, reproductor multimedia VLC)</td><td></td><td></td><td>https://www.videolan.org/vlc/</td></tr><tr><td>Ordenador para el análisis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de datos de vídeo Botellas para moscas</td><td></td><td></td><td>OD= 60 mm x Altura= 140 mm; vidrio/polipropileno</td></tr><tr><td>Viales para moscas</td><td></td><td></td><td>OD= 25 mm x Altura= 85 mm; Vidrio de borosilicato</td></tr><tr><td>Graph-pad Software</td><td></td><td></td><td>Prisma https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr> <tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Temporizador Cámara</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de video con grabación de video configurada Videocámara</td><td></td><td></td><td>o cámara de teléfono móvil funcionará</td></tr><tr><td>Para aspirador de moscas:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Algodón</td><td></td><td></td><td>Absorbente, autoclave</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>#P7793 Puntas</td><td></td><td></td> de pipeta <td>200 &micro; L o 1000 y micro; L, elija dependiendo del diámetro exterior del tubo de silicona Longitud del tubo</td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>silicona / caucho</td><td>= 30-50 cm. El tubo debe ser inodoro</td></tr><tr><td><fuerte>Composición de la comida para moscas:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ingredientes (cantidad para 1 L de comida)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar (8 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 19661 (CAS: 9002-18-0)</td></tr><tr><td>Harina de maíz (80 g)</td><td></td><td></td><td>D-glucosa orgánica, obtenida localmente</td></tr><tr><td>(20 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)</td></tr><tr><td>Ácido propiónico (4 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)</td></tr><tr><td>Sacarosa (40 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)</td></tr><tr><td>Tego (Metil para hidroxibenzoato) (1.25 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)</td></tr><tr><td>Levadura en polvo (10 g)</td><td></td><td></td><td>HIMEDIA # RM027</td></tr><tr><td>Líneas de mosca utilizadas en los experimentos de este estudio:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tipo salvaje (Cantón S o CS)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 64349</td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td></td><td>BDSC # 3605</td></tr><tr><td>w[1118]; Fmr1[&Delta; 50M]/TM6B, Tb[+]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 6930</td></tr><tr><td>w[*]; Fmr1[&Delta; 113M]/TM6B, Tb[1]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 67403</td></tr><tr><td>MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 50742</td></tr><tr><td>LN1-GAL4</td><td></td><td></td><td>NP1227, consorcio NP, Japan</td></tr><tr><td>row-shRNA</td><td></td><td></td><td>BDSC # 25971</td></tr></tbody></table>

paradigmas para la evaluación conductual en el modelo de drosophila del trastorno del espectro autista

Paradigms for Behavioral Assessment in Drosophila Model of Autism Spectrum Disorder

El Trastorno del Espectro Autista (TEA) abarca un grupo heterogéneo de trastornos del neurodesarrollo con síntomas conductuales comunes que incluyen déficits en la interacción social y la capacidad de comunicación, comportamientos restringidos o repetitivos mejorados y también, en algunos casos, discapacidad de aprendizaje y déficit motor. Drosophila ha servido como un organismo modelo sin precedentes para modelar un gran número de enfermedades humanas. Dado que muchos genes han sido implicados en el TEA, las moscas de la fruta han surgido como una forma poderosa y eficiente de probar los genes supuestamente involucrados con el trastorno. Dado que cientos de genes, con diversas funciones funcionales, están implicados en el TEA, no es factible un único modelo genético de mosca del TEA; en cambio, los mutantes genéticos individuales, las eliminaciones de genes o los estudios basados en la sobreexpresión de los homólogos de moscas de los genes asociados al TEA son los medios comunes para obtener información sobre las vías moleculares subyacentes a estos productos genéticos. Una gran cantidad de técnicas conductuales están disponibles en Drosophila que proporcionan una lectura fácil de los déficits en componentes conductuales específicos. Se ha demostrado que el ensayo del espacio social y los ensayos de agresión y cortejo en moscas son útiles para evaluar defectos en la interacción social o la comunicación. El comportamiento de acicalamiento de las moscas es una excelente lectura del comportamiento repetitivo. El ensayo de habituación se utiliza en moscas para estimar la capacidad de aprendizaje de la habituación, que se ha visto afectada en algunos pacientes con TEA. Se puede utilizar una combinación de estos paradigmas de comportamiento para hacer una evaluación exhaustiva del estado de la enfermedad humana similar al TEA en las moscas. Utilizando moscas mutantes Fmr1 , recapitulando el síndrome de X frágil en humanos, y el derribo de filas homólogas de POGZ en neuronas de mosca, hemos demostrado déficits cuantificables en el espaciamiento social, la agresión, el comportamiento de cortejo, el comportamiento de acicalamiento y la habituación. Estos paradigmas conductuales se demuestran aquí en sus formas más simples y directas, con la suposición de que facilitarían su uso generalizado para la investigación sobre el TEA y otros trastornos del neurodesarrollo en modelos de mosca.

Ensayo de agresión Como modelo de mosca ASD se han utilizado moscas mutantes Fmr1 63,64. w1118 machos se utilizaron como control y Fmr1 transheterocigoto Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 moscas macho como moscas experimentales; Los machos adultos fueron alojados en tubos de aislamiento durante 5 días. Se introdujeron machos homotípicos (mismo genotipo, mismas condiciones de alojamiento) en la arena de agresión y se registró su comportamiento durante 20 min. Se contó el número total de episodios agresivos en 20 min para cada genotipo. Se encontró que el número de episodios agresivos durante 20 min fue significativamente menor en el caso de los machos mutantes que en los machos control (Figura 1E). Esta reducción de la agresividad en las moscas Fmr1 podría deberse a un menor interés en la interacción social con otra mosca. Por el contrario, las moscas macho mutantes Fmr1 alojadas en grupos/socialmente muestran recuentos de episodios de agresión comparables a los de las moscas w1118 alojadas socialmente (datos no mostrados), lo que probablemente indica un papel positivo del entorno social en la inducción del comportamiento social.
Ensayo de espacio social El ensayo de espacio social se realizó en moscas w1118 y modelo ASD (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M ). Se calculó la distancia al vecino más cercano para cada mosca y se realizaron 10 réplicas biológicas para cada genotipo. Las moscas mutantes muestran distancias significativamente más altas entre los vecinos más cercanos que las contrapartes de control (Figura 2D), lo que indica una preferencia por un mayor distanciamiento de otras moscas.
Ensayo de cortejo Se realizó el ensayo de cortejo de moscas macho de un solo hogar para cuantificar el comportamiento de cortejo innato de dos moscas modelo de TEA separadas. En primer lugar, se comparó el comportamiento de cortejo de las moscas transheterocigóticas Fmr1 con el de w1118; Las moscas Fmr1 mostraron un índice de cortejo significativamente más bajo, así como un menor número de intentos de cópula (Figura 3E1). En un segundo experimento, un ortólogo de Drosophila del gen POGZ humano (un gen de riesgo de TEA20 altamente prevalente), fue derribado mediante la expresión de un microARN de horquilla corta contra fila en neuronas del cuerpo de hongo utilizando la línea controladora MB247-GAL4. Estas moscas modelo de TEA fueron probadas para detectar cualquier defecto en el patrón de cortejo innato; El índice de cortejo y el número de intentos de cópula se calcularon a partir de videos de 15 minutos. Las moscas de derribo mostraron un índice de cortejo significativamente reducido, así como recuentos de intentos de cópula (Figura 3E2), lo que indica su comunicación defectuosa hacia las hembras.
Comportamiento de acicalamiento El comportamiento de acicalamiento se utiliza como lectura del comportamiento repetitivo en Drosophila 16,42,43. El comportamiento de acicalamiento se cuantificó en moscas transheterocigotas Fmr1 y se comparó con el de w1118. La latencia hasta el primer acicalamiento disminuye significativamente en las moscas Fmr1, mientras que la duración media del acicalamiento y el índice de acicalamiento aumentan significativamente en las moscas Fmr1 (Figura 4C), lo que indica un mejor comportamiento de acicalamiento (o repetitivo) en las moscas modelo TEA. Por el contrario, no se encontró que el número total de episodios de acicalamiento en las moscas mutantes se alterara significativamente en comparación con el de las moscas de control.
Ensayo de habituación olfativa Se ha encontrado que la habituación es defectuosa en un gran número de individuos autistas y se puede utilizar como un ensayo para lo mismo en Drosophila23. Aquí, la habituación olfativa se probó en el modelo ASD mediante el derribo de la fila en interneuronas locales olfativas impulsadas por LN1-GAL4. Un odorante aversivo, butirato de etilo al 20%, se ha utilizado en estos experimentos para inducir la habituación en estas moscas. Los resultados muestran que las moscas de derribo no se habituaron después de una exposición de 3 días al odorante (las dos últimas barras del gráfico de la Figura 5E no muestran una diferencia significativa entre las moscas ingenuas y las habituadas) en comparación con las moscas de tipo salvaje, moscas que muestran una habituación típica después de la exposición al butirato de etilo durante 3 días (las moscas expuestas muestran una caída significativa en el índice de rendimiento en comparación con las moscas ingenuas). Esto indica que las moscas no se habitúan después de la exposición al butirato de etilo durante 3 días y son repelidas por el olor repulsivo, lo que demuestra que estas moscas ASD tienen una deficiencia de habituación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig01.jpg"> Figura 1: Arena de agresión y patrones de comportamiento representativos. (A) La configuración de la arena de agresión en una placa de 24 pocillos con una tapa perforada para la entrada de moscas. Recuadro: Dimensiones de una sola arena con comida para moscas. (B) Fotografía de un tubo de alojamiento único que contiene una sola mosca macho aislada y un frasco de alojamiento grupal que contiene moscas macho y hembra, recapitulando un entorno social. (C) Un aspirador para la transferencia de moscas basada en la aspiración bucal. Elementos necesarios para el montaje de un aspirador de moscas que indica los lados del tubo para la entrada de moscas (extremo de mosca) y el lado que se insertaría en la boca (extremo de la boca) (C1) y un aspirador de moscas ensamblado (C2). (D) Patrones representativos de comportamiento agresivo entre hombres: acercamiento, amenaza de alas, esgrima, agarre, embestidas, boxeo y peleas. (E) Las moscas macho mutantes Fmr1 muestran un comportamiento agresivo reducido hacia otros machos en comparación con los controles. Diagrama de caja que muestra el número de episodios agresivos para machos socialmente aislados de w1118 (control) frente a moscas transheterocigóticas Fmr1 (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig02.jpg"> Figura 2: Configuración de la arena de ensayo del espacio social. (A) Diagrama que muestra las dimensiones y la disposición de los paneles de vidrio y los espaciadores acrílicos. (B) La disposición final de los componentes de la arena donde los espaciadores acrílicos se intercalan entre las piezas de vidrio, dejando un pequeño espacio para la entrada de moscas en la parte inferior. El espacio triangular creado entre las piezas de vidrio y los espaciadores es la arena SSA para las moscas, aquí las moscas solo pueden moverse en dos dimensiones. (C) Fotografía de la configuración final de la arena de la SSA con moscas dentro de la cámara. Abreviatura: SSA = matriz de espacio social. (D) Las moscas modelo ASD (Fmr1 transheterocigóticas) muestran un mayor distanciamiento entre sí en el ensayo de espacio social en comparación con w1118. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig03v2.jpg"> Figura 3: Ámbito de cortejo y patrones de comportamiento representativos. Diagramas que muestran (A) el diseño y (B) la disposición de los discos en una arena de ensayo de cortejo. (C) Foto de la arena de cortejo después del arreglo final. (D) Imágenes representativas que muestran los patrones de comportamiento de cortejo de un macho ingenuo hacia una hembra apareada: persecución, orientación, parpadeo de las alas, lamido, intento de cópula y cópula. (E) Gráficos que muestran el índice de cortejo y el número de intentos de cópula en dos modelos de TEA: (E1) Moscas mutantes Fmr1 que muestran una reducción significativa en el índice de cortejo y el intento de cópula en comparación con el control w1118 . (E2) se utilizaron moscas knockdown row como otro modelo de TEA donde se expresó row-shRNA enneuronas cuerpo y de hongo (MB247-GAL4); Se observó una reducción significativa en el comportamiento de cortejo al derribar la fila. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig03largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig04.jpg"> Figura 4: Configuración de la arena y patrones de comportamiento representativos del comportamiento de acicalamiento. (A) La arena en forma de disco o rueda (la misma arena de cortejo que se muestra en la Figura 3) se configura en un panel LED con un difusor para una iluminación uniforme desde la parte inferior y el video se capturó desde la parte superior. Esto asegura un mayor contraste requerido para identificar el movimiento fino de los apéndices durante el cepillado. (B) Fotografías de los patrones de comportamiento de acicalamiento observados en moscas macho adultas. T1 =1er par de patas, T2 = 2par de patas, T3 = tercer par de patas. Se utiliza una nomenclatura abreviada intuitiva para los patrones de aseo en B: T1-cabeza = cabeza frotada con las primeras patas; T1-T1 = primer par de patas frotadas entre sí, y así sucesivamente. Abreviatura: LED = diodo emisor de luz. (C) Gráficos que muestran los resultados de los ensayos de acicalamiento realizados en moscas transheterocigóticas Fmr1 y comparados con w1118. Las moscas mutantes Fmr1 mostraron una latencia significativamente reducida para el primer episodio de acicalamiento, lo que indica el inicio temprano del acicalamiento en comparación con el control. Además, la duración media del episodio de acicalamiento y el índice de acicalamiento aumentaron significativamente en los mutantes Fmr1 , lo que indica un mayor comportamiento repetitivo en las moscas modelo de TEA. Por el contrario, el número total de episodios de acicalamiento no se alteró significativamente en las moscas mutantes en comparación con el control. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig05.jpg"> Figura 5: Inducción y configuración del ensayo para la habituación olfativa y resultado representativo después del ensayo. (A) Componentes de la configuración del ensayo de elección de olor binario: (A1) el laberinto en Y, (A2) el adaptador, (A3) la disposición de estos dos, (A4) un par de tubos de recolección para sujetar en la parte superior de los brazos del laberinto en Y, (A5) la botella de vidrio y los tubos de vidrio para mantener la solución odorante o el agua a través de la cual el aire burbujeará antes de pasar al laberinto en Y. (B) Configuración de la botella de comida para moscas para la inducción de la habituación olfativa; el diagrama de dibujos animados (B1) muestra cómo el tubo de microfuga que contiene odorante se cuelga de un alambre de cobre a mitad de camino dentro de la botella; (B2) finalmente, la abertura de la botella está cubierta por algodón y sellada por sobres de papel marrón. (C) Foto de la disposición total de la configuración del laberinto en Y. (D) Fotografías que muestren la distribución de moscas en las cámaras de recolección después del final de un experimento. (D1) Las moscas ingenuas (expuestas solo a parafina inodora, control) muestran repulsión hacia el odorante aversivo (20% de butirato de etilo utilizado para la inducción de la habituación en este estudio) y eligen en el brazo del laberinto en Y lleno de aire regular, mientras que las moscas expuestas (D2) (habituadas) se distribuyen uniformemente en ambos brazos. Abreviatura: ID = diámetro interno. (E) Los resultados del ensayo de habituación olfativa de las moscas mostraron un defecto de habituación. Las moscas de tipo silvestre (Cantón S), después de 3 días de exposición al butirato de etilo, mostraron una reducción significativa en el índice de rendimiento en comparación con las moscas naif, lo que indica habituación. Cuando las progenies de las moscas LN1-GAL4 x row-shRNA se expusieron durante 3 días, no se encontró que el índice de rendimiento fuera significativamente diferente al de las moscas naif; esto demuestra que estas moscas no se habituaron después de una exposición de 3 días al odorante, recapitulando un síntoma similar al TEA humano. Abreviaturas: TEA = trastorno del espectro autista; shRNA = ARN de horquilla corta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El Trastorno del Espectro Autista (TEA) se asocia con un deterioro del comportamiento social y comunicativo y la aparición de comportamientos repetitivos. Para estudiar la interrelación entre los genes del TEA y los déficits conductuales en el modelo de Drosophila , en este artículo se describen cinco paradigmas conductuales para analizar el espaciamiento social, la agresión, el cortejo, el acicalamiento y el comportamiento de habituación.

Paradigmas para la evaluación conductual en el modelo de Drosophila del trastorno del espectro autista

Autism Spectrum Disorder (ASD) encompasses a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders with common behavioral symptoms including deficits in ...

El trastorno del espectro autista afecta a los niños, lo que provoca un deterioro de la comunicación, el comportamiento social y un mayor comportamiento repetitivo. Drosophila es un modelo cada vez más popular para la investigación del autismo con el fin de descifrar las vías moleculares subyacentes. Describimos un conjunto de técnicas estándar para la caracterización conductual de modelos de autismo con moscas.Para decodificar los fundamentos moleculares del trastorno del espectro autista en moscas, se deben establecer con precisión sus manifestaciones conductuales. Cuantificar los rasgos de comportamiento humano del autismo en Drosophila melanogaster es una tarea bastante desafiante. No existe un único paradigma conductual en las moscas que aborde todas las anomalías conductuales de este trastorno.Hemos descrito un conjunto de cinco paradigmas de comportamiento bien establecidos en Drosophila, a saber, ensayo de agresión, ensayo de espacio social, forma del pelaje, aseo y ensayo de habituación. Todos estos se pueden utilizar en modelos de mosca TEA para caracterizar y cuantificar el nivel de deficiencias en el comportamiento comunicativo, el comportamiento repetitivo y el comportamiento social. Describimos estas cinco técnicas en su forma más simple para que todos los laboratorios con un mínimo de instalaciones de investigación con moscas puedan adoptarlas con facilidad y realizar experimentos con un modelo de mosca del trastorno del espectro autista, y contribuir al avance de nuestra comprensión de esta enfermedad.

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Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la evitación de individuos estresados. Este paradigma es potente y fácil de usar y puede utilizarse para evaluar la influencia de los genes y el medio ambiente en un tipo de interacción social en Drosophila melanogaster.

Ensayo sencillo para cuantificación de Prevención Social en Drosophila melanogaster

Los comportamientos restringidos y repetitivos de orden superior (RRB) perturban la vida de las personas afectadas.  Estos comportamientos son difíciles de modelar en roedores, lo que dificulta la investigación biomédica básica sobre posibles tratamientos o intervenciones para los RRB.  Aquí describimos la exploración de nuevos objetos como un ensayo potencial para RRB de orden superior en ratones.

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Los modelos de roedores son herramientas valiosas para estudiar los comportamientos básicos relacionados con el trastorno del espectro autista (TEA). En este artículo, exponemos dos pruebas de comportamiento para modelar las características principales del TEA en ratones: el autoacicalamiento, que evalúa el comportamiento repetitivo, y la prueba de interacción social de tres cámaras, que documenta las deficiencias sociales.

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El procedimiento descrito en este protocolo muestra que la administración de testosterona y las creencias populares acerca de la testosterona puede estar asociada con opone directamente a las conductas sociales.

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Como la destreza manual es una prerrogativa de los primates, principalmente, tareas conductuales se han desarrollado en los monos macacos. Cuatro alcanzar y agarrar las tareas de comprensión, que mide la capacidad de manipulación de la mano y la fuerza, permiten establecer la recuperación funcional después de una lesión del sistema nervioso central y para evaluar el efecto de un tratamiento.

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Responder a las señales de alimentos o medicamentos por pares aumenta a lo largo de un período de abstinencia y esto puede relacionarse con una mayor susceptibilidad a las conductas recaída. Aquí detallamos un procedimiento para la evaluación de esta "incubación del deseo" en las ratas que se han auto-administrado sacarosa.

Un método general para la evaluación de incubación de sacarosa en ratas Deseo

Los ritmos circadianos en voluntaria rueda de funcionamiento en mamíferos están fuertemente acoplados a las oscilaciones moleculares de un reloj maestro en el cerebro. Como tales, estos ritmos diarios en el comportamiento puede ser usado para estudiar la influencia de los factores genéticos, farmacológicos, y ambiental sobre el funcionamiento de este reloj circadiano.

Registro y análisis de los ritmos circadianos en funcionamiento las ruedas Actividad en roedores

Este protocolo describe una forma sencilla y rentable de identificar individualmente Drosophila u otros insectos. Los datos de demostración que investigan el éxito del apareamiento en tres especies de Drosophila muestran que este método es comparable o mejor que el uso de anestesia con CO2.

Teñido Insectos de la Conducta ensayos: el comportamiento de apareamiento de anestesiada<em&gt; Drosophila</em

Con el fin de identificar nuevas mutaciones que afectan a la mecanosensación, diseñamos un ensayo que mide la respuesta conductual a la estimulación táctil de las cerdas de mosca en clones mutantes generados por el método MARCM. La combinación de técnicas permite la identificación de mutaciones mecanosensibles que, de otro modo, serían letales.

Un ensayo de conducta para Mechanosensation de clones en MARCM-basa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aprende a evaluar cinco paradigmas conductuales en Drosophila para investigar el trastorno del espectro autista, incluyendo agresión, espaciado social, cortejo, acicalamiento y habituación. Estos métodos permiten cuantificar déficits conductuales relacionados con genes de TEA.

Paradigmas para la evaluación conductual en el modelo de Drosophila del trastorno del espectro autista

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